Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Published: July 18, 2013 doi: 10.3791/50404
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,3, 1
1Unité de Génétique, Papillomavirus et Cancer Humain (GPCH), Institut Pasteur, 2Cellule Pasteur, Université Sorbonne Paris Cité, 3Center for Cancer Systems Biology (CCSB), Harvard Medical School, Department of Cancer Biology, Dana Farber Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Эта статья посвящена выявлению высокого уверены взаимодействия между наборами данных хозяина и возбудителем белков с использованием комбинации двух ортогональных методов: дрожжи двугибридная последующей высокой пропускной способностью анализа взаимодействия в клетках млекопитающих называют HT-GPCA.

Abstract

Значительные усилия были собраны для создания крупномасштабных всеобъемлющего белок-белковых взаимодействий карты сети. Это играет важную роль для понимания патоген-хозяин отношения и, по существу, выполняет генетические скрининги в дрожжах двух гибридных систем. Недавнее улучшение взаимодействия белок-белок обнаружения Gaussia люциферазы анализа на основе дополнения фрагмента теперь предлагает возможность развивать интегративные подходы сравнительного interactomic необходимо строго сравнить профили взаимодействия белков из различных вариантов штамма возбудителя против общий набор клеточных факторов.

Эта статья специально фокусируется на полезность объединения двух ортогональных методов для создания белок-белковые взаимодействия наборов данных: дрожжи двугибридная (Y2H) и новый анализ с высокой пропускной Gaussia принцепса белка дополнения анализа (HT-GPCA) выполняются в клетках млекопитающих.

NT "> крупномасштабных идентификации ячейковых партнеров патогена протеина, в результате скрещивания на основе дрожжей двугибридная показы библиотек кДНК с использованием нескольких вариантов штамма возбудителя. подмножества взаимодействующих партнеров выбраны на высокой уверенности в себе статистические забил дальнейшего подтверждены в клетках млекопитающих для парных взаимодействий с целым набором белков патогенных вариантов использования HT-GPCA. Эта комбинация из двух взаимодополняющих методов повышения надежности взаимодействия набор данных, и позволяет выполнение строгих сравнительный анализ взаимодействия. Такой сравнительный interactomics представляют собой надежную и мощную стратегию, чтобы расшифровать любой патоген-хозяин взаимодействий.

Introduction

Увеличение количества данных, собранных для генерации белок-белковое взаимодействие карты открывает перспективы для дальнейшего понимания возбудитель инфекции. В глобальном понимании возбудитель инфекции начинает появляться, он обеспечивает доступ к классам возмущений, вызванных микроорганизмами, белки при подключении протеома человека 1. Тем самым он предлагает способ понять, как патогенные манипулировать техники клетки-хозяина. В частности, отображение нескольких вирусных хозяина сетей взаимодействия показало, что вирусные белки преимущественно целевого хоста белки, которые тесно связанных в сотовой сети (концентраторы), или которые имеют решающее значение многих путей в сети (узкие белки) 2-4. Эти взаимодействия позволяют вирусам манипулировать важные клеточные процессы, играет важную роль в репликации и производить инфекционного потомства. Сравнительный отображение взаимодействий недавно были проведены на родственные вирусы с целью получения информации относительноПатогенез 4. Кроме того, исследования-хозяина патогенов пейзаж взаимодействий были распространены на многих патогенов 5. Клетки-мишени идентификации факторов дает представление о стратегии, используемые патогенами инфицировать клетки и позволяет выявлять потенциальных маркеров патогенной.

Дрожжей двугибридная система является наиболее популярным методом для идентификации парных взаимодействий, так как генетический скрининг является эффективным и чувствительным инструментом для высокой пропускной отображение белок-белковых взаимодействий. Предлагаемый здесь подход дополнительно улучшает отдельные показы Y2H путем оценки белка множественной штамма патогенных вариантов, тем самым обеспечивая доступ к сравнительный обзор патоген-хозяин белок-белковых взаимодействий. Более того, главное ограничение дрожжей двугибридная скрининга заключается в высокой ложноотрицательных, так как он восстанавливает около 20% от общего числа взаимодействий 6. Это означает, что взаимодействие обнаружены только подмножество паторода варианты, возможно, избежал обнаружения с другими. Таким образом, отдельные партнеры выходят из всех двухгибридного показы более осложняется для взаимодействия с полный спектр изученных штаммов, обеспечивая сравнительного взаимодействия наборов данных. Поскольку было показано, что сочетание различных методик сильно повышает надежность белок-белковых взаимодействий наборов 7, эта проверка выполняется в клетках млекопитающих заново разработанный белок-фрагмент комплементации анализа, называемого HT-GPCA 8. Эта клетка-система позволяет обнаруживать белковых взаимодействий путем комплементации Gaussia принцепса разделить люциферазы и был разработан, чтобы быть совместимым с высокой пропускной формате. Благодаря своей люминесценции на основе технологии и ее низкий фоновый шум по сравнению с другими флуоресцентного анализа на основе, HT-GPCA показывает поразительно высокой чувствительностью.

В целом, такой подход является эффективныминструмент для создания всеобъемлющего учета хозяин-патоген взаимодействий, которая представляет собой первый шаг на пути к глобальному пониманию клетки-хозяина угон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Дрожжи двугибридная показы

  1. Сделайте следующие обязательные решения:
    1. Полное Синтетические Из падения (SD): растворите 26,7 г минимальную базу SD с глюкозой в 1 л воды. Добавляют 2 г смеси аминокислот получали следующим образом: 2 г аденин гемисульфат, 2 г аргинина HCl, 2 г Гистидин HCl, 2 г изолейцин, лейцин 4 г, 2 г лизин HCl, 2 г метионин, фенилаланин 3 г, 2 г L -серин, 2 г L-треонин, триптофан 3 г, 2 г тирозин, 1,2 г урацил, 9 г Валин.
    2. Селективный отпадают SD-L/-W/-H: SD, содержащий все незаменимые аминокислоты, кроме указанных (-L:-лейцин;-W:-триптофан;-H:-гистидин).
    3. YPGLU: для 1 л, вес 10 г дрожжевого экстракта, 10 г бактопептон и 20 г глюкозы. В комплекте с 25 г Бактоагар для твердых сред.
    4. YCM: То же, YPGLU, но рН до 4,5.
  2. Спаривание и распространение
    1. Использование замороженных аликвот предварительного преобразованияЭд Y187 штамм дрожжей (типа спаривания α), содержащий библиотеку кДНК клонировали в pACT2. Проверить жизнеспособность клеток последовательных растворов на SD-L пластин.
    2. Клон возбудителя ORF в pGBKT7 вектор и трансформировать рекомбинантной плазмиды с использованием стандартной процедуры в AH109 штамм дрожжей (типа спаривания).
    3. Распространение pGBKT7 AH109-трансформированных дрожжей на SD-W пластин. Инкубируют крайней мере двух дней 30 ° С в увлажненном инкубаторе. Плиты можно хранить при температуре 4 ° С до тех пор двугибридная скрининга.
    4. Использование 3-аминотриазола (3-AT), конкурентный ингибитор фермента HIS3, чтобы противодействовать потенциал самостоятельного трансактивации HIS3 репортерного гена белками возбудителей. Выполнение автоматической активации тест на определение концентрации 3-AT, который предотвращает рост pGBKT7-трансформированных дрожжей на SD-W/-H пластин.
    5. Семенной 30 мл SD-W с несколькими колониями pGBKT7 трансформированных AH109. Инкубируют 30 ч при 30 ° С с вращением.
    6. Семенной 200 мл SD-W с 30 млиз AH109 культур. Выдержите с вращением вокруг 20 ч при 30 ° С.
    7. Инкубируют талой библиотеки кДНК-трансформированных Y187 в 20 мл YPGLU, инкубируют 10 мин при 30 ° С с вращением.
    8. Центрифуга объем pGBKT7-трансформированных AH109 культуры соответствующего эквивалентного количества жизнеспособных дрожжевых клеток Y187 течение 5 минут при 3500 оборотов в минуту при 20 ° С. Осторожно снять супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл YPGLU.
    9. Смешать дрожжи Ресуспендированную AH109 с Y187 содержащих библиотеки. Передача в 50 мл пробирку. Центрифуга в течение 5 минут при 3500 оборотов в минуту при 20 ° С, тщательно снять супернатант (хрупкие гранулы).
    10. Ресуспендируют осадок в YPGLU получить в общей сложности 1,5 мл.
    11. Распространение дрожжей на 3 YCM-агар 150 мм пластин, 0,5 мл / пластины. Выдержите 4,5 ч при 30 ° С.
    12. Сбор повязана дрожжей из YCM пластин путем соскоба с граблями стекла в 10 мл SD-L/-W/-H. Промыть пластины два раза 5 мл SD-L/-W/-H среднего и бассейн.
    13. Центрифугируют 5 мин при 3500 оборотах в минуту, 20° C. Удалите супернатант и ресуспендируйте дрожжей осадок в 5 мл среды SD-L/-W/-H.
    14. Распространение паре дрожжей на 10 пластин (0,5 мл / планшет) SD-L/-W/-H агар с соответствующей концентрацией 3-аминотриазола (3-AT) определяли в автоматической активации теста. Инкубируют при 30 ° С в увлажненной атмосфере, в течение 6-10 дней.
    15. Определите диплоидные (2n) скорость для того, чтобы оценить эффективность спаривания, распространяя 250 мкл серийные разведения (10 -4 до 10 -6) сопряженного дрожжевую суспензию на SD-L/-W пластин. Планшеты инкубируют при 30 ° С в течение двух дней. Граф колоний, выросших на SD-L/-W и вывести общее число диплоидных присутствует в начальный объем повязана дрожжей. Сообщить об этой диплоидного числа жизнеспособных библиотеки содержащие дрожжи для расчета числа диплоидных ставке. Она должна составлять около 10-25%.
    16. 6-10 дней после инкубации при 30 ° C, выбрать повязана колонии дрожжей в свежем SD-L/-W/-H + 3-АТ пластин. [Подсказка: в порядке дрожжи в схеме 8переулкам 12 скважин воспроизведения 96-луночный планшет, так что будет проще потом для секвенирования]. Пусть дрожжей колонии растут в течение 4-5 дней при 30 ° С в увлажненной атмосфере.
  3. Скрининг his3 положительных клонов с помощью ПЦР и секвенирование
    Цель состоит в том для ПЦР-амплификации ORF, содержащихся в pACT2 векторы дрожжей колоний, выросших на селективной пластины SD-L/-H/-W.
    1. Положите 96 луночный ПЦР планшет на льду.
    2. Для лизиса клеток дрожжей, добавить 50 мкл на лунку раствора Zymolase 20T (2,5 мг / мл в 10 мМ HEPES буфере рН 7.7).
    3. Аккуратно ресуспендируйте одна колония на лунку.
    4. Инкубируют 15 минут при 37 ° С и 15 мин при 95 ° С.
    5. Поставил тарелку обратно на льду. Добавить 50 мкл дистиллированной воды на лунку. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
    6. Центрифугируют 5 мин при 3500 оборотах в минуту и ​​4 ° С.
    7. ПЦР усиливают 10 мкл для обнаружения вставки с использованием праймеров отжига обеим сторонам от ORF, полученные из кДНК в pACT2 векторов. Протокол гИвен для амплификации 96 лизированных дрожжевых колоний с полимеразы ExTaq. Подготовьте следующие смеси: 525 мкл 10х буфера ExTaq, 420 мкл смеси дНТФ (2,5 мМ), 10,5 мкл Прямой праймер (1 мкг / мкл), 10,5 мкл обратного праймера (1 мкг / мкл), 31,5 мкл ExTaq (5 Е / мкл ) и 3202,5 ​​мкл H 2 0. Распределить 40 мкл смеси на лунку в 96-луночный планшет ПЦР. Добавить 10 мкл Лизированные дрожжей на лунку. Выполнение усиления следующим образом: 94 ° С в течение 3 мин, затем 35 циклов при 94 ° С в течение 30 сек, 60 ° С в течение 1 мин, 72 ° С в течение 4 мин, а в конце 72 ° С в течение 7 мин. Выполнить 3 мкл продуктов ПЦР в 1,2% агарозном геле для обнаружения PCR-положительных клонов. Заметим, что использование сборных 96 агарозном геле рекомендуется.
      [Подсказка: пластины можно хранить при температуре -20 ° C в течение нескольких месяцев и повторно использованы для новых ПЦР]
    8. Последовательность ПЦР-амплифицированные фрагменты, выделенные из позитивных клонов HIS3. Выполните BLAST анализа для выявления сотовой ORF. Низкая уверенность выравнивания (значение E &GT, 10 -10, идентичность <80%, пептид длиной <20 аминокислот), отбрасываются, а также frameshifted и преждевременного стоп-кодона, содержащие последовательности.

2. Матрица потенциала для HT-GPCA

HT-GPCA представляет собой клетку млекопитающего на основе анализа, где оба патогена и хозяина белки временно экспрессированного слитого с дополнительными фрагментами раскола люциферазы Gaussia рппсерз. При взаимодействии партнеров, этот фермент восстанавливают позволяет мерой его ферментативной активности. Интенсивность взаимодействия, таким образом, выводится из нормализованное отношение люминесценции (см. ниже и на рисунке 1)

  1. Выбор партнеров клетки-хозяина
    1. Выберите белки, которые определены более чем в три раза в Y2H показы для дальнейшей проверки в клетках млекопитающих увеличить доверие 9 наборов данных.
    2. Добавить известно взаимодействующих партнеров возбудителя белки как Positiве контроля.
  2. Перевод на HT-GPCA совместимых векторов
    1. Клон каждого патогена белок ORF в pSPICA-N2 вектор генерировать белки патогена с аминокислоты 110 до 185 гуманизированного рппсерз Gaussia люциферазы слит на своем N-конце (GL2-патоген слитых белка).
    2. ПЦР усиливают клеточный белок ORF непосредственно из Y2H положительных клонов или ORF из других ресурсов (человеческих ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) и передавать их в pSPICA-N1 векторов для создания белков, слитых в N-концу аминокислоты 18 до 109 гуманизированных Gaussia рппсерз люциферазы (GL1-хозяин слитых белка).
      [Подсказка: Для крупномасштабных клонирование, клонирование системы шлюза рекомендуется. В этом случае, для ПЦР-амплификации, используя праймеры, предназначенные для размещения шлюз совместимый сайты].
    3. Последовательность всех векторов экспрессии. Последовательности pSPICA-N1 и N2-pSPICAможно найти в ссылке 8.

Обратите внимание, что плазмиды конструкций меняется на противоположный, то есть белки патогенов в pSPICA-N1 и принимающих белка в pSPICA-N2.

3. Высокая пропускная Gaussia принцепса Люциферазы основе белка Комплементация анализа (HT-GPCA)

  1. Трансфекции клеток
    1. Семенной 293Т при 350000 клеток / мл в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) без антибиотика. Распределить 100 мкл / лунку в стерильных белых тарелках культуры. Не должен превышать 10 пластин в одном эксперименте. Пусть клетки растут в течение 24 ч при 37 ° С с 5% СО 2.
      [Совет. Поскольку pSPICA плазмиды содержат репликации SV40, использование 293Т позволяет их репликации в трансфицированных клетках и, таким образом, приводит к избыточной экспрессии двух фрагментов люциферазы]
    2. На следующий день трансфекции клетки, используя любой подходящий протокол трансфекции. Заметим, что для некоторых реагентах трансфекции ядерногоMBER клеток, посеянных может быть адаптирована. Используйте 100 нг на лунку как патогена и хозяина ORF плазмиды конструкций. Со-трансфекции 10 нг на лунку ЦМВ-Светлячок люциферазы плазмиды нормализовать эффективности трансфекции. Каждая точка проверяется в трех экземплярах.
      [Совет. ДНК смеси могут быть выполнены за день до трансфекции и хранили при -20 ° С с клеем печати]
    3. Передача смесь для трансфекции с пластинами культивируемых клетках 293Т. Быть осторожным, чтобы аккуратно осаждения ДНК смесь на клетки, а не 293T высокой адгезией и легко отделяться от дна скважины. Инкубируют в инкубаторе для клеточных культур в течение 24-30 ч при 37 ° С с 5% СО 2.
  1. Лизис клеток и Gaussia люциферазе дозировки
    1. Мытье клеток с PBS (100 мкл / лунку). Добавить 40 мкл 1X буфере для лизиса Renilla. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при перемешивании.
    2. Скидка 10 мкл клеточного лизата в другой белый Platе для последующей дозировки активность люциферазы Firefly. Хранить при 4 ° С или, альтернативно, при -20 ° С с уплотнением.
    3. Измерение активности Gaussia на оставшихся 30 мкл лизатов клеток путем добавления 100 мкл реагента люцифераза Renilla анализа и подсчета люминесценцию в течение 10 сек с помощью люминометра. Дозировка 96-луночный планшет занимает около получаса. Измерение следует проводить со свежими клеточные экстракты, так как замораживание или длительное хранение может повлиять на взаимодействие Gaussia-опосредованной деятельности.
  1. Измерение активности Firefly
    1. Измерение активности Firefly на сохраненном 10 мкл клеточного лизата добавлением 50 мкл реагента люцифераза Firefly анализа и подсчета люминесценцию в течение 10 сек. Дозировка 96-луночный планшет занимает около получаса. [Подсказка: дозировка люциферазы светляков может быть выполнена на следующий день после замороженными лизатов.]
  1. NLR Расчеты
      Gaussia активности люциферазы и люциферазы светляков деятельности для получения нормализованной люминесценции Gaussia стоимости с учетом эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток. Подсчитать среднее значение трех измерений.
    1. Для наблюдения за взаимодействием, оценить нормализованное отношение люминесценции (РНБ) для каждого патогена-хозяина пары. Для этого разделите нормированной люминесценции Gaussia деятельности, выявленные в присутствии обоих возбудителя и белков хозяина сумме деятельности измеряется в контрольных лунках (рис. 1 адаптированы из работы 8). NLR пороговое значение для позитивного взаимодействия, по оценкам, составит около 3,5 8.
  1. Анализ данных
    1. Выполните иерархической кластеризации с использованием пакета R статистикой. Во-первых, группа NLR данные по категориям, а затем рассчитать взаимодействие дендрограмма использованием метода полной связи. Визуализировать этодендрограмма с JavaTreeView 10. Рассчитать расстояние между дендрограмма взаимодействия и филогенетического дерева с помощью коэффициента корреляции Пирсона.
    2. Для создания взаимодействия сетей выделите позитивного взаимодействия с HT-GPCA набора данных и использовать программное обеспечение Cytoscape 1. Извлеките степени белков хозяина и сюжет их распределение доступа к сети местной динамики. Host-патогенные сети могут быть наложены на хост интерактома обеспечить оценку глобального воздействия патогенных белков в принимающей сети сотовой связи.
    3. Извлеките GO (Gene Онтология) термины, связанные с целевым клеточных факторов с базой данных DAVID биоинформатика 12 для оценки функционального обогащения набора данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Одним из основных преимуществ HT-GPCA заключается в его высокой чувствительности, о чем свидетельствуют оценки ложноположительных и ложноотрицательных результатов для белка ВПЧ E2 на рисунке 2 (адаптировано из ссылки 13). Чтобы определить уровень ложных отрицательных, известных взаимодействиях E2 от ВПЧ-16 были оценены HT-GPCA (рис. 2А). Четыре из 18 взаимодействия не были восстановлены (соответствующий 22% уровень ложных отрицательных). Ложных положительных взаимодействий были измерены составляет 5,8% при использовании 12 ВПЧ E2 белки против случайного набора клеточных белков (рис. 2В). Кроме того, сильное специфичность метода выделен на фиг.2С показывает, что точечной мутации известны мешать E2 связывания с его партнером клетки Brd4 уничтожает NLR отношение (фиг.2С).

Этот масштабный сравнительный interactomic подход недавно был успешно применен на первые три Proбелки из вируса папилломы человека (ВПЧ): E2, E6, E7, происходящих из различных генотипов представитель ВПЧ природного разнообразия в тропизмы и патологий 13,14. Для каждого из ранних белков, иерархической кластеризации взаимодействия профилей основном повторяет филогенез ВПЧ, доказывая надежность подхода и актуальность взаимодействия наборов данных (рис. 3 адаптировано из ссылок 13 и 14). Он может быть использован для корреляции конкретный вирус-хозяин профилей взаимодействие с патологическими признаками, тем самым давая подсказки о причастности вирусных белков в патогенез. Генотип-специфических взаимодействий могут быть извлечены, которые потенциально соответствуют тропизм или патогенных биомаркеры как показано на рисунке 4 для E6 белков ВПЧ (рис. 4 адаптировано из ссылки 14).

Кроме того, функциональные идеи могут выйти из такого масштабного анализа. Например, в interactomic изучениеВПЧ E2 белки, функциональный анализ обогащения привели к идентификации известной семьи, состоящие в клеточных факторов транскрипции, в соответствии с основной ролью E2 как вирусный транскрипционный регулятор. Он также показал неожиданные нападения на функциональное внутриклеточного механизма торговли, открывая новые перспективы для роли E2 в патогенезе ВПЧ 13.

В целом, сравнительный межатомных исследований, проведенных с ВПЧ ранние белки значительно улучшить понимание патогенеза ВПЧ путем сопоставления конкретных профилей взаимодействий фенотипические различия.

Рисунок 1
Рисунок 1. Идентификация белок-белковых взаимодействий использования HT-GPCA. Оба возбудителя и хозяина белки, слитые с бездействиемных половины Gaussia рппсерз люциферазы (GL1 и GL2 частей, соответственно). Когда белки взаимодействуют, активность люциферазы индуцированный близость обеих половин ферментом. Восстановлено Gaussia активность люциферазы рассчитывается из нормализованное отношение люминесценции (NLR), как показано на рисунке справа. Рисунок адаптирован из работы 8. Нажмите здесь , чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. HT-GPCA характеристик. (A) 18 взаимодействия извлеченных из литературы с участием белка Е2 от HPV16 и клеточные белки были протестированы HT-GPCA для того, чтобы оценить ложноотрицательных результатов, связанные с этим т echnique. Отношение РНБ представлены в виде цветового градиента (тепловая карта) с шкалой от черного (отсутствие взаимодействия) на светло-голубой (сильные взаимодействия). Четыре известных взаимодействий не были восстановлены (красные стрелки) дает грубую оценку ложноотрицательных около 22%. (B) 12 HPV Е2 белков были протестированы с 10 случайно выбранных клеточных белков, соответствующих априори отрицательные взаимодействия, для того, чтобы определить ложноположительных из HT-GPCA, который набрал около 5,8%. (C) взаимодействие между Brd4 клеточный белок HPV16 и HPV18 или Е2 белков, как известно, зависит от аминокислот, I73 и I77 соответственно. Когда эти аминокислоты мутировал, HT-GPCA NLR падает с 5-разовое уменьшение демонстрирует высокую специфичность обнаружения взаимодействий. Рисунок адаптирован из ссылки 13. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

jove_content "FO: держать-together.within-страницы =" всегда "> Рисунок 3
Рисунок 3. Сравнение экспериментальных взаимодействие на основе дендрограмм и ВПЧ филогенетических деревьев. Филогению ВПЧ на основе ранних белка Е2 (А), Е6 (В) или E7 (C) последовательности представлены слева от каждого графика. Взаимодействие дендрограмм были получены иерархической кластеризации взаимодействия профилей каждого белка и представлены справа. Значительная сравнения наблюдался между двумя типами дерева, с похожими кластеризации патологических типов (цветные прямоугольники), доказав актуальность взаимодействия наборов данных. Рис адаптировано из ссылок 13 и 14. Нажмите здесь, чтобы увеличить РисЮр.

Рисунок 4
Рисунок 4. Схематическое изображение E6 основных клеточных мишеней. Клеточными мишенями были отсортированы на основе интенсивности взаимодействия и сгруппированы по типу взаимодействующих ВПЧ. Это представление позволяет идентифицировать специфических биомаркеров, таких как FADD, которая взаимодействует только с белками Е6 ВПЧ высокого онкогенного риска. Такой выбор должен иметь решающее значение для канцерогенных чертой всех ВПЧ высокого онкогенного риска и, следовательно, является хорошим кандидатом для использования либо в качестве суррогатного маркера ВПЧ-инфекции или в качестве терапевтической мишени. Рисунок адаптирован из ссылки 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Независимо, дрожжи-два гибридных и млекопитающих взаимодействия анализы, такие как GST выпадающие, Люмьер или MAPPIT, зарекомендовали себя как эффективный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий, но ограничены высокий уровень ложно-положительных и ложно-отрицательных взаимодействий, связанных с этими методами 15. Кроме того, данные растет, что объединение ортогональных методов повышает достоверность полученных взаимодействием данных 7. Недавнее развитие HT-GPCA методику, описанную здесь не только улучшить чувствительность определения двоичных белок-белковых взаимодействий в клетках млекопитающих, но также предложена возможность обрабатывать большое количество взаимодействий сразу.

Стратегии, описанной здесь улучшает покрытие индивидуальных показов Y2H путем зондирования взаимодействия множественных вариантов штамма. Кроме того, повторные испытания взаимодействия с ортогональным методом обнаружения обеспечивает строгие сравнительного взаимодействияния наборов данных, преодолевая ограничения и избежать артефактов присущих двухгибридного методологии. Действительно, так как HT-GPCA происходит в клетках млекопитающих посттрансляционных модификаций и природные внутриклеточную локализацию белков, не изменяются. Наш подход можно таким образом получить в одну стадию взаимодействия карты, которые улучшены по сравнению с теми первую очередь на основе дрожжей двугибридная для взаимодействия датчиков 4.

В этот момент, хотя, рекомендуем быть осторожным при изучении транс-мембранных белков, так как обнаружение взаимодействий может зависеть от локализации фрагментов Gaussia по обе стороны мембраны. В этих случаях, это может быть необходимо для сплавления Gaussia фрагментов в С-конце одного или обоих партнеров. Кроме того, экспрессию люциферазы подвержена влиянию многочисленных параметров, таких как эффективность трансфекции и количества клеток. Поэтому мы настоятельно рекомендуем Фолляблагодаря нормализации процедуры, описанной в разделе протокола, с тем чтобы учесть экспериментальные вариации.

Используя упорядоченные массивы ORF взяты из увеличивая выбор коллекции ORFeome человека, мы предвидим момент в ближайшем будущем, где HT-GPCA могут быть использованы непосредственно в качестве скринингового метода. Это должно существенно улучшить первое охват скринингом так как каждый белок пар затем будут испытаны, и, во-вторых, он должен способствовать автоматизации. Однако более резкое расширение высокой пропускной этого анализа должен быть доставлен развитие в пробирке HT-GPCA анализа с использованием в пробирке системы экспрессии на основе человеческого клеточных экстрактов. Это также позволит контролировать белок-белковых взаимодействий в контролируемой биохимических среды.

Наконец, предстоящих событий не ожидается улучшения визуализации сложных опосредованной люминесценции в живых клетках. В этом случае, HT-GPCA может бытьиспользоваться для обнаружения динамического взаимодействия в контексте добавление лекарства или комплекс ингибиторов таким образом позволяя мониторинга в реальном времени на нарушение взаимодействия.

В целом, такой подход представляет собой эффективный план для любого исследования патоген-хозяин взаимодействие и мы чувствуем, что сравнительный анализ интерактома может обеспечить прочную основу для понимания микроба угон клеток хозяина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана финансирование от Института Пастера и грантов от Ligue Nationale Contre Le Рак (гранты R05/75-129 и RS07/75-75), Ассоциация Pour La Recherche сюр-ле-Рака (гранты ARC A09 / 1/5031 и 4867) и Национальное агентство La Recherche (ANR07 MIME-009 02 и 026 ANR09 MIEN 01). ММ был получателем стипендии MENRT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains Clontech
Minimal SD base US biological D9500
Amino acids Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Acros organics 264571000
Zymolase Seikagaku 120491
DMEM Gibco-Life Technologies 31966
Fetal bovine serum BioWest S1810
Phosphate buffer Saline (PBS) Gibco-Life Technologies 14190
Penicillin-Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies 25300
Renilla luciferase assay Promega E2820
White culture plate Greiner Bio-One 655083
96-wellPCR plates 4titude 4t-i0730/C
Incubator (30 °C) Memmert
Incubator (37 °C) Heraeus
Luminometer Berthold Centro XS-LB 960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
  2. Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
  3. de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
  4. Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
  5. Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
  6. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  7. Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
  8. Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
  9. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
  10. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
  11. Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
  12. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
  13. Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
  14. Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
  15. Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).

Tags

Иммунологии выпуск 77 генетике микробиологии биохимии молекулярной биологии клеточной биологии биомедицинской инженерии инфекции рак биологии вирусологии хозяин-патоген взаимодействий хозяин-патоген взаимодействия взаимодействия белок-белок Высокопроизводительный скрининг люминесценция дрожжи двугибридная HT-GPCA сеть белка дрожжи клетки культуры
Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muller, M., Cassonnet, P., Favre,… More

Muller, M., Cassonnet, P., Favre, M., Jacob, Y., Demeret, C. A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (77), e50404, doi:10.3791/50404 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter