Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En komparativ tilgang til at karakterisere Landskab værtspatogene protein-protein interaktioner

Published: July 18, 2013 doi: 10.3791/50404
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,3, 1
1Unité de Génétique, Papillomavirus et Cancer Humain (GPCH), Institut Pasteur, 2Cellule Pasteur, Université Sorbonne Paris Cité, 3Center for Cancer Systems Biology (CCSB), Harvard Medical School, Department of Cancer Biology, Dana Farber Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel fokuserer på identifikation af høj tillid interaktion datasæt mellem vært og patogen proteiner ved hjælp af en kombination af to ortogonale metoder: gær to-hybrid efterfulgt af en high-throughput interaktion assay i pattedyrceller kaldet HT-GPCA.

Abstract

Betydelig indsats var samlet for at generere store omfattende protein-protein interaktion netværk maps. Dette er medvirkende til at forstå de patogen-værts relationer, og var hovedsagelig udført af genetiske screeninger i gær to-hybrid-systemer. Den seneste forbedring af protein-protein interaktioner detektering af en Gaussia luciferase-baserede fragment komplementationsassay assay tilbyder nu mulighed for at udvikle integrative komparative interactomic tilgange er nødvendige for strengt sammenligne interaktion profiler af proteiner fra forskellige patogene stamme varianter mod et fælles sæt af cellulære faktorer.

Dette papir fokuserer specifikt på nytten af at kombinere to ortogonale metoder til at generere protein-protein interaktion datasæt: gær to-hybrid (Y2H) og en ny analyse, high-throughput Gaussia princeps protein komplementering assay (HT-GPCA) udført i mammale celler.

nt "> En storstilet identifikation af cellulære partnere i et patogen protein udføres ved parring-baserede gær to-hybrid screeninger af cDNA biblioteker ved hjælp af flere patogene stamme-varianter. En delmængde af interagerende partnere udvalgt på en høj selvtillid statistisk scoring er yderligere valideret i pattedyrceller for parvise interaktioner med hele sættet af patogene varianter proteiner ved hjælp af HT-GPCA. Denne kombination af to komplementære metoder forbedrer robustheden af ​​samspillet datasæt, og tillader udførelsen af ​​en stringent komparativ interaktion analyse. Sådanne komparative interactomics udgør en pålidelig og stærk strategi at dechifrere enhver patogen-vært samspil.

Introduction

Den stigende mængde af data indsamlet for at generere protein-protein interaktion maps åbner perspektiver for yderligere at forstå patogene infektioner. Som global forståelse af patogene infektioner begynder at dukke op, det giver adgang til den række af forstyrrelser fremkaldt af patogener proteiner, når du tilslutter den menneskelige proteom 1.. Dermed tilbyder en måde at forstå, hvordan patogener manipulere værtscellemaskineriet. Især viste kortlægningen af flere viral-vært interaktion netværk, virale proteiner fortrinsvis målrette værtsproteiner der er stærkt forbundet i mobilnetværket (hubs), eller som er centralt for mange stier i et netværk (flaskehalse proteiner) 2-4. Disse interaktioner tillader virus at manipulere vigtige cellulære processer, hvilket er medvirkende til at replikere og producere infektiøse afkom. Sammenlignende interaktioner kortlægning blev for nylig gennemført på beslægtede vira med det mål at udtrække oplysninger i forhold tilpatogenese 4.. Desuden har undersøgelser af det vært-patogener interaktioner landskabet blevet udvidet til mange patogener 5. Den målrettede celle faktorer identifikation giver indsigt i de strategier, der anvendes af patogener til at inficere celler og tillader påvisning af potentielle patogene markører.

Gær to-hybrid-system er den mest populære metode til at identificere binære interaktioner da genetisk screening er en effektiv og følsom værktøj for high-throughput kortlægning af protein-protein interaktioner. Den her foreslåede metode yderligere forbedrer de enkelte Y2H screeninger ved at vurdere et protein med flere patogener stamme varianter, hvilket giver adgang til en sammenlignende oversigt patogen-vært protein-protein interaktioner. Desuden er en væsentlig begrænsning af gær to-hybrid screening ligger i en høj falsk-negativ rate, da det genopretter omkring 20% af de samlede interaktioner 6. Dette indebærer, at interaktioner detekteres med kun en delmængde af patogens varianter kunne have undgået detektion med de andre. Derfor er enkelte partnere nye fra alle de to-hybrid screeninger yderligere udfordret til interaktion med det komplette sortiment af undersøgte stammer, give sammenlignende interaktion datasæt. Da det blev påvist, at kombinere forskellige metoder kraftigt øger robustheden af protein-protein interaktion datasæt 7, er denne valideringen udføres i pattedyrceller ved en nyudviklet protein-fragment komplementationsassay assay kaldet HT-GPCA 8.. Denne celle-baseret system muliggør påvisning af protein-interaktioner ved komplementering af Gaussia princeps split luciferase og er designet til at være forenelig med en high-throughput format. Takket være sin luminescens-baseret teknologi, og dens lave baggrundsstøj sammenlignet med andre fluorescens-baserede assay, HT-GPCA viser en påfaldende høj følsomhed.

Samlet denne tilgang er en effektiv mådeværktøj til at generere en omfattende kortlægning af værtspatogene samspil, der repræsenterer det første skridt mod en global forståelse af værtscellen kapring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Gær to-hybrid-Screenings

  1. Foretag følgende nødvendige løsninger:
    1. Komplet Syntetisk Drop Out (SD): Opløs 26,7 g minimal SD base med glukose i 1 liter vand. Tilsæt 2 g aminosyreblanding fremstilles som følger: 2 g Adenine hemisulfat, 2 g Arginin HCI, 2 g Histidin HCI, 2 g Isoleucin, 4 g leucin, 2 g Lysin HCl, 2 g Methionin, 3 g Phenylalanin, 2 g L -Serin, 2 g L-Threonin, 3 g tryptophan, 2 g Tyrosin, 1,2 g uracil, 9 g Valin.
    2. Selektiv Drop Out SD-L/-W/-H: SD indeholder hver essentielle aminosyrer undtagen specificerede (-L:-Leucin;-W:-tryptophan;-H:-Histidin).
    3. YPGLU: For 1 L, vægt 10 g gærekstrakt, 10 g Bacto Peptone og 20 g glukose. Komplet med 25 g Bacto agar til faste medier.
    4. YCM: Samme som YPGLU, men pH indstillet til 4,5.
  2. Parring og spredning
    1. Brug frosne portioner af pre-transformed Y187 gærstamme (parringstype α) indeholdende et cDNA-bibliotek klonet i pACT2. Tjek cellelevedygtighed ved udpladning seriefortyndinger på SD-L-plader.
    2. Klon patogenet ORF i pGBKT7 vektor, og omdanne det rekombinante plasmid ved hjælp af en standard procedure i AH109 gærstamme (parring type a).
    3. Spread pGBKT7-transformeret AH109 gær på SD-W plader. Inkuber i mindst to dage 30 ° C i en befugtet inkubator. Plader kan opbevares ved 4 ° C, indtil to-hybrid screening.
    4. Brug 3-aminotriazol (3-AT), en kompetitiv inhibitor af HIS3 enzymet, til at forhindre potentielt selv-transaktivering af HIS3-reportergenet af patogener 'proteiner. Udfør en automatisk aktivering testen ved bestemmelse af koncentrationen af ​​3-AT, som forhindrer vækst af pGBKT7-transformeret gær på SD-W/-H plader.
    5. Frø 30 ml SD-W med få kolonier af pGBKT7-transformerede AH109. Inkuber 30 timer ved 30 ° C med rotation.
    6. Frø 200 ml SD-W med 30 mlDe AH109 kulturer. Inkuber med rotation omkring 20 timer ved 30 ° C.
    7. Inkuber optøede cDNA-bibliotek-transformerede Y187 i 20 ml YPGLU, inkuberes 10 minutter ved 30 ° C med rotation.
    8. Centrifuger et volumen på pGBKT7-transformeret AH109 kultur svarende til en ækvivalent mængde af levedygtige Y187 gærceller i 5 minutter ved 3.500 rpm ved 20 ° C. Forsigtigt trække supernatanten og resuspender pellet i 10 ml YPGLU.
    9. Bland den resuspenderede AH109 gær med Y187 indeholdende bibliotek. Overførsel i et 50 ml rør. Centrifuger i 5 minutter ved 3.500 rpm ved 20 ° C, forsigtigt trække supernatanten (skrøbelige pellet).
    10. Resuspender pellet i YPGLU at få en total på 1,5 ml.
    11. Spred gær på 3 YCM-Agar 150 mm plader, 0,5 ml / plade. Inkuber 4,5 timer ved 30 ° C.
    12. Saml parret gær fra YCM plader ved skrabning med en rive glas i 10 ml SD-L/-W/-H. Skyl pladerne to gange med 5 ml SD-L/-W/-H medium og pool.
    13. Centrifuger 5 min ved 3.500 omdrejninger i minuttet, 20° C. Kassér supernatanten og resuspender gær pellet i 5 ml SD-L/-W/-H medium.
    14. Spred parret gær på 10 plader (0,5 ml / plade) af SD-L/-W/-H Agar suppleret med passende koncentration af 3-aminotriazol (3-AT) bestemt i auto-aktivering test. Inkuber ved 30 ° C i en fugtig atmosfære i 6-10 dage.
    15. Bestem diploide (2n) sats for at evaluere parring effektivitet ved at sprede 250 pi seriefortyndinger (10 -4 til 10 -6) i parret gærsuspension på SD-L/-W plader. Pladerne inkuberes ved 30 ° C i to dage. Tæl kolonier dyrket på SD-L/-W og udlede den totale diploide tal til stede i det oprindelige volumen af ​​parret gær. Rapporter denne diploide tal til levedygtige bibliotek-holdige gær nummer til at beregne det diploide sats. Det bør ligge omkring 10-25%.
    16. 6-10 dage efter inkubation ved 30 ° C, pick parret gærkolonier i frisk SD-L/-W/-H + 3-AT plader. [Tip: For gæren i en ordning på 8baner af 12 brønde gengiver en plade med 96 brønde, så det vil være lettere bagefter til sekventering]. Lad gærkolonier vokse i 4-5 dage ved 30 ° C i en fugtig atmosfære.
  3. Screening af his3 positive kloner ved PCR og sekventering
    Målet er at PCR amplificere ORF indeholdt i pACT2 vektorer af gær kolonier dyrket på selektive SD-L/-H/-W plader.
    1. Sæt en 96-brønds PCR-plade på is.
    2. At lysere gærceller, tilsættes 50 pi per brønd af en Zymolase 20T opløsning (2,5 mg / ml i 10 mM HEPES puffer pH 7,7).
    3. Forsigtigt resuspender en koloni per brønd.
    4. Inkuber 15 minutter ved 37 ° C og 15 minutter ved 95 ° C.
    5. Sæt pladen tilbage på is. Tilsættes 50 ul destilleret vand per brønd. Bland godt ved pipettering op og ned.
    6. Centrifuger i 5 minutter ved 3.500 rpm og 4 ° C.
    7. PCR amplificere 10 pi at detektere et insert anvendelse af primere annealer begge sider af ORF afledt fra cDNA i pACT2 vektorer. Protokollen er given til forstærkning af 96 lyserede gær kolonier med ExTaq polymerase. Forbered følgende mix: 525 pi 10X ExTaq buffer, 420 pi dNTPs mix (2,5 mm), 10,5 pi Forward Primer (1 ug / ul), 10,5 pi Reverse Primer (1 ug / ul), 31,5 pi ExTaq (5 U / ul ) og 3202,5 ​​pi H 2 0. Distribuere 40 ul af blandingen per brønd i en 96-brønds PCR-plade. Tilsæt 10 ul lyseret gær per brønd. Udføre forstærkning som følger: 94 ° C i 3 minutter, derefter 35 cyklusser ved 94 ° C i 30 sek, 60 ° C i 1 min, 72 ° C i 4 min, og ende med 72 ° C i 7 min. Run 3 gl af PCR-produkterne på en 1,2% agarosegel for at detektere PCR-positive kloner. Bemærk, at brug færdigstøbte 96 godt agarosegeler anbefales.
      [Tip: pladen kan opbevares ved -20 ° C i et par måneder og genbruges til nye PCR]
    8. Sequence PCR amplificerede fragmenter isoleret fra HIS3 positive kloner. Udfør en BLAST analyse for at identificere cellulære ORF. Low-tillid alignments (E værdi &gt; 10 -10, identitet <80%, peptid længde <20 aminosyrer) kasseres samt rammeskiftet og for tidlig STOP codon indeholder sekvenser.

2.. Matrix bygningen for HT-GPCA

HT-GPCA er en pattedyrcelle-baseret assay, hvor begge patogene og vært proteiner udtrykt transient fusioneret til komplementære fragmenter af den opdelte Gaussia princeps luciferase. Ved interaktion af partnerne er dette enzym rekonstitueres tillader måling af dets enzymatiske aktivitet. Interaktionen intensitet således udledes en normaliseret Luminescence Ratio (se nedenfor og figur 1)

  1. Valg af værtscelle partnere
    1. Vælg proteiner, der er identificeret mere end tre gange i Y2H screeninger for yderligere validering i pattedyrceller for at øge datasæt tillid 9..
    2. Tilføj kendte interagerende partnere af patogenet proteiner som posive kontrol.
  2. Overføre til HT-GPCA kompatible vektorer
    1. Klon hver patogen protein ORF i en pSPICA-N2 vektoren at generere patogene proteiner med aminosyrer 110-185 af de humaniserede Gaussia princeps luciferase fusioneret ved deres N-terminus (GL2-patogen proteinfusioner).
    2. PCR amplificere cellulært protein ORF direkte fra Y2H positive kloner eller fra andre ORF ressourcer (Human ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) og overføre dem til pSPICA-N1 vektorer til at generere proteiner fusioneret ved N-terminalen med aminosyrerne 18-109 af humaniseret Gaussia princeps luciferase (GL1-vært proteinfusioner).
      [Tip: For storstilet kloning, er Gateway kloning systemet anbefales. I så fald, til PCR-amplifikation bruge primere designet til at indeholde Gateway kompatible sites].
    3. Sekvens alle ekspressionsvektorer. Sekvenser af pSPICA-N1 og pSPICA-N2kan findes i henvisning 8..

Bemærk at plasmidkonstruktioner kan inverteres, dvs patogener proteiner pSPICA-N1 og vært protein i pSPICA-N2.

3.. High-Throughput Gaussia princeps Luciferase-Based Protein Complementation Assay (HT-GPCA)

  1. Celletransfektion
    1. Seed 293T celler ved 350.000 celler / ml i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS) uden antibiotika. Distribuere 100 ul / brønd i sterile hvide dyrkningsplader. Må ikke overstige 10 plader i et enkelt eksperiment. Lad cellerne vokse i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
      [Tip:. Da pSPICA plasmider indeholder en SV40, brug af 293T celler tillader deres replikation i transficerede celler og dermed fører til overekspression af de to luciferase-fragmenter]
    2. Den følgende dag, transficere celler ved hjælp af enhver egnet transfektionsprotokol. Bemærk, at for visse transfektionsreagenser, NUmber af celler seedede skal måske tilpasses. Anvendes 100 ng per brønd af både patogenet og vært ORF plasmidkonstruktioner. Co-transficere 10 ng per brønd af en af ​​CMV-Firefly luciferase plasmid at normalisere for transfektionseffektivitet. Hvert punkt er testet tredobbelt.
      [Tip:. DNA blandinger kan udføres dagen før transfektion og opbevaret ved -20 ° C med selvklæbende forseglinger]
    3. Overførsel transfektion mix plader dyrkede 293T celler. Være omhyggelig med at forsigtigt deponere DNA mix onto celler som 293T ikke er stærkt klæbende og let løsnes fra bunden af ​​brønden. Inkuber i en cellekultur inkubator i 24-30 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
  1. Cellelyse og Gaussia luciferase dosering
    1. Vask cellerne med PBS (100 ul / brønd). Tilsæt 40 ul 1X Renilla lysisbuffer. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur under omrøring.
    2. Gem 10 ul cellelysater i anden hvid plate til efterfølgende dosering af Firefly luciferaseaktivitet. Opbevares ved 4 ° C eller alternativt ved -20 ° C med forsegling.
    3. Måle Gaussia aktivitet på de resterende 30μl af cellelysater ved tilsætning af 100 pi af Renilla-luciferase assayreagens og optælling luminescens i 10 sek med et luminometer. Dosering af en plade med 96 brønde tager omkring en halv time. Udfør måling med friske celleekstrakter da frysning eller langtidsopbevaring kan påvirke interaktionen-medieret Gaussia aktivitet.
  1. Måling af Firefly aktivitet
    1. Måle Firefly aktivitet på den gemte 10 ul cellelysater ved tilsætning af 50 pi ildflueluciferase assayreagens og optælling luminescens i 10 sek. Dosering af en plade med 96 brønde tager omkring en halv time. [Tip: Doseringen af ildflueluciferase kan udføres dagen efter på frosne lysater.]
  1. NLR Beregninger
      Gaussia luciferaseaktivitet og Firefly luciferaseaktivitet at opnå en normaliseret Gaussia luminescens værdi under hensyntagen transfektionseffektivitet og cellelevedygtighed. Beregn gennemsnittet af tre eksemplarer.
    1. At overvåge interaktion, estimere en Normalized Luminescence Ratio (NLR) for hver patogen-host par. For at gøre dette, dividere det normaliserede Gaussia luminescens aktivitet påvist i tilstedeværelse af både patogen og vært proteiner ved summen af de aktiviteter, der måles i kontrol brøndene (figur 1 tilpasset fra henvisningen 8). NLR cut-off-værdien for positive interaktioner er blevet anslået til at være omkring 3,5 8..
  1. Dataanalyse
    1. Udfør hierarkisk clustering vha. R statistik pakke. Først gruppe NLR data i kategorier, derefter beregne et samspil dendrogram bruge hele kobling metoden. Visualiser dettedendrogram med JavaTreeView 10.. Beregne afstanden mellem interaktion dendrogram og fylogenetiske træ ved hjælp af en Pearson korrelationskoefficienten.
    2. For at generere interaktionsnetværk vælge det positive samspil fra HT-GPCA datasæt og bruge Cytoscape softwaren 1.. Uddrag grader af værten proteiner og plot deres distribution til adgang til netværket lokale dynamik. Host-patogener netværk kan overlejret til værten interactome at give en vurdering af den samlede virkning af patogene proteiner i værtens mobilnetværk.
    3. Uddrag GO (Gene ontologi) vilkår i forbindelse med de målrettede cellulære faktorer med DAVID bioinformatik database 12 for at vurdere den funktionelle berigelse af datasættet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En styrke HT-GPCA ligger i dens høje følsomhed, som illustreret ved vurderingen af falsk positive og falsk negative for HPV E2-protein i figur 2 (tilpasset fra henvisningen 13). For at bestemme den falske negative rate blev kendte interaktioner mellem E2 fra HPV16 vurderes af HT-GPCA (figur 2A). Fire ud af 18 interaktioner blev ikke inddrevet (svarende til en 22% falsk negative sats). De falske positive interaktioner blev målt til at være 5,8% ved hjælp af 12 HPV E2-proteiner mod en tilfældig række af cellulære proteiner (figur 2B). Desuden er den stærke specificitet af fremgangsmåden fremhævet i Figur 2C viser, at en enkelt punktmutation kendt for at interferere med E2 binding til dens celle partner BRD4 tilintetgør NLR forholdet (figur 2C).

Denne storstilet komparativ interactomic tilgang er for nylig blevet anvendt med succes til tre tidlig proproteiner af Human Papillomavirus (HPV): E2, E6 og E7 stammer fra forskellige genotyper repræsentant for HPV naturlige mangfoldighed i tropisms og patologier 13,14. For hver af de tidlige proteiner, hierarkisk clustering af samspillet profilerne oftest rekapitulerer HPV phylogeny, der beviser robusthed tilgang og relevansen af interaktion datasæt (Figur 3 tilpasset fra referencer 13 og 14). Det kan bruges til at korrelere specifikke virus-vært interaktion profiler med patologiske træk, hvorved spor af inddragelse af virale proteiner i patogenese. Genotype-specifikke interaktioner kan udvindes, som potentielt svarer til tropisme eller patogene biomarkører som vist i figur 4 for E6 proteinerne af HPV (Figur 4 tilpasset fra henvisningen 14).

Endvidere kan funktionelle indsigt komme fra sådanne store analyser. For eksempel i den interactomic undersøgelse afHPV E2 proteiner den funktionelle berigelse analyse førte til identifikation af en prominent familie bestående i cellulære transkriptionsfaktorer, i overensstemmelse med den primære rolle i E2 som en viral transkriptionel regulator. Det afslørede også en uventet funktionel målretning af den intracellulære menneskehandel maskiner åbner nye perspektiver for den rolle E2 i HPV patogenese 13..

Samlet set de komparative interatomare undersøgelser med de HPV tidlige proteiner i høj grad forbedre forståelsen af ​​HPV patogenese ved at korrelere specifikke interaktioner profiler til at fænotypiske forskelle.

Figur 1
Figur 1. Identifikation af protein-protein interaktioner med HT-GPCA. Både patogen og vært proteiner fusioneret til en inaktiv halvdel af Gaussia princeps luciferase (GL2 og GL1 dele, henholdsvis). Når proteinerne interagerer, er en luciferaseaktivitet fremkaldt af nærhed af begge halvdele af enzymet. Den gendannede Gaussia luciferaseaktivitet er beregnet ud fra en normaliseret Luminescence Ratio (NLR) som vist til højre. Figur tilpasset fra henvisningen 8.. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. HT-GPCA egenskaber. (A) 18 interaktioner udvundet fra litteraturen involverer E2-proteinet fra HPV16 og cellulære proteiner blev testet ved HT-GPCA for at vurdere den falsk negative rate forbundet med denne t echnique. NLR Forholdet er repræsenteret som en farve gradient (zonekort) med en skala fra sort (ingen interaktion) til lyseblå (stærk interaktion). Fire kendte interaktioner blev ikke inddrevet (røde pile), som giver et groft skøn over den falsk negative rente omkring 22%. (B) 12 HPV E2-proteiner blev testet med 10 tilfældigt plukket cellulære proteiner, svarende til a priori negative interaktioner, for at bestemme den falsk-positive rate af HT-GPCA, der scorede omkring 5,8%. (C) Samspillet mellem BRD4 cellulært protein og HPV16 eller HPV18 E2-proteiner er kendt for at afhænge af aminosyrerne I73 og I77 hhv. Når disse aminosyrer er muteret, HT-GPCA NLR dråber med en 5-tiden faldet demonstrerer en høj specificitet til påvisning af interaktioner. Figur tilpasset fra henvisningen 13.. Klik her for at se større figur .

jove_content "fo: keep-together.within-page =" altid "> Figur 3
Figur 3. Sammenligning mellem eksperimentelle interaktion-baserede dendrograms og HPV fylogenetiske træer. Fylogeni HPV baseret på den tidlige proteiner E2 (A), E6 (B) eller E7 (C) sekvenser er repræsenteret på venstre side af hver graf. Interaktion dendrograms blev opnået ved hierarkisk klyngedannelse af samspillet profiler af hvert protein og er repræsenteret til højre. En væsentlig kongruens blev observeret mellem de to træsorter, med lignende gruppering af de patologiske typer (farvede rektangler), beviser relevansen af interaktion datasæt. Figur tilpasset fra referencer 13 og 14.. Klik her for at se større figURE.

Figur 4
Figur 4.. Skematisk fremstilling af E6 vigtigste cellulære mål. Cellulære mål blev sorteret baseres på interaktionen intensitet og grupperet efter interagerende HPV type. Denne repræsentation gør det muligt at identificere specifikke biomarkører såsom FADD, som interagerer kun E6 proteiner onkogen HPV. En sådan målretning skal være afgørende for den kræftfremkaldende træk af alle onkogen HPV, og udgør således en god kandidat til at blive brugt enten som et surrogat markør for HPV-infektion eller som et terapeutisk target. Figur tilpasset fra henvisningen 14..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uafhængigt, gær-to hybrid-og pattedyr interaktion assays, såsom GST pull-down, Lumier eller MAPPIT, har vist sig at være effektive redskaber til at opdage protein-protein interaktioner, men er begrænset af den høje falsk positive og falsk negative interaktioner forbundet med disse teknikker 15.. Desuden beviser vokser at kombinere ortogonale metoder øger pålideligheden af de opnåede interaktion datasæt 7.. Den seneste udvikling af HT-GPCA teknikken beskrevet her har ikke alene forbedret følsomhed til påvisning af binære protein-protein-interaktion i pattedyrceller, men har også tilbydes mulighed for at håndtere en stor mængde af interaktioner på én gang.

Strategien her beskrevne forbedrer dækningen af ​​individuelle Y2H screeninger ved sondering interaktioner mellem flere stamme-varianter. Desuden gentest interaktioner med en ortogonal afsløring metode giver strenge sammenlignende samspiltion datasæt ved at overvinde begrænsninger og undslippe artefakter iboende til de to-hybrid metode. Da en HT-GPCA foregår i pattedyrceller, de post-translationelle modifikationer og naturlig subcellulær lokalisering af proteiner er upåvirket. Vores tilgang kan dermed producere i et enkelt trin interaktion kort, der er forbedret i forhold til dem, der primært er baseret på gær to-hybrid til interaktion sensing 4..

På dette tidspunkt, selv om vi ville anbefale være omhyggelig, når man studerer trans-membranproteiner, da påvisning af interaktioner kan afhænge lokaliseringen af Gaussia fragmenter på hver side af membranen. I disse tilfælde kan det være nødvendigt at sammensmelte Gaussia fragmenterne i den C-terminale ende af den ene eller begge parter. Derudover kunne luciferase ekspression blive påvirket af en række parametre såsom transfektionseffektivitet og celleantal. Derfor vil vi på det kraftigste anbefale Follgrund normaliseringsproceduren beskrevet i protokollen afsnit for at tage hensyn til eksperimentelle variationer.

Ved at bruge bestilte arrays af ORF taget fra den stigende opsamling af Human ORFeome forudser vi et tidspunkt i den nærmeste fremtid, hvor HT-GPCA kunne bruges direkte som en screeningsmetode. Dette skal først drastisk forbedre screening dækning eftersom hvert protein par derefter ville blive testet, og for det andet bør det lette automatisering. Imidlertid bør en mere drastisk high throughput udvidelse af dette assay anlægges af udviklingen af en in vitro-HT-GPCA assay anvendelse af in vitro ekspressionssystemer baseret på menneskelige celleekstrakter. Dette bør også gøre det muligt at overvåge protein-protein interaktioner i et kontrolleret biokemisk miljø.

Endelig er kommende udvikling forventes at forbedre visualisering af komplekse-medieret luminescens i levende celler. I så fald kunne HT-GPCA væreanvendes til at detektere interaktioner i forbindelse med tilsætning af lægemidler eller komplekse inhibitorer, hvilket muliggør direkte overvågning af afbrydelsen af ​​en interaktion.

I alt udgør denne tilgang en effektiv skitse til nogen undersøgelser af patogen-host samspil og vi føler, at komparative interactome analyser kunne give en solid ramme til at forstå mikrobe kapringen af ​​værtsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet delvist af midler fra Institut Pasteur og ved tilskud fra Ligue Nationale contre le Cancer (tilskud R05/75-129 og RS07/75-75), Foreningen pour la Recherche sur le Cancer (tilskud ARC A09 / 1/5031 og 4867), og Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 og ANR09 Mien 026 01). MM var en modtager af en MENRT fællesskab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains Clontech
Minimal SD base US biological D9500
Amino acids Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Acros organics 264571000
Zymolase Seikagaku 120491
DMEM Gibco-Life Technologies 31966
Fetal bovine serum BioWest S1810
Phosphate buffer Saline (PBS) Gibco-Life Technologies 14190
Penicillin-Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies 25300
Renilla luciferase assay Promega E2820
White culture plate Greiner Bio-One 655083
96-wellPCR plates 4titude 4t-i0730/C
Incubator (30 °C) Memmert
Incubator (37 °C) Heraeus
Luminometer Berthold Centro XS-LB 960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
  2. Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
  3. de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
  4. Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
  5. Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
  6. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  7. Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
  8. Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
  9. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
  10. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
  11. Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
  12. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
  13. Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
  14. Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
  15. Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).

Tags

Immunologi Genetik Mikrobiologi biokemi molekylærbiologi cellebiologi Biomedical Engineering infektion Cancer Biology Virology værtspatogene Interactions værtspatogene Interactions protein-protein interaktion High-throughput screening Luminescence gær to-hybrid HT-GPCA Netværk protein gær celle kultur
En komparativ tilgang til at karakterisere Landskab værtspatogene protein-protein interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muller, M., Cassonnet, P., Favre,… More

Muller, M., Cassonnet, P., Favre, M., Jacob, Y., Demeret, C. A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (77), e50404, doi:10.3791/50404 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter