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Immunology and Infection

मेजबान पैथोजन प्रोटीन से प्रोटीन सहभागिता के लैंडस्केप विशेषताएँ एक तुलनात्मक दृष्टिकोण

Published: July 18, 2013 doi: 10.3791/50404
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,3, 1
1Unité de Génétique, Papillomavirus et Cancer Humain (GPCH), Institut Pasteur, 2Cellule Pasteur, Université Sorbonne Paris Cité, 3Center for Cancer Systems Biology (CCSB), Harvard Medical School, Department of Cancer Biology, Dana Farber Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख मेजबान और दो orthogonal तरीकों का एक संयोजन का उपयोग रोगज़नक़ प्रोटीन के बीच उच्च आश्वस्त बातचीत डेटासेट की पहचान पर केंद्रित है: खमीर दो संकर एचटी-GPCA बुलाया स्तनधारी कोशिकाओं में एक उच्च throughput बातचीत परख द्वारा पीछा किया.

Abstract

महत्वपूर्ण प्रयास बड़े पैमाने पर व्यापक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के नक्शे उत्पन्न करने के लिए एकत्र हुए थे. इस रोगज़नक़ मेजबान रिश्तों को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और अनिवार्य रूप से खमीर दो संकर प्रणालियों में आनुवंशिक स्क्रीनिंग के द्वारा किया गया था. एक Gaussia luciferase आधारित टुकड़ा पूरक परख द्वारा प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के हाल ही के सुधार अब कड़ाई से सेलुलर कारकों में से एक आम सेट के खिलाफ विभिन्न रोगज़नक़ तनाव वेरिएंट से प्रोटीन की बातचीत प्रोफाइल की तुलना करने के लिए आवश्यक एकीकृत तुलनात्मक interactomic दृष्टिकोण विकसित करने का अवसर प्रदान करता है.

इस कागज विशेष रूप से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत डेटासेट उत्पन्न करने के लिए दो orthogonal विधियों के संयोजन की उपयोगिता पर केंद्रित है: खमीर दो संकर (Y2H) और एक नई परख, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रदर्शन उच्च throughput Gaussia princeps प्रोटीन पूरक परख (एच टी-GPCA).

NT के "एक रोगज़नक़ प्रोटीन की सेलुलर भागीदारों के> एक बड़े पैमाने पर पहचान कई रोगज़नक़ तनाव वेरिएंट का उपयोग कर सीडीएनए पुस्तकालयों की दो संकर चोकर संभोग आधारित खमीर द्वारा किया जाता है. एक उच्च आत्मविश्वास सांख्यिकीय स्कोरिंग पर चयनित बातचीत भागीदारों की एक सबसेट आगे है हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA उपयोग कर रोगज़नक़ वेरिएंट प्रोटीन के पूरे सेट के साथ जोड़ी के लिहाज से बातचीत के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में मान्य है. दो पूरक तरीकों का यह मिश्रण बातचीत डाटासेट की मजबूती में सुधार, और एक कड़े तुलनात्मक बातचीत के विश्लेषण के प्रदर्शन की अनुमति देता है. इस तरह की तुलनात्मक interactomics पढ़ना किसी भी रोगज़नक़ मेजबान interplays के लिए एक विश्वसनीय और शक्तिशाली रणनीति बनाते हैं.

Introduction

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नक्शे उत्पन्न करने के लिए एकत्र डेटा की बढ़ती मात्रा आगे रोगज़नक़ संक्रमण को समझने के लिए दृष्टिकोण को खोलता है. रोगज़नक़ संक्रमण की वैश्विक समझ में उभरने के लिए शुरू होता है, यह मानव proteome 1 जोड़ने जब ​​रोगजनकों प्रोटीन से प्रेरित perturbations की सीमा तक पहुँच प्रदान करता है. यह इस प्रकार रोगजनकों मेजबान सेल मशीनरी हेरफेर कैसे समझने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. विशेष रूप से, कई वायरल मेजबान बातचीत नेटवर्क की मैपिंग वायरल प्रोटीन अधिमान्यतया अत्यधिक (हब) सेलुलर नेटवर्क में जुड़े हुए हैं, या एक नेटवर्क (बाधाओं प्रोटीन) 2-4 में कई रास्ते के लिए केंद्रीय हैं कि मेजबान प्रोटीन है कि लक्ष्य का पता चला. इन मुलाकातों संक्रामक संतान दोहराने के लिए और निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जो वायरस महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में हेरफेर करने की अनुमति देते हैं. तुलनात्मक बातचीत मानचित्रण हाल ही के सापेक्ष जानकारी निकालने के लिए लक्ष्य के साथ संबंधित वायरस पर आयोजित की गईरोगजनन 4. इसके अलावा, मेजबान रोगजनकों बातचीत परिदृश्य की पढ़ाई कई रोगजनकों 5 के लिए बढ़ा दिया गया है. लक्षित सेल कारकों की पहचान की कोशिकाओं को संक्रमित करने के रोगजनकों द्वारा इस्तेमाल किया रणनीतियों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और संभावित रोगजनक मार्कर का पता लगाने की अनुमति देता है.

खमीर दो संकर प्रणाली आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के उच्च throughput मानचित्रण के लिए एक कुशल और संवेदनशील उपकरण है के बाद से बाइनरी बातचीत की पहचान करने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीका है. दृष्टिकोण आगे इस प्रकार रोगज़नक़ मेजबान प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक तुलनात्मक अवलोकन करने के लिए पहुँच प्रदान करने, कई रोगजनकों तनाव वेरिएंट की एक प्रोटीन का आकलन करने से व्यक्ति Y2H भूसी को बेहतर बनाता है यहाँ का प्रस्ताव रखा. यह कुल बातचीत 6 के बारे में 20% ठीक हो जाए क्योंकि इसके अलावा, खमीर दो संकर स्क्रीनिंग के एक प्रमुख सीमा, एक उच्च झूठी नकारात्मक दर में निहित है. इस patho का केवल एक सबसेट से पता चला है कि बातचीत का तात्पर्यजेन्स वेरिएंट दूसरों के साथ पता लगाने बच सकता. इसलिए, सभी दो संकर भूसी से उभरते व्यक्ति भागीदारों आगे तुलनात्मक बातचीत डेटासेट प्रदान करने, अध्ययन उपभेदों की पूरी रेंज के साथ बातचीत के लिए चुनौती दी है. यह अलग तरीके के संयोजन दृढ़ता से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत डेटासेट 7 की मजबूती बढ़ जाती है कि प्रदर्शन किया गया था, इस मान्यता एचटी-GPCA 8 नामक एक नव विकसित प्रोटीन टुकड़ा complementation परख द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में किया जाता है. इस सेल आधारित प्रणाली Gaussia princeps के पूरक द्वारा प्रोटीन बातचीत का पता लगाने luciferase विभाजित है और एक उच्च throughput प्रारूप के साथ संगत होना करने के लिए डिजाइन किया गया है की अनुमति देता है. इसके luminescence आधारित प्रौद्योगिकी के लिए शुक्रिया और अपनी कम पृष्ठभूमि शोर अन्य प्रतिदीप्ति आधारित परख के साथ तुलना में, एच टी GPCA एक strikingly उच्च संवेदनशीलता दिखाता है.

कुल मिलाकर, इस दृष्टिकोण एक कुशल गठनअपहरण मेजबान सेल की वैश्विक समझ की ओर पहला कदम का प्रतिनिधित्व करता है जो मेजबान रोगज़नक़ interplays की एक व्यापक मानचित्रण, उत्पन्न करने के लिए उपकरण.

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Protocol

1. खमीर दो संकर चोकर

  1. निम्न आवश्यक समाधान करें:
    1. पूरा सिंथेटिक ड्रॉप आउट (एसडी): पानी का 1 एल में ग्लूकोज के साथ न्यूनतम एसडी आधार के 26.7 ग्राम भंग. के रूप में तैयार एमिनो एसिड मिश्रण के 2 जी जोड़ें: 2 जी adenine hemisulfate, 2 जी Arginine एचसीएल, 2 जी हिस्टडीन एचसीएल, 2 जी Isoleucine, 4 जी Leucine, 2 जी लाइसिन एचसीएल, 2 जी Methionine, 3 जी फेनिलएलनिन, 2 जी एल -सेरीन, 2 जी एल Threonine, 3 जी Tryptophan, 2 जी Tyrosine, 1.2 ग्राम uracil, 9 ग्राम Valine.
    2. SD-L/-W/-H आउट चयनित ड्रॉप: एसडी उन निर्दिष्ट छोड़कर हर आवश्यक अमीनो एसिड युक्त (एल: Leucine, डब्ल्यू:-Tryptophan, एच: हिस्टडीन).
    3. YPGLU: 1 एल, वजन खमीर निकालने, Bacto Peptone के 10 ग्राम और ग्लूकोज के 20 ग्राम से 10 ग्राम के लिए. ठोस मीडिया के लिए 25 ग्राम Bacto अगर साथ पूरा करें.
    4. YCM: YPGLU के रूप में भी है, लेकिन 4.5 पीएच को समायोजित.
  2. संभोग और प्रसार
    1. पूर्व बदलने के जमे हुए aliquots का प्रयोग करेंpACT2 में क्लोन एक सीडीएनए पुस्तकालय युक्त एड Y187 खमीर तनाव (संभोग प्रकार α). एसडी एल प्लेटों पर धारावाहिक dilutions चढ़ाना द्वारा सेल व्यवहार्यता की जाँच करें.
    2. PGBKT7 वेक्टर में रोगज़नक़ ओआरएफ क्लोन, और AH109 खमीर तनाव (संभोग प्रकार एक) में एक मानक प्रक्रिया का उपयोग कर पुनः संयोजक प्लाज्मिड बदलना.
    3. बिखरा एसडी डब्ल्यू प्लेटों पर AH109 खमीर pGBKT7 तब्दील. एक humidified इनक्यूबेटर में कम से कम दो दिन में 30 डिग्री सेल्सियस सेते हैं. प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस पर दो संकर स्क्रीनिंग तक संग्रहित किया जा सकता है.
    4. रोगजनकों 'प्रोटीन से HIS3 रिपोर्टर जीन की आत्म transactivation संभावित प्रतिक्रिया के लिए 3 aminotriazole (3 पर), HIS3 एंजाइम की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध, का प्रयोग करें. SD-W/-H प्लेटों पर pGBKT7 तब्दील खमीर के विकास को रोकता है जो 3 पर, की एकाग्रता का निर्धारण करके एक ऑटो सक्रियण परीक्षण प्रदर्शन करते हैं.
    5. PGBKT7 तब्दील AH109 की कुछ कालोनियों के साथ एसडी डब्ल्यू का बीज 30 मिलीलीटर. रोटेशन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 घंटे सेते हैं.
    6. 30 मिलीलीटर के साथ एसडी डब्ल्यू का बीज 200 मिलीलीटरAH109 संस्कृतियों की. 30 में 20 घंटे के चारों ओर रोटेशन के साथ सेते डिग्री सेल्सियस
    7. 20 मिलीलीटर YPGLU, 30 पर सेते 10 मिनट डिग्री रोटेशन के साथ सी में सीडीएनए पुस्तकालय तब्दील Y187 thawed सेते हैं.
    8. 20 डिग्री सेल्सियस से कम 3,500 rpm पर 5 मिनट के लिए व्यवहार्य Y187 खमीर कोशिकाओं के एक बराबर राशि के लिए इसी pGBKT7 तब्दील AH109 संस्कृति का एक मात्रा अपकेंद्रित्र ध्यान से 10 मिलीलीटर YPGLU में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली वापस ले लें.
    9. Y187 युक्त पुस्तकालय के साथ resuspended AH109 खमीर मिश्रण. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण. 20 पर 3500 rpm पर 5 मिनट डिग्री सेल्सियस, के लिए अपकेंद्रित्र ध्यान से सतह पर तैरनेवाला वापस लेने (नाजुक गोली).
    10. YPGLU में resuspend गोली 1.5 मिलीलीटर की कुल प्राप्त करने के लिए.
    11. बिखरा खमीर YCM-अगार 3 पर 150 मिमी प्लेट, 0.5 मिलीग्राम / प्लेट. 30 में 4.5 घंटा सेते डिग्री सेल्सियस
    12. SD-L/-W/-H के 10 मिलीलीटर में एक रेक गिलास के साथ scraping द्वारा YCM प्लेटों से mated खमीर लीजिए. 5 मिलीलीटर SD-L/-W/-H मध्यम और पूल के साथ प्लेटें दो बार कुल्ला.
    13. 20, 3500 rpm पर 5 मिनट अपकेंद्रित्रडिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 5 मिलीलीटर SD-L/-W/-H माध्यम में खमीर गोली resuspend.
    14. ऑटो सक्रियण परीक्षण में निर्धारित 3 aminotriazole की उचित एकाग्रता (3 एटी) के साथ पूरक SD-L/-W/-H अग्रवाल की 10 प्लेट (0.5 मिलीग्राम / प्लेट) पर mated खमीर बिखरा हुआ है. 6-10 दिनों के लिए एक humidified वातावरण में 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    15. SD-L/-W प्लेटों पर mated खमीर निलंबन के धारावाहिक dilutions के 250 μl (10 -6 से 10 -4) के प्रसार के द्वारा संभोग दक्षता का मूल्यांकन करने के क्रम में द्विगुणित (2n) दर निर्धारित करते हैं. दो दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं. SD-L/-W पर हो कालोनियों गणना, और mated खमीर की प्रारंभिक मात्रा में मौजूद कुल द्विगुणित संख्या परिणाम निकालना. द्विगुणित दर की गणना करने के लिए व्यवहार्य पुस्तकालय युक्त खमीर संख्या के लिए इस द्विगुणित संख्या रिपोर्ट. यह 10-25% के आसपास का चाहिए.
    16. 6-10 दिनों 30 में ऊष्मायन के बाद डिग्री सेल्सियस, ताजा SD-L/-W/-H में mated खमीर कालोनियों + प्लेटें 3 एटी लेने. [टिप: आदेश खमीर 8 की एक योजना मेंयह] अनुक्रमण के लिए बाद में आसान हो जाएगा तो यह है कि एक 96 अच्छी तरह से थाली reproducing 12 कुओं की गलियों. खमीर कालोनियों एक humidified वातावरण में 30 से कम 4-5 दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए हो जाना.
  3. पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा HIS3 सकारात्मक क्लोन की स्क्रीनिंग
    लक्ष्य पीसीआर ओआरएफ चयनात्मक SD-L/-H/-W प्लेटों पर हो खमीर कालोनियों के pACT2 वैक्टर में निहित बढ़ाना है.
    1. बर्फ पर एक साथ 96 पीसीआर थाली रखो.
    2. खमीर कोशिकाओं lyse करने के लिए, 50 μl प्रति अच्छी तरह से एक Zymolase 20T समाधान (10 मिमी HEPES बफर पीएच 7.7 में 2.5 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें.
    3. धीरे प्रति अच्छी तरह से एक कॉलोनी resuspend.
    4. 37 में 95 डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट सेते
    5. बर्फ पर वापस थाली रखो. प्रति अच्छी तरह से आसुत जल का 50 μl जोड़ें. नीचे pipetting और से अच्छी तरह से मिलाएं.
    6. 3500 rpm और 4 में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    7. पीसीआर pACT2 वैक्टर में सीडीएनए से व्युत्पन्न ओआरएफ के दोनों पक्षों annealing प्राइमरों का उपयोग कर एक डालने पता लगाने के लिए 10 μl बढ़ाना. प्रोटोकॉल है जीExTaq पोलीमर्स के साथ 96 lysed खमीर कालोनियों के प्रवर्धन के लिए iven. निम्नलिखित मिश्रण तैयार: 525 μl 10X ExTaq बफर, 420 μl dNTPs मिश्रण (2.5 मिमी), 10.5 μl फॉरवर्ड प्राइमर (1 ग्राम / μl), 10.5 μl रिवर्स प्राइमर (1 ग्राम / μl), 31.5 μl ExTaq (5 यू / μl ) और 3202.5 μl एच 2 0. एक साथ 96 पीसीआर थाली में अच्छी तरह से प्रति मिश्रण के 40 μl बांटो. अच्छी तरह से प्रति lysed खमीर के 10 μl जोड़ें. 7 मिनट के लिए 1 से 4 मिनट के लिए मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस, और 72 के साथ अंत डिग्री सेल्सियस के लिए 30 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 में तो 3 मिनट, 35 चक्रों डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस प्रकार है: प्रवर्धन प्रदर्शन करना. पीसीआर सकारात्मक क्लोन का पता लगाने के लिए एक 1.2% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों की 3 μl चलाएँ. का उपयोग करते हुए पूर्व डाली 96 agarose जैल सिफारिश की है कि ध्यान दें.
      [टिप: थाली कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और नई पीसीआर के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है]
    8. HIS3 सकारात्मक क्लोन से अलग पीसीआर प्रवर्धित टुकड़े अनुक्रम. सेलुलर ओआरएफ की पहचान करने के लिए एक बम विस्फोट विश्लेषण करते हैं. कम आत्मविश्वास संरेखण (ई मूल्य औरजी.टी., 10 -10, पहचान <80%, पेप्टाइड लंबाई <20 अमीनो एसिड) और साथ ही frameshifted खारिज कर रहे हैं और दृश्यों से युक्त समय से पहले बंद codon.

2. हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA के लिए मैट्रिक्स इमारत

हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA दोनों रोगज़नक़ और मेजबान प्रोटीन क्षणिक विभाजन Gaussia princeps luciferase के पूरक टुकड़े के लिए जुड़े हुए व्यक्त कर रहे हैं, जहां एक स्तनधारी सेल आधारित परख है. भागीदारों के संपर्क करने पर, यह एंजाइम अपने enzymatic गतिविधि के उपाय की अनुमति का पुनर्गठन किया गया है. बातचीत तीव्रता इस प्रकार एक सामान्यीकृत Luminescence अनुपात (नीचे देखें और 1 चित्रा) से deduced है

  1. मेजबान सेल भागीदारों का चयन
    1. डाटासेट आत्मविश्वास 9 बढ़ाने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में आगे की मान्यता के लिए Y2H स्क्रीनिंग में अधिक से अधिक तीन बार पहचान कर रहे हैं कि प्रोटीन का चयन करें.
    2. स्थिति के रूप में रोगज़नक़ प्रोटीन के ज्ञात बातचीत भागीदारों जोड़ेंनियंत्रण ve.
  2. हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA संगत वैक्टर में स्थानांतरण
    1. अमीनो एसिड luciferase उनके एन टर्मिनस (gl2 के रोगज़नक़ प्रोटीन fusions) में जुड़े हुए humanized Gaussia princeps की 110-185 साथ रोगज़नक़ प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए एक pSPICA-N2 वेक्टर में प्रत्येक रोगज़नक़ प्रोटीन ओआरएफ क्लोन.
    2. पीसीआर ओआरएफ सीधे Y2H सकारात्मक क्लोन से या अन्य ओआरएफ संसाधन (मानव ORFeome से सेलुलर प्रोटीन बढ़ाना http://horfdb.dfci.harvard.edu/ साथ एन टर्मिनस पर आपस में जुड़े प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए) और pSPICA-N1 वैक्टर में उन्हें स्थानांतरण अमीनो एसिड humanized Gaussia princeps luciferase (GL1 मेजबान प्रोटीन fusions) के 18 से 109.
      [टिप: बड़े पैमाने पर क्लोनिंग के लिए, गेटवे क्लोनिंग प्रणाली की सिफारिश की है. उस मामले में, पीसीआर प्रवर्धन के लिए, गेटवे संगत साइटों को रोकने के लिए बनाया गया प्राइमरों का उपयोग].
    3. अनुक्रम सब अभिव्यक्ति वैक्टर. PSPICA-N1 और pSPICA-N2 के दृश्योंसंदर्भ 8 में पाया जा सकता है.

प्लाज्मिड निर्माणों pSPICA-एन 1 में, यानी रोगजनकों प्रोटीन inversed और मेजबान प्रोटीन pSPICA-N2 में किया जा सकता है कि ध्यान दें.

3. उच्च throughput Gaussia princeps luciferase आधारित प्रोटीन complementation परख (एच टी-GPCA)

  1. सेल अभिकर्मक
    1. एंटीबायोटिक के बिना 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ DMEM के 350,000 कोशिकाओं / एमएल पर बीज 293T कोशिकाओं. / अच्छी तरह से बाँझ सफेद संस्कृति प्लेटों में 100 μl बांटो. एक ही प्रयोग में 10 प्लेटों से अधिक नहीं है. कोशिकाओं 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से कम 24 घंटे के लिए हो जाना.
      [युक्ति:. PSPICA प्लास्मिड एक SV40 मूल होते हैं, 293T कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं में उनकी प्रतिकृति की अनुमति देता है और इस प्रकार दो luciferase टुकड़े की overexpression की ओर जाता है]
    2. अगले दिन, किसी भी उपयुक्त अभिकर्मक प्रोटोकॉल का उपयोग transfect कोशिकाओं. परमाणु, कुछ अभिकर्मक अभिकर्मकों के लिए ध्यान दें किकोशिकाओं वरीयता प्राप्त की mber अनुकूलित किया जा सकता है. 100 एनजी प्रति अच्छी तरह से रोगज़नक़ और मेजबान ओआरएफ प्लाज्मिड निर्माणों दोनों का प्रयोग करें. अभिकर्मक दक्षता के लिए मानक के अनुसार प्लाज्मिड सीएमवी जुगनू luciferase की एक के प्रति अच्छी तरह से सह transfect 10 एनजी. प्रत्येक बिंदु तीन प्रतियों में परीक्षण किया है.
      [युक्ति:. डीएनए घोला जा सकता है चिपकने वाला जवानों के साथ अभिकर्मक पहले दिन प्रदर्शन और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता]
    3. सुसंस्कृत 293T कोशिकाओं की प्लेटों को अभिकर्मक मिश्रण स्थानांतरण. 293T दृढ़ता से पक्षपाती नहीं कर रहे हैं और आसानी से अच्छी तरह से नीचे से अलग रूप में, धीरे कोशिकाओं पर डीएनए मिश्रण जमा करने के लिए सावधान रहें. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24-30 घंटे के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं.
  1. सेल और Gaussia luciferase खुराक
    1. पीबीएस (अच्छी तरह से 100 μl /) के साथ कोशिकाओं को धो लें. 40 μl 1X Renilla lysis बफर जोड़ें. आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    2. एक और सफेद बेनी में सेल lysates के 10 μl सहेजेंजुगनू luciferase गतिविधि के बाद की खुराक के लिए ई. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस या वैकल्पिक रूप से -20 डिग्री सील के साथ सी.
    3. Renilla luciferase परख अभिकर्मक के 100 μl जोड़ने और एक luminometer के साथ 10 सेकंड के लिए luminescence गिनती से सेल lysates के शेष 30μl पर Gaussia गतिविधि को मापने. एक 96 अच्छी तरह से थाली की खुराक के बारे में आधा घंटा लगता है. ठंड या लंबी अवधि के भंडारण बातचीत की मध्यस्थता Gaussia गतिविधि को प्रभावित कर सकता है के बाद से ताजा सेल के अर्क के साथ माप प्रदर्शन.
  1. जुगनू गतिविधि का मापन
    1. जुगनू luciferase परख अभिकर्मक के 50 μl जोड़ने और 10 सेकंड के लिए luminescence गिनती से सेल lysates से बचाया 10 μl पर जुगनू गतिविधि को मापने. एक 96 अच्छी तरह से थाली की खुराक के बारे में आधा घंटा लगता है. [टिप: जुगनू luciferase की खुराक जमी lysates पर दिन के बाद किया जा सकता है.]
  1. NLR गणना
      Gaussia luciferase गतिविधि और खाते अभिकर्मक दक्षता और सेल व्यवहार्यता को ध्यान में रखकर एक सामान्यीकृत Gaussia luminescence के मूल्य प्राप्त करने के लिए जुगनू luciferase गतिविधि के बीच अनुपात की गणना. Triplicates का मतलब की गणना.
    1. बातचीत पर नजर रखने के लिए, प्रत्येक रोगज़नक़ मेजबान जोड़ी के लिए एक सामान्यीकृत Luminescence अनुपात (NLR) का अनुमान है. ऐसा करने के लिए, नियंत्रण कुओं में मापा गतिविधियों का योग (संदर्भ 8 से अनुकूलित चित्रा 1) द्वारा रोगज़नक़ और मेजबान प्रोटीन दोनों की उपस्थिति में पता चला सामान्यीकृत Gaussia luminescence गतिविधि विभाजित करते हैं. सकारात्मक बातचीत के लिए NLR कट ऑफ मूल्य 3.5 8 के आसपास होने का अनुमान किया गया है.
  1. डेटा विश्लेषण
    1. आर आंकड़ा पैकेज का उपयोग पदानुक्रमित क्लस्टरिंग प्रदर्शन करना. सबसे पहले, समूह श्रेणियों में NLR डेटा, तो पूरा लिंकेज विधि का उपयोग कर एक बातचीत dendrogram गणना. इस कल्पनाJavaTreeView 10 के साथ dendrogram. एक पियर्सन सहसंबंध गुणांक का उपयोग कर बातचीत dendrogram और वंशावली पेड़ के बीच दूरी की गणना.
    2. बातचीत नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए, एच टी GPCA डाटासेट से सकारात्मक बातचीत का चयन करें और Cytoscape सॉफ्टवेयर 1 का उपयोग करें. मेजबान प्रोटीन की डिग्री निकालें और नेटवर्क के स्थानीय गतिशीलता का उपयोग करने के लिए अपने वितरण साजिश है. मेजबान रोगजनकों नेटवर्क मेजबान सेलुलर नेटवर्क में रोगज़नक़ प्रोटीन का वैश्विक प्रभाव का मूल्यांकन प्रदान करने के लिए मेजबान interactome को आरोपित किया जा सकता है.
    3. जाओ (जीन आंटलजी) डाटासेट के कार्यात्मक संवर्धन का आकलन करने के लिए डेविड जैव सूचना विज्ञान डेटाबेस 12 के साथ लक्षित सेलुलर कारकों के साथ जुड़े शब्दों निकालें.

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Representative Results

चित्रा 2 में एचपीवी E2 प्रोटीन (संदर्भ 13 से अनुकूलित) के लिए झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी दरों के आकलन से यह साफ के रूप में हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA की एक प्रमुख ताकत, अपने उच्च संवेदनशीलता में निहित है. झूठी नकारात्मक दर निर्धारित करने के लिए, HPV16 से E2 के नाम से जाना जाता बातचीत एचटी-GPCA (2A चित्रा) द्वारा मूल्यांकन किया गया. 18 मुलाकातों के बाहर चार (एक 22% झूठी नकारात्मक दर के लिए इसी) बरामद नहीं किया गया. झूठी सकारात्मक बातचीत सेलुलर प्रोटीन के एक यादृच्छिक सेट (चित्रा 2 बी) के खिलाफ 12 एचपीवी E2 के प्रोटीन का उपयोग कर 5.8% हो मापा गया. इसके अलावा, विधि का मजबूत विशिष्टता E2 है अपने सेल साथी BRD4 के लिए बाध्य करने के मामले में हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन NLR अनुपात (चित्रा -2) annihilates दिखा रहा है कि चित्रा -2 में प्रकाश डाला है.

यह बड़े पैमाने पर तुलनात्मक interactomic दृष्टिकोण हाल ही में सफलतापूर्वक तीन जल्दी समर्थक को लागू किया गया हैमानव papillomaviruses के teins (एचपीवी): tropisms और विकृतियों 13,14 में एचपीवी प्राकृतिक विविधता के विभिन्न जीनोटाइप प्रतिनिधि से होने वाले E2 है, E6 और E7. दृष्टिकोण की मजबूती और बातचीत डेटासेट की योग्यता (संदर्भ 13 और 14 से अनुकूलित चित्रा 3) साबित जल्दी प्रोटीन, बातचीत प्रोफाइल ज्यादातर स्मरण दिलाता है एचपीवी फाइलोजेनी के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग, में से प्रत्येक के लिए. यह इस प्रकार रोगजनन में वायरल प्रोटीन की भागीदारी का सुराग देने, रोग लक्षण के साथ विशिष्ट वायरस मेजबान बातचीत प्रोफाइल के सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जीनोटाइप विशिष्ट बातचीत संभावित रूप में एचपीवी के E6 में प्रोटीन (संदर्भ 14 से अनुकूलित चित्रा 4) के लिए 4 चित्र में दिखाया tropism या रोगजनक बायोमार्कर के अनुरूप है, जो निकाला जा सकता है.

इसके अलावा, कार्यात्मक अंतर्दृष्टि इस तरह बड़े पैमाने पर विश्लेषण से उभर सकता है. उदाहरण के लिए, के interactomic अध्ययन मेंएचपीवी E2 के प्रोटीन, एक वायरल ट्रांसक्रिप्शनल नियामक के रूप में E2 की प्राथमिक भूमिका के साथ लाइन में सेलुलर प्रतिलेखन कारक है, में शामिल एक प्रमुख परिवार की पहचान करने के लिए नेतृत्व कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण. यह भी एचपीवी रोगजनन 13 में E2 की भूमिका के लिए नए दृष्टिकोण खोलने intracellular तस्करी मशीनरी की एक अप्रत्याशित कार्यात्मक लक्ष्यीकरण, का पता चला.

कुल मिलाकर, एचपीवी जल्दी प्रोटीन के साथ प्रदर्शन तुलनात्मक अणु के अध्ययन बहुत प्ररूपी मतभेदों को विशेष बातचीत प्रोफाइल के correlating द्वारा एचपीवी रोगजनन की समझ में सुधार.

चित्रा 1
चित्रा 1. हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA का उपयोग कर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान. दोनों रोगज़नक़ और मेजबान प्रोटीन एक INAC लिए जुड़े हुए हैंGaussia princeps luciferase (gl2 के और GL1 भागों, क्रमशः) के सक्रिय आधा. प्रोटीन बातचीत कर रहे हैं, एक luciferase गतिविधि एंजाइम के दोनों हिस्सों की निकटता से प्रेरित है. संदर्भ 8 से अनुकूलित सही. चित्र पर दिखाया के रूप में बहाल Gaussia luciferase गतिविधि एक सामान्यीकृत Luminescence अनुपात (NLR) से गणना की है. यहां क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने के लिए .

चित्रा 2
चित्रा 2. हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA विशेषताओं. (ए) HPV16 और सेलुलर प्रोटीन से E2 के प्रोटीन से जुड़े साहित्य से निकाले 18 बातचीत इस टी के साथ जुड़े झूठी नकारात्मक दर का अनुमान लगाने के क्रम में हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA द्वारा परीक्षण किया गया echnique. NLR अनुपात नीला (मजबूत बातचीत) प्रकाश में काला (कोई बातचीत) से एक पैमाने के साथ एक रंग ढाल (गर्मी नक्शा) के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. चार ज्ञात बातचीत के 22% के आसपास झूठी नकारात्मक दर का एक मोटा अनुमान दे (लाल तीर) बरामद नहीं किया गया. (बी) 12 एचपीवी E2 प्रोटीन 5.8% के आसपास रन बनाए जो हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA की झूठी सकारात्मक दर निर्धारित करने के लिए, एक प्राथमिकताओं नकारात्मक बातचीत के लिए इसी 10 बेतरतीब ढंग से उठाया सेलुलर प्रोटीन, के साथ परीक्षण किया गया. (सी) BRD4 सेलुलर प्रोटीन और HPV16 या HPV18 E2 के प्रोटीन के बीच बातचीत क्रमशः अमीनो एसिड I73 और I77 पर निर्भर करने के लिए जाना जाता है. इन अमीनो एसिड उत्परिवर्तित रहे हैं, एच टी GPCA NLR बातचीत का पता लगाने के लिए एक उच्च विशिष्टता का प्रदर्शन एक 5 समय की कमी के साथ चला जाता है. संदर्भ 13 से अनुकूलित चित्रा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

jove_content "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 3
चित्रा 3. प्रयोगात्मक बातचीत आधारित dendrograms और एचपीवी वंशावली पेड़ों के बीच तुलना. जल्दी प्रोटीन ई 2 (ए), E6 (बी) या E7 (सी) के दृश्यों पर आधारित एचपीवी के फाइलोजेनी प्रत्येक ग्राफ की बाईं तरफ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. इंटरेक्शन dendrograms प्रत्येक प्रोटीन की बातचीत प्रोफाइल के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग द्वारा प्राप्त किया गया है और सही पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. एक महत्वपूर्ण अनुरूपता बातचीत डेटासेट की योग्यता साबित, रोग प्रकार (रंगीन आयतों) के समान क्लस्टरिंग के साथ, दोनों पेड़ प्रकार के बीच मनाया गया. चित्रा संदर्भ 13 और 14 से रूपांतरित किया. बड़ा अंजीर देखने के लिए यहां क्लिक करेंure.

चित्रा 4
4 चित्रा. E6 मुख्य सेलुलर लक्ष्य की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. सेलुलर लक्ष्य बातचीत तीव्रता के आधार पर क्रमबद्ध और बातचीत एचपीवी प्रकार के अनुसार वर्गीकृत किया गया. इस प्रतिनिधित्व ऐसी oncogenic एचपीवी के E6 में प्रोटीन के साथ ही सूचना का आदान प्रदान जो FADD, के रूप में विशिष्ट बायोमार्कर की पहचान की अनुमति देता है. इस तरह लक्ष्यीकरण सभी oncogenic एचपीवी के कासीनजन विशेषता के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और इस प्रकार या तो एचपीवी संक्रमण के लिए एक किराए मार्कर के रूप में या एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक अच्छे उम्मीदवार का गठन किया. संदर्भ 14 से अनुकूलित चित्रा.

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Discussion

स्वतंत्र रूप से, खमीर दो ऐसे जीएसटी पुल से नीचे, Lumier या MAPPIT के रूप में संकर और स्तनधारी बातचीत assays है,, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए प्रभावी औजार साबित किया है, लेकिन झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक की उच्च दर से सीमित हैं बातचीत इन तकनीकों का 15 के साथ जुड़े. इसके अलावा, सबूत ओर्थोगोनल विधियों के संयोजन प्राप्त बातचीत डाटासेट 7 की विश्वसनीयता बढ़ जाती है कि बढ़ रही है. हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA तकनीक की हाल ही में विकास स्तनधारी कोशिकाओं में द्विआधारी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार हुआ है न केवल, लेकिन यह भी एक ही बार में बातचीत की एक बड़ी राशि को संभालने के लिए संभावना की पेशकश की है यहाँ का वर्णन किया.

यहाँ वर्णित रणनीति कई तनाव वेरिएंट की बातचीत की जांच करने से व्यक्ति Y2H स्क्रीनिंग की कवरेज को बेहतर बनाता है. इसके अलावा, एक orthogonal विधि का पता लगाने के साथ बातचीत retesting कड़े तुलनात्मक बातचीत प्रदान करता हैसीमाओं पर काबू पाने और दो संकर पद्धति के लिए निहित कलाकृतियों से बचने के द्वारा मोर्चे डेटासेट. हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA स्तनधारी कोशिकाओं में जगह लेता के बाद दरअसल, बाद translational संशोधनों और प्रोटीन की प्राकृतिक subcellular स्थानीयकरण अप्रभावित रहे हैं. हमारा दृष्टिकोण इस प्रकार मुख्य रूप से खमीर बातचीत संवेदन 4 के लिए दो संकर के आधार पर उन लोगों की तुलना में जब सुधार कर रहे हैं कि एक भी कदम बातचीत नक्शे में उत्पादन कर सकते हैं.

बातचीत का पता लगाने झिल्ली के दोनों तरफ Gaussia टुकड़े के स्थानीयकरण पर निर्भर हो सकता है के बाद से हालांकि इस बिंदु पर, हम पार झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करते समय सावधान किया जा रहा सिफारिश करेंगे. इन मामलों में, यह एक के सी टर्मिनल अंत या दोनों भागीदारों में Gaussia टुकड़े फ्यूज करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अतिरिक्त, luciferase अभिव्यक्ति ऐसी अभिकर्मक दक्षता और सेल नंबर के रूप में कई मापदंडों से प्रभावित हो सकता है. इसलिए, हम दृढ़ता से foll सिफारिश करेंगेकारण सामान्य बनाने की प्रक्रिया खाते प्रयोगात्मक रूपों में लेने के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है.

मानव ORFeome की बढ़ती संग्रह से लिया ओआरएफ के आदेश दिए सरणियों का उपयोग करके, हम हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA एक स्क्रीनिंग पद्धति के रूप में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां निकट भविष्य में एक बिंदु की उम्मीद है. प्रत्येक प्रोटीन जोड़े तो परीक्षण किया है, और दूसरा हो जाएगा के बाद से यह पहली बार काफी स्क्रीनिंग कवरेज में सुधार करना चाहिए, यह स्वचालन की सुविधा चाहिए. हालांकि, इस परख की एक और अधिक कठोर उच्च throughput विस्तार मानव कोशिका निष्कर्षों के आधार पर इन विट्रो अभिव्यक्ति प्रणालियों में उपयोग कर इन विट्रो एचटी-GPCA परख में एक के विकास द्वारा लाया जाना चाहिए. यह भी एक नियंत्रित जैव रासायनिक वातावरण में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की निगरानी करने में सक्षम होना चाहिए.

अन्त में, आगामी घटनाक्रम जीवित कोशिकाओं में परिसर की मध्यस्थता luminescence के दृश्य में सुधार की उम्मीद कर रहे हैं. उस मामले में, एच टी GPCA हो सकता हैइस प्रकार एक बातचीत के विघटन का जीना निगरानी की अनुमति दवाओं या जटिल inhibitors के अलावा के संदर्भ में गतिशील बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया.

सभी में, इस दृष्टिकोण रोगज़नक़ मेजबान परस्पर क्रिया की किसी भी अध्ययन के लिए एक कुशल रूपरेखा का गठन किया और हम तुलनात्मक interactome विश्लेषण मेजबान कोशिकाओं के अपहरण सूक्ष्म जीव को समझने के लिए एक ठोस रूपरेखा प्रदान कर सकता है कि लग रहा है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम Institut पाश्चर से धन के द्वारा और लीग Nationale contre ले कैंसर (अनुदान R05/75-129 और RS07/75-75), एसोसिएशन डालना ला Recherche सुर ले कैंसर (/ अनुदान एआरसी A09 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया 1/5031 और 4867), और Agence Nationale डे ला Recherche (ANR07 माइम 009 02 और ANR09 चेहरे का भाव 026 01). एम.एम. एक MENRT फैलोशिप के प्राप्तकर्ता था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains Clontech
Minimal SD base US biological D9500
Amino acids Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Acros organics 264571000
Zymolase Seikagaku 120491
DMEM Gibco-Life Technologies 31966
Fetal bovine serum BioWest S1810
Phosphate buffer Saline (PBS) Gibco-Life Technologies 14190
Penicillin-Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies 25300
Renilla luciferase assay Promega E2820
White culture plate Greiner Bio-One 655083
96-wellPCR plates 4titude 4t-i0730/C
Incubator (30 °C) Memmert
Incubator (37 °C) Heraeus
Luminometer Berthold Centro XS-LB 960

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References

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Muller, M., Cassonnet, P., Favre, M., Jacob, Y., Demeret, C. A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (77), e50404, doi:10.3791/50404 (2013).

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