Summary
Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.
Abstract
Notevoli sforzi sono stati raccolti per produrre proteina-proteina mappe di rete di interazione su larga scala globale. Questo è fondamentale per comprendere le relazioni patogeno-ospite ed è stata eseguita essenzialmente da screening genetico nei lieviti sistemi a due ibridi. Il recente miglioramento della rilevazione interazione proteina-proteina da una luciferasi-based test di complementazione frammento Gaussia offre ora l'opportunità di sviluppare approcci comparativi interactomic integrativi necessari per confrontare rigorosamente profili di interazione di proteine provenienti da diverse varianti di ceppo patogeno nei confronti di un insieme comune di fattori cellulari.
Questo documento si concentra in particolare sulla utilità di combinare due metodi ortogonali per generare proteina-proteina set di dati di interazione: lievito di due ibridi (Y2H) e un nuovo saggio, high-throughput Gaussia princeps saggio di complementazione proteica (HT-GPCA) eseguita in cellule di mammifero.
nt "> A identificazione su larga scala di partner cellulari di una proteina patogeno viene eseguita con l'accoppiamento a base di lievito proiezioni doppio ibrido di librerie di cDNA utilizzando molteplici varianti ceppo patogeno. Un sottoinsieme di partner interagenti selezionati su un punteggio alto confidenza statistica è ulteriormente convalidato in cellule di mammifero per le interazioni pair-wise con l'intero insieme di proteine varianti patogeni utilizzano HT-GPCA. Questa combinazione di due metodi complementari migliora la robustezza del set di dati di interazione, e consente l'esecuzione di una rigorosa analisi di interazione comparativa. Tali intergenomica comparativi costituire una strategia affidabile e potente per decifrare eventuali interazioni patogeno-ospite.Introduction
La crescente quantità di dati raccolti per generare mappe di interazione proteina-proteina apre prospettive per comprendere ulteriormente infezioni da patogeni. Poiché la comprensione globale di infezioni patogeno comincia ad emergere, fornisce accesso alla gamma delle perturbazioni indotte dalle proteine patogeni quando si collega il proteoma umano 1. E 'in tal modo offre un modo per capire come gli agenti patogeni manipolano il macchinario della cellula ospite. In particolare, la mappatura delle diverse reti di interazione virus-ospite ha rivelato che le proteine virali preferenzialmente proteine bersaglio host che sono fortemente connessi alla rete cellulare (hub), o che sono al centro di molti percorsi in una rete (proteine colli di bottiglia) 2-4. Queste interazioni consentono ai virus di manipolare importanti processi cellulari, che è strumentale per replicare e produrre progenie infettiva. Mappatura interazioni comparativi sono stati recentemente condotto sul virus collegati con l'obiettivo di estrarre le informazioni relative alpatogenesi 4. Inoltre, gli studi di host-patogeni interazioni paesaggio sono stati estesi a molti agenti patogeni 5. La cella di identificazione fattori mirata fornisce approfondimenti sulle strategie utilizzate da agenti patogeni di infettare le cellule e permette di individuare i potenziali marcatori patogeni.
Il sistema di doppio ibrido di lievito è il metodo più popolare per identificare interazioni binarie poiché lo screening genetico è uno strumento efficace e sensibile per la mappatura ad alta velocità di interazioni proteina-proteina. L'approccio qui proposto migliora ulteriormente le singole proiezioni Y2H valutando una proteina di molteplici agenti patogeni varianti di deformazione, fornendo così accesso ad una panoramica comparativa delle interazioni proteina-proteina patogeno-ospite. Inoltre, una limitazione importante di lievito di screening del doppio ibrido giace in un alto tasso di falsi negativi, poiché recupera circa il 20% delle interazioni totale 6. Ciò implica che le interazioni rilevate con solo un sottoinsieme di patogens varianti potrebbero essere sfuggiti al rilevamento con gli altri. Pertanto, i singoli partner emergenti di tutte le proiezioni di due ibridi sono ulteriormente sfidati per l'interazione con l'intera gamma di ceppi studiati, fornendo serie di dati comparativi di interazione. Poiché è stato dimostrato che la combinazione di differenti metodologie fortemente aumenta la robustezza di interazione proteina-proteina set di dati 7, questa convalida viene eseguita in cellule di mammifero mediante un saggio di complementazione proteina-frammento di recente sviluppato chiamato HT-GPCA 8. Questo sistema a base di cellule permette il rilevamento di interazioni proteina dalla complementazione del Gaussia princeps diviso luciferasi ed è stato progettato per essere compatibile con un formato ad alta produttività. Grazie alla sua tecnologia di luminescenza-based e il suo basso rumore di fondo rispetto ad altre analisi basato sulla fluorescenza, HT-GPCA mostra una sorprendentemente elevata sensibilità.
In generale, questo approccio costituisce un efficientestrumento per generare una mappatura completa delle interazioni ospite-patogeno, che rappresenta il primo passo verso una comprensione globale della cellula ospite dirottamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lievito Screenings doppio ibrido
- Effettuare le seguenti soluzioni richieste:
- Completa Out Goccia sintetico (SD): sciogliere 26,7 g di minima base di deviazione standard con il glucosio in 1 L di acqua. Aggiungere 2 g di miscela di aminoacidi preparato come segue: 2 g hemisulfate adenina, 2 g Arginina HCl, 2 g di HCl Istidina, Isoleucina 2 g, 4 g Leucina, Lisina HCl 2 g, 2 g Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g L -Serina, 2 g L-treonina, 3 g Triptofano, Tirosina 2 g, 1.2 g Uracile, 9 g Valina.
- Selective Cada Fuori SD-L/-W/-H: SD contenente ogni aminoacidi essenziali ad eccezione di quelli specificati (-L:-leucina;-W:-triptofano;-H:-istidina).
- YPGLU: Per 1 L, peso 10 g di estratto di lievito, 10 g di Bacto peptone e 20 g di glucosio. Completo di 25 g Bacto agar per terreni solidi.
- YCM: come YPGLU, ma pH regolato a 4,5.
- Accoppiamento e la diffusione
- Usare aliquote congelate di pre-trasformazionendr Y187 ceppo di lievito (tipo di accoppiamento α) che contiene una libreria di cDNA clonato in pACT2. Verificare la vitalità cellulare del placcatura diluizioni seriali su piastre SD-L.
- Clonare il patogeno ORF in pGBKT7 vettore, e trasformare il plasmide ricombinante utilizzando una procedura standard in AH109 ceppo di lievito (tipo di accoppiamento a).
- Diffusione pGBKT7-trasformata AH109 lievito su piastre SD-W. Incubare almeno due giorni 30 ° C in un incubatore umidificato. Piastre possono essere conservati a 4 ° C finché lo screening del doppio ibrido.
- Usare 3-amminotriazolo (3-AT), un inibitore competitivo dell'enzima HIS3, per contrastare il potenziale di auto-transattivazione del gene reporter HIS3 dalle proteine dei patogeni. Eseguire un test di auto-attivazione determinando la concentrazione di 3-AT, che impedisce la crescita del lievito pGBKT7-trasformate su piastre SD-W/-H.
- Seed 30 ml di SD-W con poche colonie di pGBKT7-trasformato AH109. Incubare 30 ore a 30 ° C con rotazione.
- Seed 200 ml di SD-W con il 30 mldelle AH109 culture. Incubare con rotazione attorno 20 hr a 30 ° C.
- Incubare scongelati cDNA library-Y187 trasformato in 20 ml YPGLU, incubare 10 minuti a 30 ° C con rotazione.
- Centrifugare un volume di pGBKT7-trasformato AH109 cultura corrispondente ad una quantità equivalente di cellule di lievito Y187 vitali per 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere pellet in 10 ml YPGLU.
- Mescolate il lievito con risospeso AH109 Y187 biblioteca contiene. Trasferire in un tubo da 50 ml. Centrifugare per 5 min a 3500 rpm a 20 ° C, accuratamente ritirare surnatante (fragile pellet).
- Risospendere il pellet in YPGLU per ottenere un totale di 1,5 ml.
- Diffusione lievito a 3 YCM-Agar 150 piastre mm, 0,5 ml / piastra. Incubare 4,5 ore a 30 ° C.
- Raccogliere lievito accoppiò da piastre YCM raschiando con un bicchiere rastrello in 10 ml di SD-L/-W/-H. Lavare i piatti due volte con 5 ml SD-L/-W/-H medio e piscina.
- Centrifugare 5 min a 3.500 giri, 20° C. Gettare il surnatante e risospendere il lievito pellet in 5 ml SD-L/-W/-H medie.
- Stendere lievito accoppiato a 10 piastre (0,5 ml / piastra) di Agar SD-L/-W/-H integrate con la concentrazione appropriata di 3-amminotriazolo (3-AT) determinato nella prova di auto-attivazione. Incubare a 30 ° C in atmosfera umidificata per 6-10 giorni.
- Determinare l'(2n) tasso diploide per valutare l'efficienza di accoppiamento, diffondendo 250 microlitri di diluizioni seriali (10 -4 a 10 -6) della sospensione di lievito accoppiato su piastre SD-L/-W. Incubare le piastre a 30 ° C per due giorni. Contare le colonie cresciute su SD-L/-W, e dedurre il numero totale diploide presente nel volume iniziale di lievito accoppiati. Segnala questo numero diploide di vitale numero lievito biblioteca contenente per calcolare il tasso diploide. Dovrebbe variare del 10-25% circa.
- 6-10 giorni dopo incubazione a 30 ° C, raccogliere colonie di lievito accoppiate in SD-L/-W/-H fresco + 3-AT piatti. [Suggerimento: per il lievito in un sistema di 8corsie di 12 pozzetti riproducenti una piastra da 96 pozzetti in modo che sia più facile per il sequenziamento seguito]. Lasciate colonie di lievito crescere per 4-5 giorni a 30 ° C in atmosfera umidificata.
- Proiezione del HIS3 cloni positivi mediante PCR e sequenziamento
L'obiettivo è di PCR amplificare la ORF contenuta nei pACT2 vettori di lievito colonie cresciute su piastre selettive SD-L/-H/-W.- Mettete un piatto ben 96 PCR in ghiaccio.
- Per lisare cellule di lievito, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di una soluzione 20T Zymolase (2,5 mg / ml in 10 mM tampone HEPES pH 7.7).
- Risospendere delicatamente una colonia per pozzetto.
- Incubare 15 minuti a 37 ° C e 15 min a 95 ° C.
- Mettere la piastra posteriore sul ghiaccio. Aggiungere 50 ml di acqua distillata per pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù.
- Centrifugare per 5 min a 3500 rpm e 4 ° C.
- PCR amplificano 10 microlitri di rilevare un inserto utilizzando primer ricottura entrambi i lati della ORF derivati da cDNA in vettori pACT2. Il protocollo è gato per l'amplificazione di 96 lisati colonie di lievito con la polimerasi ExTaq. Preparare la seguente miscela: 525 microlitri di buffer 10X ExTaq, 420 microlitri dNTP mix (2,5 mm), 10,5 ml Primer Forward (1 mg / mL), 10,5 ml Primer Indietro (1 mg / mL), 31,5 ml ExTaq (5 U / mL ) e 3202,5 ml H 2 0. Distribuire 40 microlitri della miscela per pozzetto in una piastra PCR 96. Aggiungere 10 ml di lisato di lievito per pozzetto. Eseguire amplificazione come segue: 94 ° C per 3 min, quindi 35 cicli a 94 ° C per 30 sec, 60 ° C per 1 min, 72 ° C per 4 min, e terminano con 72 ° C per 7 minuti. Eseguire 3 pl di prodotti di PCR su un gel di agarosio 1,2% per rilevare cloni PCR-positivi. Si noti che l'utilizzo di pre-fusione 96 e si raccomanda gel di agarosio.
[Suggerimento: piastra può essere conservato a -20 ° C per pochi mesi e riutilizzato per la nuova PCR] - Sequenza dei frammenti di PCR amplificati isolati da HIS3 cloni positivi. Eseguire un'analisi BLAST per identificare cellulare ORF. Allineamenti bassa confidenza (E Valore > 10 -10, identità <80%, lunghezza peptide <20 aminoacidi) vengono scartati e frameshifted e premature codone di STOP contenente sequenze.
2. Matrix edificio per HT-GPCA
HT-GPCA è un saggio basato su cellule di mammifero in cui entrambe le proteine patogeno e l'ospite sono transitoriamente espressi fusi a frammenti complementari della divisione Gaussia princeps luciferasi. Seguito all'interazione dei partner, questo enzima viene ricostituito permettendo la misura della sua attività enzimatica. L'intensità dell'interazione è quindi dedotta da un Rapporto di luminescenza Normalizzato (vedi sotto e Figura 1)
- La scelta dei partner della cellula ospite
- Selezionare le proteine che vengono identificati più di tre volte nelle proiezioni Y2H di ulteriore validazione in cellule di mammifero per aumentare la fiducia dei set di dati 9.
- Aggiungi note partner interagenti delle proteine patogeno come positive controlli.
- Trasferire in vettori compatibili HT-GPCA
- Clonare ogni agente patogeno proteina ORF in un vettore pSPICA-N2 per generare proteine patogene con aminoacidi 110-185 delle umanizzati princeps Gaussia luciferasi fusi a loro N-terminale della proteina (fusioni GL2-patogeno).
- PCR amplifica proteina cellulare ORF direttamente dai cloni positivi Y2H o da altre risorse ORF (umano ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) e trasferirli in vettori pSPICA-N1 per generare proteine fuse all'estremità N-terminale con gli amminoacidi 18-109 di umanizzato Gaussia princeps luciferasi (fusioni proteiche GL1-host).
[Suggerimento: per la clonazione di grandi dimensioni, si consiglia il sistema di clonazione Gateway. In tal caso, per l'amplificazione PCR, utilizzare primer disegnati per contenere siti compatibili Gateway]. - Sequenza tutti vettori di espressione. Sequenze del pSPICA-N1-N2 e pSPICApuò essere trovato in riferimento 8.
Si noti che i costrutti plasmidici possono essere invertiti, cioè proteine agenti patogeni in pSPICA-N1 e proteina ospite in pSPICA-N2.
3. High-Throughput Gaussia princeps luciferasi-Based Protein Assay complementazione (HT-GPCA)
- Trasfezione delle cellule
- Seed 293T cellule a 350.000 cellule / ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino (FBS) senza antibiotico. Distribuire 100 l / pozzetto in piastre di coltura sterili bianco. Non superare i 10 piatti in un singolo esperimento. Lasciate che le cellule crescono per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
[Tip:. Poiché i plasmidi pSPICA contengono una origine SV40, l'uso di cellule 293T permette loro replicazione in cellule trasfettate e quindi porta alla sovraespressione dei due frammenti luciferasi] - Il giorno seguente, le cellule trasfezione utilizzando qualsiasi protocollo di trasfezione adatto. Si noti che per alcuni reagenti di trasfezione, il number di cellule testa di serie può essere adattato. Utilizzare 100 ng per bene sia del patogeno e l'ospite ORF costrutti plasmidici. Co-trasfezione 10 ng per pozzetto di una di CMV-lucciola luciferasi plasmide per normalizzare per efficienza di trasfezione. Ciascun punto è testato in triplicato.
[Tip:. Miscele di DNA possono essere eseguite il giorno prima della transfezione e conservati a -20 ° C con guarnizioni adesive] - Trasferire miscela di trasfezione alle piastre di coltura cellule 293T. Fare attenzione a depositare dolcemente la miscela DNA sulle cellule, come 293T non sono fortemente aderente e facilmente staccare dal fondo del pozzo. Incubare in un incubatore per colture cellulare per 24-30 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Seed 293T cellule a 350.000 cellule / ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino (FBS) senza antibiotico. Distribuire 100 l / pozzetto in piastre di coltura sterili bianco. Non superare i 10 piatti in un singolo esperimento. Lasciate che le cellule crescono per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- La lisi cellulare e Gaussia dosaggio luciferasi
- Lavare le cellule con PBS (100 pl / pozzetto). Aggiungere 40 microlitri di buffer di lisi Renilla 1X. Incubare per 30 min a temperatura ambiente sotto agitazione.
- Risparmia il 10 microlitri di lisato cellulare in un altro plat biancoe per successivo dosaggio dell'attività di luciferasi lucciola. Conservare a 4 ° C o in alternativa a -20 ° C con tenuta.
- Misurare l'attività Gaussia sui rimanenti 30μl di lisati cellulari mediante l'aggiunta di 100 pl di reagente di saggio luciferasi Renilla e conteggio luminescenza per 10 sec con un luminometro. Dosaggio di una piastra a 96 prende circa mezz'ora. Eseguire la misurazione con estratti di cellule fresche dal congelamento o conservazione a lungo termine può influenzare l'attività Gaussia interazione mediata.
- Misurazione dell'attività Firefly
- Misurare l'attività lucciola sulla salvato 10 microlitri di lisato cellulare aggiungendo 50 ml di reagente di saggio luciferasi lucciola e conteggio luminescenza per 10 sec. Dosaggio di una piastra a 96 prende circa mezz'ora. [Suggerimento: Il dosaggio di lucciola luciferasi può essere eseguita il giorno dopo su lisati congelati.]
- Calcoli NLR
- Per monitorare l'interazione, stimare un rapporto di luminescenza Normalizzato (NLR) per ogni coppia patogeno-ospite. Per fare ciò, dividere il normalizzato attività luminescenza Gaussia rilevata in presenza sia patogeno e proteine ospite dalla somma delle attività misurate in pozzetti di controllo (Figura 1 adattato da riferimento 8). Il valore di cut-off NLR per le interazioni positive è stato stimato in circa 3,5 8.
- Analisi dei dati
- Eseguire il clustering gerarchico utilizzando il pacchetto statistico R. Prima, raggruppare i dati NLR in categorie, quindi calcolare un dendrogramma un'interazione con il metodo linkage completo. Visualizza questodendrogramma con JavaTreeView 10. Calcolare la distanza tra interazione dendrogramma e albero filogenetico con un coefficiente di correlazione di Pearson.
- Per generare reti di interazione, selezionare le interazioni positive dal dataset HT-GPCA e utilizzare il software Cytoscape 1. Estrarre i gradi delle proteine ospite e tracciare la loro distribuzione per accedere alle dinamiche locali di rete. Reti host-agenti patogeni possono essere sovrapposti alla interattoma ospite di fornire una valutazione dell'impatto globale delle proteine patogene nella rete cellulare host.
- Estrarre il GO (Gene Ontology) termini associati con i fattori cellulari mirati con il DAVID database di bioinformatica 12 per valutare l'arricchimento funzionale del dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un punto di forza di HT-GPCA risiede nella sua elevata sensibilità, come illustrato dalla valutazione di tassi positivi e falsi negativi falsi per la proteina E2 di HPV nella Figura 2 (adattato dal riferimento 13). Per determinare il tasso di falsi negativi, note interazioni di E2 da HPV16 sono state valutate da HT-GPCA (Figura 2A). Quattro su 18 interazioni non sono stati recuperati (corrispondente ad un tasso di falso negativo 22%). Le interazioni falsi positivi sono stati misurati al 5,8% con 12 proteine di HPV E2 contro un insieme casuale di proteine cellulari (Figura 2B). Inoltre, la forte specificità del metodo è evidenziata in Figura 2C mostra che una singola mutazione puntiforme noto per interferire con E2 legarsi al suo partner di cella BRD4 annulla il rapporto NLR (Figura 2C).
Questo approccio interactomic comparativa su larga scala è stato recentemente applicato con successo a tre primi proproteine del papillomavirus umano (HPV): E2, E6 e E7 provenienti da diversi genotipi rappresentativi della diversità naturale da HPV in tropismi e patologie 13,14. Per ciascuna delle prime proteine, clustering gerarchico dei profili di interazione per lo ricapitola HPV filogenesi, comprovante la solidità dell'approccio e la pertinenza di set di dati di interazione (Figura 3 adattato da riferimenti 13 e 14). Esso può essere utilizzato per correlare specifici profili di interazione virus-ospite con tratti patologici, dando così indizi del coinvolgimento di proteine virali in patogenesi. Interazioni genotipo-specifici possono essere estratti, che potenzialmente corrispondono a tropismo o patogeni biomarker come mostrato in Figura 4 per le proteine E6 di HPV (figura 4 adattato da riferimento 14).
Inoltre, intuizioni funzionali possono emergere da queste analisi su larga scala. Ad esempio, nello studio di interactomicla E2 proteine HPV, l'analisi funzionale arricchimento portato all'identificazione di una famiglia importante consiste in fattori di trascrizione cellulari, in linea con il ruolo primario di E2 come regolatore trascrizionale virale. Essa ha anche rivelato un Targeting funzionale inaspettato del macchinario traffico intracellulare, aprendo nuove prospettive per il ruolo di E2 nella patogenesi HPV 13.
Nel complesso, gli studi comparativi interatomici eseguiti con le prime proteine di HPV migliorare notevolmente la comprensione della patogenesi HPV correlando profili di interazione specifica alle differenze fenotipiche.
Figura 1. Identificazione delle interazioni proteina-proteina con HT-GPCA. Sia patogeno e le proteine ospite sono fusi a una INACmetà tiva del Gaussia princeps luciferasi (parti GL2 e GL1, rispettivamente). Quando le proteine interagiscono, una attività di luciferasi è indotto dalla vicinanza di entrambe le metà dell'enzima. L'attività luciferasi Gaussia restaurata viene calcolato da un Rapporto di luminescenza Normalizzato (NLR), come mostrato a destra. Figura adattata da riferimento 8. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Caratteristiche HT-GPCA. (A) 18 interazioni estratte dalla letteratura che coinvolge la proteina E2 da HPV16 e proteine cellulari sono stati testati da HT-GPCA per stimare il tasso di falsi negativi associati con questa t echnique. Il rapporto NLR sono rappresentati come una sfumatura di colore (mappa di calore) con una scala dal nero (senza interazioni) alla luce blu (forte interazione). Quattro note interazioni non sono stati recuperati (frecce rosse), dando una stima del tasso di falsi negativi circa il 22%. (B) 12 proteine HPV E2 sono stati testati con 10 proteine cellulari presa casualmente, corrispondente ad una interazioni negative priori, al fine di determinare la percentuale di falsi positivi del HT-GPCA, che ha ottenuto circa il 5,8%. (C) L'interazione tra la proteina cellulare BRD4 e HPV16 o HPV18 proteine E2 è noto a dipendere gli amminoacidi I73 e I77 rispettivamente. Quando questi amminoacidi sono mutati, il HT-GPCA NLR scende con una diminuzione del 5-tempo dimostrando una elevata specificità di rilevare interazioni. Figura adattata da riferimento 13. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Confronto tra sperimentali dendrogrammi interazione-based e HPV alberi filogenetici. L'filogenia di HPV basato sulla precoce proteine E2 (A), E6 (B) o E7 (C) sequenze siano rappresentati sul fianco di ogni grafico. Dendrogrammi interazione sono stati ottenuti clustering gerarchico dei profili di interazione di ogni proteina e sono rappresentati sulla destra. Una congruenza significativa è stata osservata tra i due tipi di albero, con analogo raggruppamento dei tipi patologici (rettangoli colorati), dimostrando la pertinenza degli insiemi di dati di interazione. Figura adattata da riferimenti 13 e 14. Clicca qui per ingrandire figure.
Figura 4. Rappresentazione schematica dei E6 principali bersagli cellulari. Bersagli cellulari sono stati ordinati in base alla intensità dell'interazione e raggruppate secondo interagenti tipo di HPV. Questa rappresentazione permette l'identificazione di biomarcatori specifici come FADD, che interagisce solo con le proteine E6 di HPV oncogeno. Come il targeting deve essere fondamentale per il carattere cancerogeno di tutti HPV oncogeno e costituisce quindi un buon candidato per essere utilizzato sia come marker surrogato per l'infezione da HPV o come bersaglio terapeutico. Figura adattata da riferimento 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indipendentemente, lievito-due saggi di interazione ibridi e mammiferi, come il GST pull-down, LUMIER o MAPPIT, hanno dimostrato di essere strumenti efficaci per individuare le interazioni proteina-proteina, ma sono limitati dal tasso elevato di falsi positivi e falsi negativi interazioni associate con queste tecniche 15. Inoltre, vi è sempre maggiore che combinando metodi ortogonali aumenta l'affidabilità dell'interazione dataset ottenuto 7. Il recente sviluppo della tecnica HT-GPCA descritta qui è migliorato non solo la sensibilità di rilevamento di interazioni proteina-proteina binario in cellule di mammifero, ma ha offerto anche la possibilità di gestire una grande quantità di interazioni in una volta.
La strategia descritta qui migliora la copertura delle singole proiezioni Y2H sondando interazioni di molteplici varianti di deformazione. Inoltre, ripetere il test interazioni con un metodo di rilevazione ortogonale fornisce rigorose interazione comparativazione set di dati, di superare i limiti e fuggire manufatti inerenti alla metodologia del doppio ibrido. Infatti, dal momento HT-GPCA avviene in cellule di mammifero, le modificazioni post-traduzionali e naturale localizzazione subcellulare delle proteine sono inalterati. Il nostro approccio può quindi produrre in un unico step mappe di interazione che sono migliorate rispetto a quelle che si basano principalmente sulla lievito doppio ibrido per l'interazione rilevamento 4.
A questo punto, anche se, si consiglia prestando attenzione nello studio di proteine trans-membrana, poiché il rilevamento di interazioni può dipendere dalla localizzazione dei frammenti Gaussia su entrambi i lati della membrana. In questi casi, potrebbe essere necessario fondere i frammenti Gaussia nel C-terminale di uno o entrambi i partner. Inoltre, l'espressione della luciferasi può essere influenzata da numerosi parametri quali efficienza di trasfezione e numero cellulare. Pertanto, si consiglia vivamente di follgrazie alla procedura di normalizzazione descritta nella sezione del protocollo per tener conto delle variazioni sperimentali.
Utilizzando array ordinati di ORF prelevati dalla crescente collezione del ORFeome Umana, prevediamo un punto in un prossimo futuro dove HT-GPCA potrebbe essere utilizzato direttamente come metodo di screening. Ciò dovrebbe migliorare prima drasticamente la copertura dello screening in quanto ogni coppia proteina avrebbe poi essere testati, e la seconda, che dovrebbe facilitare l'automazione. Tuttavia, una più drastica espansione elevato throughput di questa analisi deve essere portato dallo sviluppo di un saggio in vitro HT-GPCA utilizzando sistemi di espressione in vitro basati su estratti cellulari umane. Questo dovrebbe anche permettere di monitorare le interazioni proteina-proteina in un ambiente biochimico controllato.
Infine, si prevede imminenti sviluppi per migliorare la visualizzazione di luminescenza complesso-mediata in cellule viventi. In quel caso, il HT-GPCA potrebbe essereutilizzato per individuare interazioni dinamiche nel contesto della aggiunta di farmaci o inibitori complesse permettendo così il monitoraggio in tempo reale della perturbazione di una interazione.
In tutto, questo approccio costituisce uno schema efficiente di eventuali studi di interazione patogeno-ospite e riteniamo che le analisi comparative interactomi potrebbero fornire un quadro solido per capire microbo dirottamento delle cellule ospiti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della Institut Pasteur e da finanziamenti della Ligue nationale contre le Cancer (sovvenzioni R05/75-129 e RS07/75-75), l'Associazione pour la Recherche sur le Cancer (borse di ARC A09 / 1/5031 e il 4867), e l'Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 e ANR09 MIEN 026 01). MM è stato un destinatario di una borsa di studio MENRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
