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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Published: July 18, 2013 doi: 10.3791/50404
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,3, 1
1Unité de Génétique, Papillomavirus et Cancer Humain (GPCH), Institut Pasteur, 2Cellule Pasteur, Université Sorbonne Paris Cité, 3Center for Cancer Systems Biology (CCSB), Harvard Medical School, Department of Cancer Biology, Dana Farber Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.

Abstract

Esfuerzos importantes se reunieron para generar mapas de la red de interacción proteína-proteína a gran escala completa. Esto es fundamental para entender las relaciones patógeno-huésped y se realizó esencialmente mediante cribados genéticos en sistemas de levadura de dos híbridos. La reciente mejora de la detección de la interacción proteína-proteína mediante un ensayo de complementación de fragmento de luciferasa basado en Gaussia ahora ofrece la oportunidad de desarrollar enfoques integradores interactomic comparativos necesarios para comparar rigurosamente perfiles de interacción de proteínas a partir de diferentes variantes de cepas de patógenos contra un conjunto común de factores celulares.

Este documento se centra específicamente en la utilidad de la combinación de dos métodos ortogonales para generar proteína-proteína interacción bases de datos: la levadura de dos híbridos (Y2H) y un nuevo ensayo, de alto rendimiento ensayo de complementación proteica princeps Gaussia (HT-GPCA) realizado en células de mamífero.

nt "> Una identificación a gran escala de socios celulares de una proteína de patógeno se realiza en el apareamiento basado en proyecciones levadura de dos híbridos de bibliotecas de ADNc utilizando múltiples variantes de cepas de patógenos. Un subconjunto de socios que interactúan seleccionados en una puntuación alta confianza estadística es aún más validado en células de mamíferos para interacciones por pares con todo el conjunto de variantes de proteínas de patógenos utilizando HT-GPCA. Esta combinación de dos métodos complementarios mejora la robustez del conjunto de datos de interacción, y permite la realización de un análisis de la interacción comparativa estrictas. Tales interactómica comparativos constituye una estrategia fiable y potente para descifrar cualquier interplays patógeno-hospedador.

Introduction

La creciente cantidad de datos recogidos para generar mapas de interacción proteína-proteína abre perspectivas para entender mejor las infecciones por patógenos. Como comprensión global de las infecciones de patógenos comienza a emerger, que proporciona acceso a la gama de las perturbaciones inducidas por las proteínas de patógenos cuando se conecta el proteoma humano 1. Es de este modo ofrece una manera de comprender cómo patógenos manipulan la maquinaria de la célula huésped. En particular, la asignación de varias redes de interacción virus-huésped reveló que las proteínas virales se dirigen preferentemente proteínas del huésped que son altamente conectados en la red celular (hubs), o que son fundamentales para muchos caminos en una red (proteínas cuellos de botella) 2-4. Estas interacciones permiten que los virus para manipular los procesos celulares importantes, que es fundamental para replicar y producir una progenie infecciosa. Mapeo de interacciones comparativo se llevó a cabo recientemente sobre los virus relacionados con el objetivo de extraer información relativa apatogénesis 4. Por otra parte, los estudios de la interacción huésped-patógeno paisaje se han extendido a muchos patógenos 5. La identificación de factores de células objetivo proporciona información detallada sobre las estrategias utilizadas por los patógenos de infectar las células y permite la detección de posibles marcadores patógenos.

La levadura de dos sistema híbrido es el método más popular para identificar las interacciones binarias desde la detección genética es una herramienta eficaz y sensible para la cartografía de alto rendimiento de las interacciones proteína-proteína. El enfoque que aquí se propone mejora aún más proyecciones Y2H individuales mediante la evaluación de una proteína de múltiples variantes de cepas patógenos, proporcionando así acceso a una visión comparativa de patógeno-huésped interacciones proteína-proteína. Por otra parte, una limitación importante de la levadura de dos híbridos se encuentra en una alta tasa de falsos negativos, ya que se recupera aproximadamente el 20% de las interacciones totales 6. Esto implica que las interacciones detectadas con sólo un subconjunto de patogens variantes podrían haber escapado a la detección con los otros. Por lo tanto, los socios individuales emergentes de todas las pruebas de detección de dos híbridos se enfrentan al reto aún más para la interacción con la gama completa de cepas estudiadas, proporcionando interacción de datos comparativos. Desde que se demostró que la combinación de diferentes metodologías aumenta fuertemente la solidez de la interacción proteína-proteína conjuntos de datos 7, esta validación se lleva a cabo en células de mamífero por un ensayo de complementación de proteínas-fragmento recién desarrollada llamada HT-GPCA 8. Este sistema basado en células permite la detección de interacciones de proteínas mediante la complementación de la luciferasa Gaussia princeps dividida y ha sido diseñado para ser compatible con un formato de alto rendimiento. Gracias a su tecnología de luminiscencia con sede y su bajo nivel de ruido de fondo en comparación con otro ensayo basado en la fluorescencia, HT-GPCA muestra sorprendentemente alta sensibilidad.

En general, este enfoque constituye un eficienteherramienta para generar un mapeo exhaustivo de interplays huésped-patógeno, lo que representa el primer paso hacia una comprensión global de los secuestros célula huésped.

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Protocol

1. Levadura de dos híbridos Screenings

  1. Haga las siguientes soluciones requeridas:
    1. Fuera de la gota sintético completo (SD): se disuelven 26,7 g de base mínima SD con glucosa en 1 L de agua. Añadir 2 g de mezcla de aminoácidos preparada como sigue: 2 g de hemisulfato de adenina, 2 g Arginina HCl, HCl 2 g Histidina, Isoleucina 2 g, 4 g Leucina, Lisina HCl 2 g, 2 g Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g de L -serina, 2 g de L-Treonina, Triptófano 3 g, 2 g de tirosina, 1,2 g de uracilo, 9 g Valina.
    2. Gota selectivo Salida SD-L/-W/-H: SD que contiene cada aminoácidos esenciales, excepto los especificados (-L-leucina,-W:-triptófano;-H:-histidina).
    3. YPGLU: Por 1 L, peso 10 g de extracto de levadura, 10 g de Bacto peptona y 20 g de glucosa. Completo con 25 g Bacto agar de medio sólido.
    4. YCM: Igual que YPGLU, pero el pH se ajustó a 4,5.
  2. El apareamiento y la difusión
    1. Use alícuotas congeladas de pre-transformed cepa de levadura Y187 (tipo de apareamiento α) que contiene una biblioteca de ADNc clonado en pACT2. Comprobar la viabilidad celular en placas diluciones seriadas en placas SD-L.
    2. Clonar la ORF patógeno en pGBKT7 vector, y transformar el plásmido recombinante utilizando un procedimiento estándar en la cepa de levadura AH109 (un tipo de apareamiento).
    3. Spread pGBKT7-transformó AH109 levaduras en placas SD-W. Incubar al menos dos días 30 ° C en un incubador humidificado. Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta que el cribado de dos híbridos.
    4. Use 3-aminotriazol (3-AT), un inhibidor competitivo de la enzima HIS3, para contrarrestar el potencial de auto-transactivación del gen informador HIS3 por las proteínas de los agentes patógenos. Realizar una prueba de la activación automática mediante la determinación de la concentración de 3-AT, lo que impide el crecimiento de la levadura pGBKT7-transformado en placas SD-W/-H.
    5. Seed 30 ml de SD-W con pocas colonias de pGBKT7 transformada AH109. Incubar 30 horas a 30 ° C con rotación.
    6. Seed 200 ml de SD-W con el 30 mlAH109 de las culturas. Incubar con rotación alrededor de 20 horas a 30 ° C.
    7. Incubar descongelado biblioteca de ADNc-Y187 transformada en 20 ml YPGLU, incubar 10 min a 30 ° C con rotación.
    8. Centrifugar un volumen de pGBKT7-transformado AH109 cultura correspondiente a una cantidad equivalente de células viables de levadura Y187 durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante y se resuspende el precipitado en 10 ml YPGLU.
    9. Mezclar la levadura AH109 resuspendido con Y187 biblioteca que contiene. La transferencia en un tubo de 50 ml. Se centrifuga durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C, retirar cuidadosamente el sobrenadante (frágil sedimento).
    10. Resuspender el pellet en YPGLU conseguir un total de 1,5 ml.
    11. Levadura Spread a 3 YCM-agar placas de 150 mm, 0,5 ml / placa. Incubar 4,5 horas a 30 ° C.
    12. Recoger levadura acoplado de placas YCM por raspado con un vaso en el rastrillo de 10 ml de SD-L/-W/-H. Lavar las placas dos veces con 5 ml de medio de SD-L/-W/-H y piscina.
    13. Centrifugar 5 min a 3500 rpm, 20° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de levadura en 5 ml de medio SD-L/-W/-H.
    14. Extienda la levadura acoplado a 10 placas (0,5 ml / placa) de Agar SD-L/-W/-H complementado con la concentración adecuada de 3-aminotriazol (3-AT) obtenido en la prueba de activación automática. Incubar a 30 ° C en un ambiente humidificado durante 6-10 días.
    15. Determinar la tasa de diploide (2n) con el fin de evaluar la eficiencia de acoplamiento mediante la difusión de 250 l de diluciones en serie (10 -4 a 10 -6) de la suspensión de levadura se aparearon en placas SD-L/-W. Incubar las placas a 30 ° C durante dos días. Recuento de las colonias cultivadas en SD-L/-W, y deducir el número total diploide presente en el volumen inicial de la levadura acoplado. Señalar este número diploide de levadura número biblioteca que contiene viable para calcular la tasa de diploide. Se debe oscilar alrededor de 10-25%.
    16. 6-10 días después de la incubación a 30 ° C, recoger las colonias de levadura se aparearon en SD-L/-W/-H fresca + 3-AT placas. [Sugerencia: Para la levadura en un esquema de 8carriles de 12 pozos que reproducen una placa de 96 pocillos de manera que será más fácil después para la secuenciación]. Deje colonias de levaduras crecen durante 4-5 días a 30 ° C en un ambiente humidificado.
  3. La detección de his3 clones positivos por PCR y secuenciación
    El objetivo es para amplificar por PCR la ORF contenida en los pACT2 vectores de colonias de levaduras cultivadas en placas de SD-L/-H/-W selectivos.
    1. Coloque una placa de PCR 96 en el hielo.
    2. Para lisar las células de levadura, añadir 50 l por pocillo de una solución 20T zimolasa (2,5 mg / ml en 10 mM de tampón HEPES de pH 7,7).
    3. Resuspender una colonia por pocillo.
    4. Incubar 15 min a 37 ° C y 15 min a 95 ° C.
    5. Ponga la placa posterior en el hielo. Añadir 50 l de agua destilada por pocillo. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
    6. Centrifugar durante 5 min a 3500 rpm y 4 ° C.
    7. 10 l amplificar por PCR para detectar un inserto usando cebadores de recocido ambos lados de la ORF derivados de cDNA en vectores pACT2. El protocolo es gado para la amplificación de 96 colonias de levadura lisadas con el ExTaq polimerasa. Preparar la siguiente mezcla: 525 l 10X tampón ExTaq, 420 l de la mezcla dNTP (2,5 mM), 10,5 l Cebador directo (1 g / l), 10,5 cebador inverso l (1 g / l), 31,5 l ExTaq (5 U / l ) y 3202,5 ​​l H 2 0. Distribuir 40 l de la mezcla por pocillo en una placa de PCR de 96. Añadir 10 l de levadura lisada por pocillo. Realizar la amplificación de la siguiente manera: 94 ° C durante 3 min, luego 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 4 min, y al final con 72 ° C durante 7 min. Ejecutar 3 l de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,2% para detectar los clones positivos por PCR. Tenga en cuenta que el uso de pre-molde 96 también se recomienda geles de agarosa.
      [Sugerencia: placa puede ser almacenado a -20 ° C durante unos meses y volver a utilizar para el nuevo PCR]
    8. Secuencia de los fragmentos de PCR amplificados a partir de aislados HIS3 clones positivos. Realizar un análisis BLAST para identificar celular ORF. Alineaciones de baja confianza (E valor ygt; 10 -10, la identidad <80%, longitud de péptido <20 aminoácidos) se descartan, así como frameshifted y prematuro codón de parada que contiene secuencias.

2. Edificio Matriz para HT-GPCA

HT-GPCA es un ensayo basado en células de mamífero que ambas proteínas de patógenos y de acogida se expresan transitoriamente fusionado con fragmentos complementarios de la división Gaussia princeps luciferasa. Tras la interacción de los socios, esta enzima se reconstituye lo que permite la medida de su actividad enzimática. La intensidad de la interacción es por lo tanto deducir de una Relación de Luminiscencia normalizado (véase más adelante y la Figura 1)

  1. Selección de los socios de células huésped
    1. Seleccione las proteínas que se identifican más de tres veces en los exámenes Y2H para una validación adicional de las células de mamíferos para aumentar la confianza de conjunto de datos 9.
    2. Agregar socios que interactúan conocidas de las proteínas de patógenos como positiVE controles.
  2. Traslado en vectores compatibles HT-GPCA
    1. Clonar cada patógeno proteína ORF en un vector pSPICA-N2 para generar proteínas de patógenos con los aminoácidos 110-185 de la princeps Gaussia humanizados luciferasa fusionado en su extremo N-terminal (GL2-patógeno fusiones de proteínas).
    2. Amplificar por PCR proteína celular ORF directamente a partir de los clones positivos Y2H o desde otros recursos de ORF (ORFeome humano http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) y transferir en vectores pSPICA-N1 para generar proteínas fusionadas en el extremo N-terminal con los 18 aminoácidos a 109 de humanizado Gaussia princeps luciferasa (fusiones de proteínas GL1-huésped).
      [Sugerencia: Para la clonación a gran escala, se recomienda el sistema de clonación Gateway. En ese caso, para la amplificación por PCR, utilizar cebadores diseñados para contener sitios compatibles de puerta de enlace].
    3. Secuencia de todos los vectores de expresión. Las secuencias de la pSPICA-N1 y N2-pSPICAse pueden encontrar en la referencia 8.

Tenga en cuenta que construcciones de plásmidos pueden ser invertidas, es decir, las proteínas de patógenos en pSPICA-N1 y proteínas del huésped en pSPICA-N2.

3. High-Throughput Gaussia princeps luciferasa basado en ensayo de complementación de proteínas (HT-GPCA)

  1. Transfección celular
    1. Seed células 293T en 350.000 células / ml de DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) sin antibióticos. Distribuir 100 l / pocillo en placas de cultivo blancos estériles. No exceder de 10 placas en un solo experimento. Deje que las células crezcan durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO 2.
      [Consejo:. Dado que los plásmidos pSPICA contienen un origen de SV40, el uso de las células 293T permite su replicación en las células transfectadas y por lo tanto conduce a la sobreexpresión de los dos fragmentos de luciferasa]
    2. El día siguiente, las células transfectar utilizando cualquier protocolo de transfección adecuado. Tenga en cuenta que para ciertos reactivos de transfección, la number de células sembradas puede tener que ser adaptada. Use 100 ng por pocillo de tanto el patógeno y anfitrión ORF construcciones de plásmidos. Co-transfectar 10 ng por pocillo de una de CMV-Firefly plásmido para normalizar la eficiencia de transfección de luciferasa. Cada punto se analizó por triplicado.
      [Consejo:. Mezclas de ADN se pueden realizar el día antes de la transfección y se almacenaron a -20 ° C con juntas adhesivas]
    3. Transferir la mezcla de transfección a las placas de las células 293T cultivadas. Tenga cuidado para depositar suavemente la mezcla de ADN en las células, como 293T no son fuertemente adherente y se desprenden fácilmente de la parte inferior del pozo. Incubar en una incubadora de cultivo celular durante 24-30 horas a 37 ° C con 5% de CO 2.
  1. La lisis celular y la dosis luciferasa Gaussia
    1. Lavar las células con PBS (100 l / pocillo). Añadir 40 l de tampón de lisis 1X de Renilla. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente con agitación.
    2. Ahorra 10 l de lisados ​​celulares en otra plataforma blancade correo para su posterior dosificación de la actividad luciferasa de luciérnaga. Almacenar a 4 ° C o, alternativamente, a -20 ° C con sellado.
    3. Medir la actividad Gaussia en los restantes 30μl de lisados ​​de células mediante la adición de 100 l de reactivo de ensayo de luciferasa de Renilla y contando luminiscencia durante 10 s con un luminómetro. Dosis de una placa de 96 tarda aproximadamente media hora. Realizar la medición con extractos de células frescas ya que el almacenamiento de congelación o largo plazo puede afectar la actividad Gaussia interacción mediada.
  1. Medición de la actividad Firefly
    1. Medir la actividad de luciérnaga en el salvado 10 l de lisados ​​de células mediante la adición de 50 l de reactivo de ensayo de luciferasa de luciérnaga y el recuento de luminiscencia durante 10 s. Dosis de una placa de 96 tarda aproximadamente media hora. [Consejo: La dosis de luciferasa de luciérnaga se puede realizar al día siguiente en lisados ​​congelados.]
  1. Cálculos NLR
      Gaussia y la actividad de luciferasa de luciérnaga para obtener un valor de luminiscencia Gaussia normalizado teniendo en cuenta la eficiencia de transfección y la viabilidad celular. Calcular la media de los triplicados.
    1. Para supervisar la interacción, estimar un Ratio Normalizada luminiscencia (NLR) para cada par patógeno-huésped. Para ello, se divide la actividad de luminiscencia Gaussia normalizada detectada en presencia de ambos patógenos y proteínas del huésped por la suma de las actividades medidas en los pocillos de control (Figura 1 adaptada de la referencia 8). El NLR valor de corte para las interacciones positivas ha sido estimada en alrededor de 3,5 8.
  1. Análisis de los datos
    1. Realizar agrupación jerárquica utilizando el paquete estadístico R. En primer lugar, agrupar los datos NLR en categorías, y luego calcular un dendrograma interacción utilizando el método de ligamiento completo. Visualice estedendrograma con JavaTreeView 10. Calcular la distancia entre la interacción dendrograma y el árbol filogenético utilizando un coeficiente de correlación de Pearson.
    2. Para generar redes de interacción, seleccione las interacciones positivas del conjunto de datos HT-GPCA y utilizar el software Cytoscape 1. Extraer los grados de las proteínas del huésped y trazar su distribución para acceder a la dinámica local de la red. Redes Huésped-patógeno se pueden superponer a la interactome anfitrión para proporcionar una evaluación del impacto global de las proteínas de patógenos en la red celular del huésped.
    3. Extraiga el GO (Gene Ontología) términos relacionados con los factores celulares específicos con la base de datos de bioinformática DAVID 12 para evaluar el enriquecimiento funcional del conjunto de datos.

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Representative Results

Una de las principales de HT-GPCA radica en su alta sensibilidad, como lo demuestra la evaluación de las tasas de falsos positivos y falsos negativos para la proteína E2 del VPH en la Figura 2 (adaptado de la referencia 13). Para determinar la tasa de falsos negativos, interacciones conocidas de E2 de HPV16 fueron evaluados por HT-GPCA (Figura 2A). Cuatro de cada 18 interacciones no fueron recuperados (que corresponde a una tasa de falsos negativos del 22%). Las interacciones positivas falsas se midieron a ser 5,8% utilizando proteínas E2 del VPH 12 en contra de un conjunto aleatorio de las proteínas celulares (Figura 2B). Además, la fuerte especificidad del método se pone de relieve en la Figura 2C que muestra que una mutación único punto conocido para interferir con la unión de E2 a su socio de células BRD4 aniquila la relación de NLR (Figura 2C).

Este enfoque interactomic comparativo a gran escala ha sido recientemente aplicado con éxito a tres pro tempranaproteínas de los virus del papiloma humano (VPH): E2, E6 y E7 procedentes de diferentes genotipos representativos de la diversidad natural del VPH en tropismos y patologías 13,14. Para cada una de las proteínas tempranas, la agrupación jerárquica de los perfiles de interacción principalmente recapitula la filogenia del VPH, lo que demuestra la solidez del enfoque y la pertinencia de la interacción de datos (Figura 3 adaptado de las referencias 13 y 14). Se puede utilizar para correlacionar los perfiles específicos de interacción virus-huésped con rasgos patológicos, dando así pistas de la participación de las proteínas virales en la patogénesis. Interacciones genotipo-específicos pueden ser extraídos, lo que potencialmente se corresponde con tropismo o patógenos biomarcadores como se muestra en la Figura 4 para las proteínas E6 de HPV (Figura 4 adaptada de la referencia 14).

Por otra parte, las ideas funcionales pueden surgir de este tipo de análisis a gran escala. Por ejemplo, en el estudio de interactomiclas proteínas E2 del VPH, el análisis funcional de enriquecimiento dado lugar a la identificación de una prominente familia que consiste en los factores de transcripción celular, de acuerdo con la función principal de E2 como un regulador de la transcripción viral. También reveló una orientación funcional inesperada de la maquinaria tráfico intracelular, abriendo nuevas perspectivas para el papel de E2 en la patogénesis del VPH 13.

En general, los estudios comparativos realizados con interatómicas las proteínas tempranas de VPH mejorar en gran medida la comprensión de la patogénesis de VPH mediante la correlación de los perfiles de las interacciones específicas a las diferencias fenotípicas.

Figura 1
Figura 1. Identificación de las interacciones proteína-proteína usando HT-GPCA. Tanto patógeno y proteínas de acogida están fusionados a un inacmedio tiva de la luciferasa Gaussia princeps (GL1 y GL2 partes, respectivamente). Cuando las proteínas están interactuando, una actividad de la luciferasa se ​​induce por la proximidad de las dos mitades de la enzima. La actividad de la luciferasa Gaussia restaurada se calcula a partir de una Relación de Luminiscencia Normalizado (NLR) como se muestra a la derecha. Figura adaptada de la referencia 8. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. Características HT-GPCA. (A) 18 interacciones extraídos de la literatura que implica la proteína E2 de HPV16 y las proteínas celulares se ensayaron por HT-GPCA con el fin de estimar la tasa de falsos negativos asociados con este t echnique. La relación NLR se representan como un degradado de color (mapa de calor), con una escala de negro (sin interacción) a la luz (interacción fuerte) azul. Cuatro interacciones conocidas no fueron recuperados (flechas rojas), dando una estimación aproximada de la tasa de falsos negativos en torno a 22%. (B) 12 proteínas E2 de HPV fueron probados con 10 proteínas celulares recogidos al azar, correspondientes a las interacciones negativas a priori, con el fin de determinar la tasa de falsos positivos de la HT-GPCA, que obtuvo alrededor de 5,8%. (C) La interacción entre la proteína celular BRD4 y HPV16 o HPV18 proteínas E2 se sabe para depender de los aminoácidos I73 y I77, respectivamente. Cuando se mutan estos aminoácidos, el HT-GPCA NLR baja con un descenso del 5-tiempo que demuestra una alta especificidad para detectar interacciones. Figura adaptada de la referencia 13. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 3
Figura 3. Comparación entre dendrogramas interacción basados ​​experimentales y VPH árboles filogenéticos. La filogenia de VPH sobre la base de las proteínas E2 temprano (A), E6 (B) o E7 (C) secuencias están representadas a la izquierda de cada gráfica. Dendrogramas de interacción se obtuvieron por la agrupación jerárquica de los perfiles de interacción de cada proteína y se representan a la derecha. Se observó una concordancia significativa entre los dos tipos de árboles, con la agrupación similar de los tipos patológicos (rectángulos de color), lo que demuestra la pertinencia de los datos de interacción. Figura adaptada de las referencias 13 y 14. Haga clic aquí para ver más grande la figuraure.

Figura 4
La Figura 4. Representación esquemática de los principales objetivos celulares E6. Objetivos celulares se ordenan en función de la intensidad de la interacción y se agrupan según el tipo de VPH que interactúan. Esta representación permite la identificación de biomarcadores específicos, tales como FADD, que interactúa sólo con las proteínas E6 de HPV oncogénico. Esta focalización debe ser crucial para el rasgo carcinogénico de todas VPH oncogénico y por lo tanto constituye un buen candidato para ser utilizado ya sea como un marcador sustituto para la infección por VPH o como una diana terapéutica. Figura adaptada de la referencia 14.

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Discussion

Independientemente, la levadura y dos ensayos de interacción de híbridos y de mamíferos, tales como GST pull-down, o LUMIER Mappit, han demostrado ser instrumentos eficaces para la detección de interacciones proteína-proteína, pero se ven limitados por la alta tasa de falsos positivos y falsos negativos interacciones asociadas con estas técnicas 15. Por otra parte, crece la evidencia de que la combinación de métodos ortogonales aumenta la fiabilidad de la interacción obtenido conjunto de datos 7. El reciente desarrollo de la técnica de HT-GPCA descrito aquí no sólo ha mejorado la sensibilidad de detección de la interacción proteína-proteína binario en células de mamífero, sino que también ha ofrecido la posibilidad de manejar una gran cantidad de interacciones a la vez.

La estrategia aquí descrita mejora la cobertura de proyecciones Y2H individuales probando las interacciones de múltiples variantes de cepas. Por otra parte, volver a probar las interacciones con un método de detección ortogonal proporciona estrictas interacción comparativación conjuntos de datos, por la superación de las limitaciones y escapar artefactos inherentes a la metodología de dos híbridos. En efecto, desde HT-GPCA se lleva a cabo en células de mamífero, las modificaciones post-traduccionales y la localización subcelular de las proteínas naturales no se ven afectados. Nuestro enfoque puede pues producir en un solo paso mapas de interacción que se mejoran en comparación con los que se basan principalmente en la levadura de dos híbridos para la interacción de detección 4.

En este punto, aunque, recomendaríamos teniendo cuidado al estudiar las proteínas trans-membrana, ya que la detección de las interacciones puede depender de la localización de los fragmentos de Gaussia a ambos lados de la membrana. En estos casos, podría ser necesario para fundir los fragmentos de Gaussia en el extremo C-terminal de uno o ambos socios. Además, la expresión de la luciferasa podría estar influenciada por numerosos parámetros tales como la eficiencia de la transfección y el número de células. Por lo tanto, le recomendamos encarecidamente folldebido al procedimiento de normalización se describe en la sección de protocolo con el fin de tener en cuenta las variaciones experimentales.

Mediante el uso de matrices ordenadas de ORF tomadas de la creciente colección de la ORFeome humano, prevemos un punto en el futuro cercano donde HT-GPCA podría ser utilizado directamente como un método de cribado. Esto debe primero mejorar drásticamente la cobertura del tamizaje, ya que cada pares de proteínas entonces se pondrá a prueba, y segundo, se debe facilitar la automatización. Sin embargo, una expansión más drástica de alto rendimiento de este ensayo debe ser llevado por el desarrollo de un ensayo in vitro de HT-GPCA utilizando en sistemas de expresión in vitro basado en extractos de células en humanos. Esto también debe permitir a monitorear las interacciones proteína-proteína en un entorno bioquímico controlada.

Por último, se espera que los próximos desarrollos para mejorar la visualización de la luminiscencia mediada por complejos en las células vivas. En ese caso, el HT-GPCA podría serutilizado para detectar interacciones dinámicas en el contexto de la adición de fármacos o inhibidores de complejos, permitiendo así el seguimiento en vivo de la interrupción de una interacción.

En total, este enfoque constituye un esquema eficiente para cualquier estudio de interacción patógeno-huésped y sentimos que los análisis comparativos interactome podrían proporcionar un marco sólido para entender el secuestro de las células huésped microbio.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Esta obra fue financiada en parte con fondos del Institut Pasteur y por subvenciones de la Ligue nationale contre le Cancer (subvenciones R05/75-129 y RS07/75-75), la Association pour la Recherche sur le Cancer (becas ARC A09 / 1/5031 y 4867) y la Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 y 026 01 ANR09 MIEN). MM fue un beneficiario de una beca MENRT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains Clontech
Minimal SD base US biological D9500
Amino acids Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Acros organics 264571000
Zymolase Seikagaku 120491
DMEM Gibco-Life Technologies 31966
Fetal bovine serum BioWest S1810
Phosphate buffer Saline (PBS) Gibco-Life Technologies 14190
Penicillin-Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies 25300
Renilla luciferase assay Promega E2820
White culture plate Greiner Bio-One 655083
96-wellPCR plates 4titude 4t-i0730/C
Incubator (30 °C) Memmert
Incubator (37 °C) Heraeus
Luminometer Berthold Centro XS-LB 960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
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Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína
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Muller, M., Cassonnet, P., Favre, M., Jacob, Y., Demeret, C. A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (77), e50404, doi:10.3791/50404 (2013).

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