Summary
Intracellulær Ca
Abstract
Sædceller er mannlige kjønnsceller er spesielt konstruert for å nå, gjenkjenne og fusjonere med egg. For å utføre disse oppgavene, må sædcellene være forberedt på å møte et stadig skiftende miljø og overvinne flere fysiske barrierer. Å være i hovedsak transcriptionally og translationally stille, disse bevegelige celler stole fullt og helt om ulike signalering mekanismer å orientere seg og svømme i en rettet måte, og å stri med utfordrende miljøforhold under sin reise for å finne egget. Spesielt er Ca 2 +-mediert signalisering sentral for flere sperm funksjoner: aktivering av motilitet, capacitation (en kompleks prosess som forbereder spermier for den acrosome reaksjon) og den acrosome reaksjon (exocytotic en hendelse som gjør at sæd-egg fusjon). Bruken av fluorescerende fargestoffer for å spore intracellulære svingninger av denne ion er av bemerkelsesverdig betydning på grunn av sin enkle programmet, følsomhet og allsidighet i Detection. Ved hjelp av en enkelt dye-lasting protokollen vi bruker fire forskjellige fluorometriske teknikker for å overvåke sperm Ca 2 + dynamikk. Hver teknikk gir tydelig informasjon som gjør romlige og / eller tidsmessig oppløsning, generering av data både på enkelt celle og celle bestandsnivå.
Introduction
Ca 2 + er en universell andre budbringer signaltransduksjonsveiene i eukaryote celler. Intracellulær Ca2 + (Ca 2 + i) deltar i reguleringen av mange grunnleggende fysiologiske prosesser i både eksiterbare og ikke-eksiterbare celler,. Betydningen og allmenn bruk av Ca 2 + som andre messenger under signalformidling hendelser er avledet fra sin spatio-temporal allsidighet i overføring av informasjon i cellen. Mens Ca 2 + ikke kan syntetiseres de novo eller nedbrytes inne i cellen, dets intracellulære konsentrasjon ([Ca2 +] i) holdes innenfor svært strenge grenser gjennom ulike cellulære mekanismer som kontinuerlig buffer, binder, compartmentalize, og / eller akkumuleres Ca2 +. Forandringer i konsentrasjonen av dette ion kan oppstå i sterkt lokaliserte områder inne i cellen 1, og tolke slike svingninger er vesentlig for å oppnå en deEPER forståelse av (1) deres rolle i signalisering mekanisme, (2) deres fysiologisk betydning, og (3) de generelle mekanismer for celle-signalering. Ca 2 +-mediert signalisering er av særlig betydning i sperm fysiologi to. Spermiemotilitet er en av de viktigste funksjonene for befruktning suksess, og i virkeligheten kan flere sperm motilitet feil føre til sterilitet 3-5. Betydningen av Ca 2 + i flagellar bevegelsen har vært lenge anerkjent 6, men er mekanismen for hvordan Ca 2 + styrer den spesifikke form av flagellar bøyning ikke fullt ut forstått.
Før den festes med egg, må sædceller gjennomgå capacitation, en kompleks prosess avhengig av sperm bolig i den kvinnelige skrift. Under capacitation, er sæden membranen lipid arkitektur og organisasjonen endres, hovedsakelig som følge av kolesterol fjernet fra plasma membran. I tillegg viste flere proteiner er tyrosin-fosforylated 7. Viktigere, under capacitation det er en økning i intracellulær pH (pH i) og i [Ca 2 +] i, og membranpotensialet hyperpolarizes i enkelte arter to. Capacitation finner bare sted i en subpopulasjon av spermatozoer (20-40%), og mekanismene som er involvert i alle disse cellulære endringer er langt fra klart. Det er generelt akseptert at bare en subpopulasjon capacitated sperm gjennomgå acrosome reaksjon (AR) når de utsettes for fysiologiske induktorer. AR er også en Ca 2 +-regulert arrangement som kreves for befruktning i alle arter som innehar en acrosome (spesialiserte organeller med ytre og indre membraner). I løpet av denne prosessen de ytre acrosomal membran sikringer med sperm plasma membran, slippe hydrolytic enzymer som gjør at sædcelle å trenge inn i glyco-proteinaceous matrise rundt egget (zona pellucida, eller ZP). AR avslører også en ny fusogenic sædcelle overflate som samhandler medegget plasma membran for endelig fusjon av begge kjønnsceller. Det finnes flere mobilnettet ligander som induserer AR, progesteron være en av de mest studerte blant dem.
I dette arbeidet presenterer vi fire forskjellige teknikker som involverer bruk av en Ca2 +-sensitive fluorescerende fargestoff til å måle [Ca2 +] i forandringer i human sperm utløst av progesteron (med unntak av strømningscytometri, der vi målt [Ca 2 + ] jeg øker indusert under in vitro capacitation prosess). I dette spesielle tilfellet har vi brukt Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), en membran som slipper gjennom fargestoff med en K D = 325 nM. In vitro overvåket vi fluorescens endres som en funksjon av tid med tre av de metodologier og med den fjerde teknikken målte vi fluorescens-verdier ved en enkelt gitt tidspunkt. Disse ulike tilnærminger utfyller hverandre, siden de til sammen gir romlige og tidsmessige resolution på både enkelt celle og celle bestandsnivå.
Cell Befolkning eller Bulk Experiments
Bulk teknikker er mye brukt ikke bare fordi instrumentene de trenger er lett tilgjengelig, men også fordi de er enkle, godt etablert, og la for gjennomsnitt av informasjon fra målinger utført på millioner av celler i et enkelt eksperiment.
Technique # 1. Konvensjonell fluorometri
Denne teknikken overvåker endringer i fluorescens som en funksjon av tid; forsøkene er utført i glass kyvetter med prøvemengder på mellom 200 til 1000 mL. Riktig blanding av tilsatte reagenser krever magnetisk omrøring, og derfor den tidsmessig oppløsning er erholdt i størrelsesorden sekunder. Den typiske celle konsentrasjonsområde av de analyserte prøvene er 10 5 -10 8 celler / ml.
Technique # 2. Stoppet Flow fluorometri
Tsin teknikk overvåker også endringer i fluorescens som en funksjon av tid, men reagensene blandes raskt sammen (ved hjelp av trykk) inn i et opptak kuvette som inneholder en meget liten prøvevolum (strekker 25-100 ul). Derfor er homogenisering av reagenser momentant, slik at en høy tidsmessig oppløsning i størrelsesorden millisekunder. Analyse av de resulterende fluorescens mot tid spor er egnet for å bestemme reaksjons-hastigheter, tydeliggjøring kompleksiteten av reaksjonsmekanismen, innhenting av informasjon om kortlivede mellomprodukter reaksjonsbetingelser, etc. Den vanlige celle konsentrasjonsområde av de analyserte prøvene er 10 5 -10 7 celler / ml.
Enkelt celle Experiments
Bulk eksperimenter rapporterer den gjennomsnittlige oppførselen til et stort antall celler, men kan ofte utvise en populasjon heterogene egenskaper som er oversett under en slik type målinger. Encellete teknikker er dermed brukes til å utfylle the informasjon innhentet med cellepopulasjonen eksperimenter.
Technique # 3. Flowcytometrisystemer
På tross av betydningen av den informasjon som oppstår fra enkelt-celle-målinger, er det viktig å analysere et stort antall celler for å hindre feilaktige ekstrapolering av celle-spesifikke egenskaper til hele populasjonen. Av denne grunn er high-throughput teknikker foretrekkes, og de mest populære metoden er flowcytometri, hvori 10 000 celler pr tilstand blir vanligvis analysert. Denne metoden gjør det mulig for multi-parametrisk analyse av heterogene populasjoner som det kategoriserer celler i henhold til deres størrelse (forward scatter (FSC)), detaljnivå (side scatter (SSC)) og fluorescens intensitet (spesifikk merking med et antistoff, levedyktighet markør, etc.) , og dermed gi informasjon om parametre 'fordeling for en gruppe av celler. Flowcytometri gir umiddelbar snarere enn tidsavhengig informasjon åtte. Forward og side scatter verdier are også nyttig for å velge en gate som inneholder celler, men diskriminerer mobilnettet rusk, støv, etc. For fluorescens målinger, negative og positive fluorescens kontroller må også inkluderes. Hvis mer enn én fluorescens kanalen brukes, må en prosess som kalles kompensasjon utføres (for detaljer se http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Kompensasjon åpner for spektral overlapping diskriminering blant fluorophores. Strømningscytometri tillater også diskriminering av døde celler, vanligvis ved hjelp av propidium jodid farging.
Technique # 4. Enkelt Cell Imaging
Mikroskopi er en annen vanlig metode for å studere enkelt celle atferd, det er godt egnet for tidsavhengige studier og det gir også romlig oppløsning. En stor ulempe er at high-throughput analyser er bare i sin spede begynnelse på det nåværende tidspunkt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne artikkelen rapporterer vi bruken av de fire nevnte teknikker for å måle [Ca 2 +] i endringer i menneskelige sædceller. Vi brukte progesteron for å utløse en Ca 2 + svar, som det er godt etablert at denne steroid produserer en forbigående [Ca 2 +] i økning i sædceller. Spesielt i menneskelig sperm, aktiverer progesteron direkte en Ca 2 +-kanal (nemlig CatSper) uttrykt utelukkende i plasma membran av sædceller 10,11. Vi har også målt hvile [Ca 2 +] i før og etter capacitation gitt at det er også allment akseptert at en økning i [Ca 2 +] i oppstår under capacitation. For teknikker som krever en positiv kontroll benyttet vi en Ca 2 +-ionofor-ionomycin-å indusere maksimal Ca 2 +-opptak inn i cellen, og dermed maksimal fluorescens respons, for den minimale fluorescens-verdi, brukte vi Mn 2 + for å slukke fluorescensen.
En. Sperm Sample Preparation av Swim-up Method (Se figur 1)
Bruk bare utbrøt prøver (oppnådd ved onani) hvis egenskaper oppfylle fastlagt av siste utgave av World Health Organization laboratorium manuell (tilgjengelig på http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547789_eng.pdf ) til eksamen og prosessering av menneskelig sæd.
- Skaff sædprøve inne i en steril beholder og plassere det (med løsnet cap) inne i en inkubator ved 37 ° C og CO 2 5% / luft 95% i løpet av 30 min. Dette trinnet er for eksempel LNG.
- Plasser 500 mL alikvoter av flytende semen prøven på bunnen av rene glass-reagensrør (1,0 x 7,5 cm). Omtrent åtte prøverør er nødvendig for en gjennomsnittlig størrelse prøve (4 ml).
- Nøye lag 1 ml Ham F-10 medium (su. pplemented med 2 mM CaCl 2 og 5 mg / ml bovint serum-albumin for å fremme capacitation in vitro) på toppen av hver semen alikvot (Se figur 1) TIPS: berøre veggen av røret med tuppen av mikropipette, og forsiktig dispense mediet over prøven. Det er viktig å gjøre det sakte som en blanding av begge lag (prøve og medium) må unngås.
- Nøye helle rørene til en 30 ° vinkel ca. Dette vil øke arealet mellom de to væsker, og dermed forsterke den forskyvning (bade-up) av humane celler fra prøven til mediet i løpet av inkuberingen.
- Plasser gruppe lente reagensglass inne i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2/95% luft i 1 time.
- Ved hjelp av en mikropipette forsiktig fjerne den øvre 700 ul av HAM F-10 medium (nå inneholder bevegelige sædceller) fra hvert rør og basseng alle de innsamlede prøvene til en enkelt ren glassrør (1,0 x 7,5 cm, til større volumer bruker en 15 mlFalcon tube), unngå bobledannelse. Place 10 pl samleprøve på optisk flat glass en Makler Tellekammer base, og deretter plassere dekselet glass (når lokket er på plass, unngå å løfte eller dekke igjen for å opprettholde jevn spredning av sperm prøven). Sørg for å unngå bobledannelse inne i kammeret som dette vil resultere i en unøyaktig celletall.
- Observer under et sammensatt mikroskop (ved bruk av et 20X objektiv er anbefalt). Dekselet glass Makler Counting Chamber har en stor firkant bestående av 100 mindre firkanter (dvs. et 10 x 10 rutenett). Telle celler i noen stripe av 10 ruter. Dette tallet representerer deres konsentrasjon i millioner av celler / ml. Gjenta telle i ytterligere to 10-kvadrat strimler, og beregne gjennomsnittet av de tre teller. MERK: Hvis en Makler Counting kammer (som er spesielt designet for å telle sædceller) ikke er tilgjengelig, kan enhver hemocytometer kammer brukes.
- Juster prøvens final konsentrasjonen til 7 1x10 celler / ml i supplert Hams F-10 medium. Når det er nødvendig, inkubere prøven ved 37 ° C og 5% CO 2/95% luft i 5 t. for å fremme capacitation.
2. Fluorescerende fargestoff Laster for Ca 2 + Målinger
Det er flere fluorescerende fargestoffer tilgjengelig for å måle intracellulær Ca 2 +; det riktige må velges i henhold til sin K d, og dets utslipp og eksitasjon bølgelengder (for kvalitative og kvantitative målinger, enkle og doble utslipp og eksitasjonsbølgelengdene, henholdsvis, må være brukt) mer informasjon). For dagens kvalitative programmet brukte vi Fluo-3 AM, en celle-permeant fargestoff med en K d = 325 nm og eksitasjon enkel emisjon og bølgelengder på 506/526 nm, henholdsvis 12..
- Forbered 50 pl av en 1 mM Fluo-3 AM stamoppløsning ved oppløsning av innholdet av en ampulle 50 ug fargestoff (MW = 1130 g / mol) i 44 mL vannfri DMSO.
- Ved hjelp av et 1,5 ml mikro-sentrifugerør blande det nødvendige volum av sæd suspensjon (se nødvendige mengden for hver spesiell teknikk nedenfor) med nok en mM Fluo-3 AM stamløsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2 uM Fluo-3 AM (dvs. 1 pl av lager Fluo-3 AM er lagt for hver 500 mL av sperm suspensjon).
- Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og beskyttet mot lys.
- Sentrifuger røret ved 750 xg i 5 min ved hjelp av en mikrosentrifuge, aspirer og kast supernatanten og resuspender pelleten i riktig volum (se nødvendige konsentrasjonen for hver spesiell teknikk nedenfor) of Human Sperm Medium (HSM; mM: 120 NaCl, 15 NaHCO3 2 CaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 Na laktat, 5 D-glukose, en pyruvat Na, pH = 7,4) NB: Dannelse av en sky snarere enn en pellet indikerer at cellene er i god stand.
- Cellene er nå lastet med fargestoff, de forblir levedyktig (holdt ved 37 ° C og beskyttet mot lys) i omtrent to timer, og kan anvendes i en hvilken som helst av de følgende teknikker.
3. Technique # 1. Konvensjonell fluorometri (Gjennomsnittlig informasjon fra et stort Cell Befolkning)
Utstyr: For vår sperm befolkningen [Ca 2 +] i målingene vi bruker en SLM Aminco spektrofluorometer drives av Olis programvare (Bogart, GA, USA) med magnetrører kontroll (SIM Aminco), og koblet til en blå LED (Luxeon stjerne LXHL- LB3C, fra LUMILEDS) og en 465-505 nm band-pass filter (Chroma Technology Corp) for Fluo-3 AM eksitasjon. LED er kontrollert av en spesialbygd strømforsyning (700 mA). Utslipp lys måles ved å sette emisjonsbølgelengde (λ Em) til 525 nm på spektrofluorometer er monochromator.
- Place 570 ul av HSM og 30 ul sædcelle suspensjon (tidligere lastet med Fluo-3 AM og resuspendert i HSM å skaffe 1x10 8 celler / ml) i en flat bunn glassrør (ID 8 x 50 mm). Plasser en magnetisk rørestav inne i røret, og sette inn røret i lesing kammer av spektrofluorometer (forvarmet til 37 ° C), røre prøven under alle akkvisisjonstiden.
- Starte forsøket bruker utstyret programvare (Olis programvare i dette tilfellet), og fortsett å skaffe fluorescens verdier på en frekvens på 0,5 Hz under 300 sek. Påføres den ønskede testforbindelser ved injeksjon av det passende volumet fra en stamløsning (vanligvis 100X mer konsentrert enn den ønskede sluttkonsentrasjon) ved hjelp av en Hamilton mikro-sprøyte som følger:
- Erverve basal fluorescens i 30 sek.
- Ved 100 sek tilsett 20 uM ionomycin (som en positiv kontroll, for å oppnå maksimal fluorescens verdi).
- Kjør en negativ kontroll ved å gjenta trinn 3.1 til 3.2.3 ovenfor, men å legge stedet for Pg bare det anvendte løsningsmiddel for å oppløse den (HSM med 0,01% vannfritt DMSO).
- Eksporterer rå fluorescens intensitet verdier til Microsoft Excel og normalisere dem ved hjelp av følgende ligning: (F/F0) - 1. Hvor f er den målte fluorescensintensiteten til enhver tid (t), og F0 er den midlere fluorescens basal tatt under den første 30 sek. Plott den totale serie (F/F0) - 1 verdier vs tid (Figur 2A). Måle forskjellen mellom fluorescensintensiteten verdier før og etter tilsetningen av testforbindelsene (Af), plotte dem på et søylediagram og behandle dataene anvendelse av egnede statistiske analysemetoder (figur 2B).
4. Technique # 2. Stoppet Flow fluorometri (informasjon med høy tidsmessig oppløsning fra en stor celle populasjon)
Utstyr: Intracellulære [Ca 2 +] endringene er målt med høy temporal oppløsning ved hjelp av en SFM-20 stoppet-flow mikser koblet til en MOS-200 rask kinetikk optisk system, både fra biologisk vitenskap instrumenter (Grenoble, Frankrike). Alle data er analysert med Bio-Kine32 programvare fra samme selskap.
- Sett de aktuelle forholdene i utstyr, belysning kilde skal være slått på minst 15 min før du starter forsøket, justere eksitasjon og emisjon filtre, justere photomultiplier til en spenning verdi innenfor området etablert av stoppet-flow produsent, og angi temperaturen i badet ved 37 ° C.
- Fyll den ene instrumentets sprøyter med 1 ml Fluo-3-AM-lastet spermier (1x10 7 celler / ml), og den andre sprøyte med 1 ml av den forbindelse som skulle testes, enten HSM (negativ kontroll),10 mikrometer ionomycin (positiv kontroll) eller 10 mikrometer Pg oppløst i HSM. Merk: I dette trinnet er det avgjørende å unngå bobledannelse mens tegning væsken inn i sprøyter.
- Løft begge instrument stempler til de berører tuppen av sprøyten stempler.
- Innstill infusjonshastigheten til minimumsverdien som vil gi en målbar respons for å minimalisere celleskader. Strømningshastigheten vi bruker i SFM-20-systemet er en ml / sek 13.
- Innstill frekvensen (i dette tilfellet 10 msek) og det totale samplingstid (i dette tilfelle 50 sek).
- Utløs blanding av reagenser. MERK: Mens en enkelt avtrekker om gangen kan foretas manuelt, kan et sett av automatiske påfølgende triggere være forprogrammert i tillegg.
- Spor av rå fluorescens (vilkårlige enheter) vs tid vises på dataskjermen.
- Den blanding av reagenser i seg selv vil generere et spor som ikke er en rett linje. Således, for å oppnå den faktiske [Ca2 +] forandring avledet fra en stimulans, må kontrollenheten spor oppnådd fra blandecellene med medium (negativ kontroll) trekkes fra hver og en av de eksperimentelle kurver. Analysere data som kreves, noen kinetikk parametere kan også fås med Bio-Kine32 oppkjøpet programvare. Rå spor uten subtraksjon er vist i Supplementary Figur 1 for sammenligning.
- For å endre reagens ved testforbindelsen sprøyte, rense den ut grundig med destillert vann. Så fyll sprøyten til sin maksimale volumet med destillert vann, legg den i tilsvarende stempel av stoppet-flow fluorometer og presse vannet gjennom den interne mekanismen (skyllevann må rettes til avfallsbeholderen). Gjenta dette trinnet to ganger mer.
- Gjenta trinn 4.2 til 4.9, å fylle den andre sprøyte med det neste ønskede testforbindelsen.
- Ved slutten av forsøket, skylle hele utstyret med destillert vann, fullstendig drenering av vann frainterne slanger.
5. Technique # 3. Flowcytometrisystemer (enkelt celle informasjon hentet fra et stort antall celler)
Utstyr: Denne teknikken gjør det samtidig måling av flere parametre i et eneste øyeblikk i tid, men i motsetning til de tidligere teknikker, betyr det ikke måle endringer over tid, snarere det gir parameterverdiene på måletidspunktet. Derfor, i stedet for å legge Pg å utløse reaksjon, i dette tilfelle målt vi intracellulær Ca2 +-nivåer i sperm-celler før og etter fremkallelse av capacitation. Vi brukte en FACSCanto cytometer (Becton Dickinson) og data ble analysert med FlowJo programvare (Tre-stjerners 9.3.3).
- Fremstille de eksperimentelle prøver i flowcytometer-rør ved å plassere 500 pl cellesuspensjon (4x10 6 celler / ml) per rør under hver betingelse som skal testes (i dette tilfelle, ti tilstander, se tabell 1). Samle fluorescens data from 10 000 hendelser per prøve.
- Å sette opp et eksperiment bruke utstyret programvare til:
- Opprett en ny: mappe, eksperimentere, prøve og antall rør.
- Velg riktige flowcytometer innstillinger for Fluo-3 AM (bruk FITC-Fluorescein isothiocyanate-filter) og PI (bruk PI-Propidium Jodid-filter).
- Kjør unstained kontrollrørene 1 og 2 i cytometeret. Samle FSC og SSC data for å bekrefte at terskelen innstillinger er riktige, og for å opprette tilsvarende gate for å diskriminere rusk fra celler.
- For å opprette kompensasjon kontroller, kjøre følgende kontrollprøver, samle auto og maksimal fluorescens data (PI og FITC kanaler) (NB: denne oppgaven er vanligvis utføres av utstyrets tekniker):
- Unstained celler (rør 1 og 2).
- Celler lastet med Fluo-3 AM (2 mm) (rør 3 og 4).
- Døde celler (spermatozoa suspendert i 0,1% Triton X-100 i HSM i 10 min ved romtemperatur)farget med PI (1,2 uM PI, dvs. 0,25 ul av 2,4 mM PI blir tilsatt til 500 pl av sperm suspensjon) i løpet av 30 min ved 37 ° C, beskyttet mot lys (rør 5 og 6).- Vis registrerte data, og velg porten for de ønskede populasjoner.
- Juster gate og velg "Apply" for å Alle Kompensasjon Controls.
- Velg eksperiment> kompensasjon oppsett> beregne erstatningen.
- Endre navn på kompensasjon oppsett og link og lagre.
- Kjøre alle eksperimentelle rør (i dette tilfellet, 7-10 rør). På slutten, eksportere alle data i programvaren tilgjengelig for analyse (se trinn 5.6).
- Analysere resultatene av hvert eksperiment ved hjelp av utstyrets programvare, kommersielt tilgjengelig FlowJo programvare eller Cytobank fri programvare ( http://www.cytobank.org/ ).
6. Technique # 4. Enkeltrom Cell Imaging (enkelt celle informasjon med høy romlig oppløsning) Utstyr:. Custom-bygget Imaging set-up Vår bildebehandling set-up består av en omvendt Nikon Diaphot 300 mikroskop utstyrt med en temperaturregulator (Medical System Corp, Greenvale, NY), en Nikon PlanApo 60X (1,4 NA oljeimmersjon) målet. Fluorescens belysning er levert av en Luxeon V stjerne Lambertian Cyan LED part # LXHL-LE5C (Lumileds Lighting LLC, San Jose, CA) festet til en spesialbygd stroboscopic kontrollboksen. LED ble montert inn i en FlashCube40 forsamlingen med dichroic speil M40-DC400 (Rapp Opto elektronisk, Hamburg, Tyskland) (båndbredder: eksitasjon 450-490 nm, dichroic speil 505 nm, og utslipp 520-560 nm). LED-utgang ble synkronisert til Eksponering Out signal av en Cool Snap CCD-kamera via kontrollboksen for å produsere en enkelt flash på 2 ms varighet per individuell eksponering. Kameraet eksponeringstid ble satt tilsvarende flash varighet (2 ms). Bildene er samlet inn hver 250 ms (eller kan bli justert i henhold tilønsket tidsmessig oppløsning) ved hjelp av IQ-programvaren (Andor Bioimaging, Wilmington, NC).
- Forbered runde dekkglass (diameter = 25 mm) ved å anvende en 5-mL dråpe av poly-L-lysin-løsning (0,01% w / v) på midten. La det stå i minst en time (det kan tørke). Ved hjelp av en skvett flaske skyll behandlede området med vann før bruk. Denne prosedyren vil tillate sædcellene å følge dekkglass fra hodet sitt, mens deres flagellum kan fortsatt flytte.
- Fremstille forbindelsene for å bli testet ved å oppløse dem i HSM ifølge tabell 2. Forbindelser settes sekvensielt i det samme opptak kammer, slik at alltid å legge den samme mengde, og for å justere konsentrasjonen av stamløsningen tatt i betraktning fortynningen det vil ha når det blandes med det volumet som allerede finnes i kammeret (som angitt i Tabell 2). Hold alle test løsninger i et bad ved 37 ° C før de brukes.
- Monter dekselet slip inne i recording kammer og sted 10 pl Fluo-3 AM-lastet celler (en x10 7 celler / ml) i sentrum. Dekk cellene med 200 mL av forvarmet HSM.
- Plasser kammer på scenen av mikroskopet forvarmet til 37 ° C, se cellene (ved hjelp av fase kontrast), og velg et område for bildebehandling. Det er viktig å velge et område der celle tetthet er egnet (se figur 5A), for mange celler gjør analyse vanskelig på grunn av overlappende signaler MERK: Celler bør være godt festet til dekselet slip av hodet sitt, men stiller flagellar bevegelsen, som bekrefter. levedyktighet.
- Erverve fluorescens bilder i live mode for å justere fokus og lysstyrke.
- Starte forsøket ved å aktivere tidsseriestudie bildeopptak programvare (IQ i dette tilfelle). Vanligvis fire bildene er ervervet per sekund med belysning av to millisekunder per bilde.
- Bruk en mikropipette å nøye legge til (drop-wise) prøveforbindelsen (Pg i dette tilfellet), fortsetter forestillee anskaffelse som kreves og utføre to sekvensiell styring tilsetninger inn i samme kammer: (1) 20 uM ionomycin å oppnå maksimal fluorescens og (2) 5 mM MnCl 2 for å oppnå minimal fluorescens. Alternativt kan forbindelsene bli tilsatt ved hjelp av en perfusjon kammer som gir fordelene av å aktivere stimulus fjerning, og muligheten for jevnt å bade cellene med forbindelsen. På samme tid, har det ulempene ved å kreve større mengder oppløsning, og for å gjøre temperaturkontroll mer problematisk.
- Gjenta anskaffelse i et nytt kammer med enhver ønsket testforbindelsen.
- Utfør bildeanalyse på nettet ved hjelp av utstyret programvare, eller offline ved enten IQ-programvare eller Image J freeware. Tegn regioner av interesse (ROIs) rundt hver celle (eller deler av cellen), og også velge en celle-fritt område (for automatisk bakgrunn subtraksjon av programvaren). En gang-fluorescensintensitet serien er da oppnådd for hver ROI og disse data may skal eksporteres til Microsoft Excel for videre analyse. Vi normalisere fluorescensintensitet verdier ved hjelp av følgende ligning: (F/F0) - 1. Hvor f er den målte fluorescensintensiteten til enhver tid (t) og F0 er den midlere fluorescens tatt under den første 30 sek. Plott den totale serie (F/F0) - 1 vs tid (Figur 5B). Verdier kan også bli normalisert ved hjelp av fluorescens verdi oppnådd etter ionomycin tillegg som 100%.
- Bildeanalyse kan alternativt utføres ved hjelp av Image J fri programvare.
Technique # 1. Konvensjonell fluorometri
Progesteron er en av de kjente AR-induserende og, som forventet, har den provosere en forbigående [Ca2 +] i økning i human sperm (vist i figur 2). Tilsetting av en kalsium ionophore (ionomycin) fører til maksimal [Ca 2 +] i økning, noe som ikke tilbake til basale nivåer.
Technique # 2. Stoppet Flow fluorometri
Den progesteron-indusert [Ca2 +] i økning ble målt som før (konvensjonell fluorometri), men denne gang med større tidsmessig oppløsning, i dette tilfellet den frekvens på kjøpet var 0.1 Hz. Som vist i figur 3, forårsaket både progesteron (forbigående, rød linje) og ionomycin (vedvarende, blå linje) en meget rask [Ca2 +] i øke. Fraværet av en forsinkelse i progesteron-indusert [Ca 2 +] i økningen er i samsvar med tidligere rapporter som tyder på at progesteron direkte aktiverer Ca 2 + kanaler CatSper, uten mellomliggende signalering 10,14.
Technique # 3. Flowcytometrisystemer
[Ca 2 +] i ble målt i capacitated og ikke-capacitated menneskelig sperm. Som tidligere rapportert i 15 mus, storfe sperm 16 og menneskelig 17 sperm, har vi også observert økt [Cen 2 +] i i capacitated sammenlignet med ikke-capacitated menneskelig sperm. Baldi, et al. (1991) 17 rapporterte høyere basal [Ca 2 +] i i capacitated enn hos ikke-capacitated menneskelig sæd ved hjelp av konvensjonelle fluorometri. I dette arbeidet brukte vi flowcytometri å måle [Ca 2 +] i før og etter in vitro capacitation. Flowcytometri gjør oss i stand til å se at fordelingen av fluorescens verdier for capacitated sperm (figur 4D, blå strek) er flyttet til høyere verdier sammenlignet med ikke-capacitated sperm (figur 4D, red trace). Fluorescens verdier for hver enkelt celle kan observeres i de to-dimensjonale prikkplotter vist i figur 4G, viktigere, kan signalet som oppstår fra døde celler (15% ca) bli eliminert (figur 4G, øvre kvadranter).
Technique # 4. Enkelt Cell Imaging
Progesteron-indusered [Ca 2 +] i endring ble målt i enkle sædceller. Progesteron tillegg fører til en økning i [Ca 2 +] i både i sperm hodet og i flagellum. Som observert i befolkningen eksperimenter, avslørte enkelt celle analyse en forbigående og en vedvarende økning for progesteron og ionomycin, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Skisse av den eksperimentelle protokollen for sperm prøveopparbeidelse av swim-up-metoden. Den store skritt for separasjon av aktive sædceller og for justering av konsentrasjonen deres er illustrert. Den siste inkubasjonstrinn blir bare utført når capacitation er nødvendig.
Figur 2. Progesteron forårsaker en økning i [Ca2 +] i i menneske sæd populasjoner. (A) Representative fluorescens spor vs tid viser [Ca2 +] i forandringer som forårsakes ved tilsetning av 4 pMprogesteron (Pg, rød kurve), eller HSM med 0,01% DSMO (Pg kjøretøy) som negativ kontroll (Ctl, blå strek). Som en positiv kontroll, er endringen indusert av 10 uM ionomycin (Iono) vist for hver trase. Fluorescens-verdier ble ervervet ved en frekvens på 0,5 Hz i løpet av 120 s (B). Stolper representerer den gjennomsnittlige A f fra hver tilstand ± SE, n = 3 (* p <0,001 sammenlignet med kontrollgruppen).
Figur 3. Progesteron og ionomycin indusere en rask [Ca 2 +] i økning i menneskelige sædceller populasjoner. [Ca 2 +] i svarene ble registrert ved prøvetaking hver 10. msek (AFU = vilkårlige fluorescens enheter). (A) Rå spor for kontroll (blande celler med HSM, grønne kurven) og for signaler indusert med 10 mikrometer p rogesterone (rød kurve) eller med 10 uM ionomycin (blå strek). (B) korrigert spor for de signalene som induseres med 10 uM progesteron (rød kurve) eller med 10 uM ionomycin (blå strek), erholdt ved å trekke fra styresignalet (grønn sporer i panel A) fra deres tilsvarende rå signaler (rød og blå spor i panel A, henholdsvis). Progesteron induserer en forbigående reaksjon, med en maksimal fluorescens verdi forekommende 2.7 sek etter tilsetting av spole. På den annen side genererer ionomycin en rask og vedvarende respons hele tid (50 sekunder). Det innfelte i panel B viser et utvidet syn på de første 500 msek for hvert svar. Merk at både ionomycin-og progesteron-indusert [Ca 2 +] Jeg øker starte umiddelbart etter blanding cellene med spole. Hver kurve representerer gjennomsnittet av tre opptak. Alle spor ble normalisert mot sine minimum fluorescens verdier og oppå hverandre.com/files/ftp_upload/50344/50344fig3large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 4. .. [Ca 2 +] i stiger under human sperm capacitation capacitated (blå tomter) og ikke-capacitated (røde tomter) sædceller ble utsatt for flowcytometri analyse (A) Forward (FSC) og side scatter (SSC) tomter, de valgte porten er merket med blå linjen og bare de cellene i dette området ble brukt for videre analyse. Fluorescens histogrammer i FITC kanal fra unstained (autofluorescence) (B) og Fluo-3 AM farget (positive for FITC) (D) sædceller. Fluorescens histogrammer i PI kanal fra unstained (autofluorescence) (C) og døde (positivt for PI) (E-celler). Todimensjonal fluorescens (Fluo-3 AM ennd PI) prikkplott for unstained (F) og dobbelt farget (Fluo-3 AM og PI) sædceller (G), prosentandel av celler tatt opp i hver kvadrant indikeres av røde tall. Disse resultatene er representative for ett eksperiment (n = 5).
Figur 5. Progesteron fører til en økning i [Ca 2 +] i i menneskelige sædceller. (A) Representant PseudoColor bilder av menneskelige sædceller visualisert i begynnelsen (kontroll), og etter progesteron (Pg, 45 sek), ionomycin (Iono, 300 sek ) og MnCl 2 (380 sek) tilsetninger. (B) Representative normaliserte fluorescens spor av ni individuelle celler fra (A).
| Tube | Tilstand | Behandling | Verdier som skal måles | Kommentarer | Graf |
| 1 | Kontroll (Non-capacitated celler) | Unstained | a) FSC 1 og SSC 2 b) FITC 3 fluorescens c) PI 4 fluorescens | a) For å bestemme celle størrelse og detaljnivå og skape gate b) FITC 3 autofluorescence c) PI4 autofluorescence | a) Dot tomt A, Red b) Histogram B, Red c) Histogram C, Red |
| 2 | Kontroll (capacitated celler) | Unstained | a) FSC 1 og SSC 2 b) FITC 3 fluorescens c) PI4 fluorescens | a) For å bestemme celler størrelse end detaljnivå og skape gate b) FITC 3 autofluorescence c) PI 4 autofluorescence | a) Dot tomt A, Blå b) Histogram B, Blå c) Histogram C, Blå |
| 3 | Positivt for FITC 3 (Non-capacitated celler) | Etiketten med FITC | FITC 3 fluorescens | For å bestemme fluorescens i prøven | Histogram D, Red |
| 4 | Positivt for FITC 3 (capacitated celler) | Etiketten med FITC | FITC 3 fluorescens | For å bestemme fluorescens i prøven | Histogram D, Blå |
| 5 | Døde celler, positive for PI 4 (Non-capacitated celler) | Etiketten med PI | PI 4 fluorescens | For å bestemme fluorescens av døde celler | Histogram E, Red |
| 6 | Døde celler, positive for PI 4 (capacitated celler) | Etiketten med PI | PI 4 fluorescens | For å bestemme fluorescens av døde celler | Histogram E, Blå |
| 7 | Kontroll (Non-capacitated celler) | Unstained | FITC 3 og PI 4 fluorescens | For å bestemme autofluorescence i FITC 3 og PI 4 kanaler | Dotplot F, Red |
| 8 | Kontroll (capacitated celler) | Unstained | FITC 3 og PI 4 fluorescens | For å bestemme autofluorescence i FITC 3 og PI 4 kanaler | Dotplot F, Blå |
| 9 | Positivt for FITC 3 og PI 4 (Non-capacitated celler) | Label med FITC 3 og PI 4 | FITC 3 og PI 4 fluorescens | For å bestemme fluorescens-verdier i begge kanaler i den eksperimentelle betingelse | Dotplot G, Red |
| 10 | Positivt for FITC 3 og PI 4 (capacitated celler) | Etikett med FITC 3 og PI 4 | FITC 3 og PI 4 fluorescens | For å bestemme fluorescens-verdier i begge kanaler i den eksperimentelle betingelse | Dotplot G, Blå |
Tabell 1. Beskrivelse av prøver for et strømningscytometer eksperiment en FSC: forward scatter, 2 SSC:. Side scatter, 3 FITC: Fluorescein isothiocyanat; fire PI: Propidium Iodide.
| Compound | Volum av stamoppløsning som skal legges | Stock konsentrasjon | Volum tilstede i kammeret på det tidspunkt tillegg | Endelig konsentrasjon i kammeret |
| Progesteron | 100 pl | 9 mikrometer | 200 ul | 3 mikrometer |
| Ionomycin | 100 pl | 80 mikrometer | 300 mL | 20 pM |
| MnCl 2 | 100 pl | 25 mM | 400 ul | 5 mM |
Tabell 2. Utarbeidelse av løsninger for en avbildning eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulær signalering er avgjørende for de fleste cellulære aktiviteter, Ca 2 + er en allestedsnærværende messenger som følger mammalieceller gjennom hele sin levetid, fra sin opprinnelse ved befruktning, til slutten av sin livssyklus. Som svar på ulike stimuli, [Ca 2 +] Jeg øker, svinger og avtar med spatio-temporal kodifisering, følgelig er ulike prosesser aktivert, modulerte eller nedlegges av Ca 2 +-kodede meldinger. Intracellulær Ca 2 + dynamikken er svært viktig i sperm fysiologi, da dette ion er involvert i en kompleks orkestrering av signalformidling prosesser. Kunnskap om slike Ca 2 + svingninger kan hjelpe dechiffrere den molekylære identiteten til Ca 2 + kanaler involvert, og deres spesifikke roller i forskjellige signalmolekyler kaskader. Ca 2 +-sensitive fluorescerende fargestoffer utgjør et kraftig verktøy for å studere dem, slik at svært spesifikke og sensitive Ca 2 + measurements som kan benyttes til å spore konsentrasjonsendringer i levende celler. I denne utredningen, er celle befolkningen eksperimenter (konvensjonell og stoppet flyt fluorometri) og encellede eksperimenter (flowcytometri og enkelt celle imaging) brukes enten til å følge spatio-temporal [Ca 2 +] i menneskers sædceller ved en progesteron stimulans, eller å estimere Ca 2 + hvilende nivåer før og etter in vitro capacitation.
Konvensjonelle fluorometri er en utbredt teknikk fordi den nødvendige instrumentering er lett tilgjengelig i de fleste laboratorier, er det lett å utføre, og det kan raskt informere om det er en [Ca2 +] i inkrement på en spesifikk stimulus. Stoppet flyt fluorometri, men krever mer avansert utstyr, gir høy tidsmessig oppløsning. For eksempel Kaupp og kollegaer bestemt at ved progesteron stimuli, sperm [Ca 2 +] i stiger umiddelbart utenforsinkelse 10, og dette faktum, i forbindelse med ekstra eksperimentelle bevis 14, lede dem til å foreslå at progesteron aktiverer direkte en Ca 2 +-kanal (CatSper), utelukker involvering av et signalsystem kaskade eller en ekstra progesteron reseptor, i hvert fall i løpet av innledende progesteron-indusert tilvekst. Progesteron induserer en forbigående økning, etterfulgt av en langsommere og mindre inkrement, og derfor kan mer enn en Ca 2 + inngang mekanisme være involvert i den totale reaksjon.
Flowcytometri er en meget kraftfull teknikk, men det krever dyre instrumentering. Når det er tilgjengelig, er denne metode for bemerkelsesverdig betydning, ettersom den samtidig måler flere parametere, på et stort antall celler, og i en forholdsvis kort tid. Viktigste er at det diskriminering mellom levende og døde celler. I denne artikkelen viser vi for første gang ved hjelp av flowcytometri at det er en Ca 2 + øke dutskillingsmodul capacitation i menneskelig sperm. Våre målinger gitt fluorescens-verdier for hver enkelt celle, slik at fordelingen av disse verdiene i befolkningen kan tydelig observeres i sin tur muliggjør eliminering av signalet fra døde celler (figur 4).
Fluorescens-basert bildebehandling analyser på intakte levende celler utfyller de tre foregående teknikker fordi det legger romlig oppløsning til målingene. Høyere tids-og / eller romlig oppløsning under avbildning kan også erholdes ifølge de tilgjengelige instrumentering evner (dvs. kamera følsomhet, belysningskilden, objektiv numerisk apertur, etc.). Imidlertid, gitt at bare noen få celler er studert på en gang, må forsøk gjentas flere ganger for å kunne trekke pålitelige konklusjoner, noe som gjør analysen tidkrevende.
I denne artikkelen har vi brukt enkle eksperimentelle protokoller for å illustrere hver og en av de fireteknikker. Imidlertid kan disse metodene bli utvidet til å studere prosesser i mye større dybde. Det finnes et stort antall fluorescerende fargestoffer som kan målrettes mot bestemte avdelinger av cellen (cytosol, mitokondrier, ER, endosomer, etc.), for det er Ratiometrisk fargestoffer (dobbel emisjon og / eller eksitasjonsbølgelengdene) som tillater kvantitativ bestemmelse av Parameteren som måles (kalibrering er nødvendig), og endelig, kan mer enn ett fargestoff brukes samtidig for samtidig å måle, for eksempel, [Ca2 +] i og [Ph] i. endringer. I tillegg kan disse teknikker kombineres med farmakologiske verktøy og / eller omhyggelig utformet protokoller (varierende ekstracellulære Ca 2 + konsentrasjon, pH-verdier, temperaturer, eller andre faktorer som kan påvirke responsen) for å innhente informasjon som kan brukes til å belyse i detalj prosessen under studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Jose Luis De la Vega, Erika Melchy og Dr. Takuya Nishigaki for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexico) (99 333 og 128 566 til CT); Dirección General de Asuntos del Personlig Academico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 til CT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-7906 | |
| Calcium Chloride Dihydrate approx. 99% | Sigma-Aldrich | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 vials/50 μg each |
| Ionomycin | Alomone | I-700 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-9888 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P-3911 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium bicarbonate | JT Baker | 3506 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M-2670 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1016 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| D-Glucose | JT Baker | 1906-01 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-2256 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium L-lactate (aprox. 99%) | Sigma-Aldrich | L- 7022 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L-7011 | Component B |
| Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) | Sigma- Aldrich | X-100 | 2.4 mM solution in water |
| Round coverslip | VWR | 48380 080 | 25 mm diameter |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; Cell Chamber, for microscopy | Life technologies | A-7816 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 5x5 ml |
References
- Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
- Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa. Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).
- Esposito, G., et al. Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).
- Carlson, A. E., et al. Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation. PLoS ONE. 4, e6844 (2009).
- Brokaw, C. J. Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids. J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, 1139-1150 (1995).
- Svahn, H. A., van den Berg, A. Single cells or large populations. Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).
- Strunker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P., et al. The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels. Annu. Rev. Physiol. , (2011).
- Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).
- Kilic, F., et al. Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone. Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Xia, J., Ren, D. The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119 (2009).
- Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation. Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).
- Baldi, E., et al. Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa. J. Androl. 12, 323-330 (1991).
