Summary
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in het bloed. Neutrofielen bezitten transcriptioneel gereguleerd functies zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Deze functies kunnen worden bestudeerd met de methode die hier gepresenteerd, die detectie en kwantificering van nucleaire factoren maakt het mogelijk door middel van flowcytometrie in geïsoleerde kernen
Abstract
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed. Deze cellen zijn de eerste om te verschijnen op plaatsen van ontsteking en infectie, zo wordend de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Neutrofielen over belangrijke antimicrobiële functies zoals fagocytose, afgifte van lytische enzymen en de productie van reactieve zuurstof species. Naast deze belangrijke afweerfuncties, neutrofielen andere taken in reactie op infectie, zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Cytokines werven andere leukocyten waarmee de infectie, en remming van apoptose kan de neutrofielen langer leven op de plaats van infectie. Deze functies worden geregeld op het niveau van transcriptie. Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met conventionele methoden reportergen aangezien er geen effidoende technieken voor neutrofiel transfectie. Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken pure neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie. De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB en Elk-1 nucleaire factoren detecteren kernen van neutrofielen en andere celtypes. Aldus is deze methode is een optie voor het analyseren activering van transcriptiefactoren in geïsoleerde kernen van verschillende celtypen.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed 1. Tijdens ontsteking en infectie neutrofielen de eerste cellen te verschijnen op de aangetaste plaats waar zij als eerste verdedigingslijn 2. Neutrofielen bezitten verscheidene antimicrobiële mechanismen 3 met fagocytose, productie van zuurstofradicalen, afgifte van lytische enzymen door degranulatie en productie van pro-inflammatoire cytokines 4,5. Neutrofielen zijn kortstondige cellen die snel krijgen geactiveerd door middel van signalering van verschillende receptoren op het celoppervlak. Hoewel neutrofielen werden beschouwd terminale cellen vanwege hun korte levensduur en omdat ze apoptose ondergaan tenzij geactiveerd tijdens het ontstekingsproces 6 is nu duidelijk dat zij ook hun fenotype wijzigen door het niveau van transcriptie van bepaalde genen. De productie van cytokines 5 en de remming van apoptose 7,8 zijn twee iELANGRIJKE activatie-afhankelijke cel functies geregeld op het niveau van transcriptie in neutrofielen. Nucleaire factor kB (NF-kB) participeert in de transcriptionele controle van cytokineproductie 4 en in de regulatie van cel overleving en apoptose 9-11 in verschillende celtypes.
De signaalwegen die leiden tot activatie nuclear factor meestal bestudeerd door reportergen assays of door elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA). Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met reportergen assays, omdat er geen efficiënte technieken voor neutrofiel transfectie. EMSA assays zijn gebruikt in neutrofielen nucleaire factor activatie 12,13 ontdekken, maar deze methode is ingewikkeld en duur omdat het het gebruik van radioactief materiaal. Nucleofectie is een andere techniek die gebruikt successfully aan monocyten 14 transfecteren. Dus, althans in theorie zouden nucleaire factor activering gedetecteerd in neutrofielen door transfectie (ondanks laag rendement). Dit zou echter techniek duurder, tijdrovend en waarschijnlijk minder kwantitatieve. Microscopische analyse van immuun-cellen kunnen ook worden gebruikt om nucleaire factoren detecteren in de kern. Inderdaad hebben we ontdekt NF-kB translocatie naar de kern zo 15. Helaas is deze techniek ook tijdrovend, minder kwantitatieve, en onder voorbehoud van vooringenomenheid van de waarnemer.
Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken voor neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen via integrines of Fc-receptoren met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie (Figure 1). De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB 15 en Elk-1 16 nucleaire factoren in neutrofielen kernen detecteren. De gevoeligheid van deze methode kan de aanwezigheid van kleine wijzigingen in de nucleaire factor niveaus in de kern. Deze methode kan ook worden gebruikt om het niveau van transcriptiefactoren in kernen van andere celtypen analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van neutrofielen (PMN) uit humaan bloed
- Gebruik ongeveer 20 ml menselijk bloed met heparine (10 U / ml) als antistollingsmiddel. Bloed werd verzameld van volwassen gezonde vrijwilligers door venopuncture. Alle experimenten werden uitgevoerd onder goedkeuring van de bio-ethiek Comite aan het Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Doe 2 ml van 6% dextran T500 in PBS in een 15 ml conische centrifugebuis 10 ml bloed. Meng door de buis twee of drie keer en laat het gedurende 45 minuten om voor bezinking.
- In een nieuwe 15 ml conische centrifugebuis gezet 5 ml Ficoll-Paque.
- Neem de leukocyt-rijke plasma dat gevormd boven gesedimenteerd erytrocyten en voorzichtig pipetteren bovenop de Ficoll-Paque vormen van een tweede laag. Zorg ervoor dat er twee fasen.
- Centrifugeer bij 516 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Na centrifugatie bij de interfase van plasma en Ficoll-Paque er een laag van mononucleaire cellen. Neutrophils zijn aan de onderkant van de buis.
- Elimineer de supernatant, breken de celpellet door op de buis tegen een rek en resuspendeer de cellen door het toevoegen van 10 ml koud (4 ° C) PBS. Opmerking: Het mengen van de cellen en neer te pipetteren wordt niet aanbevolen omdat dit te schadelijk voor de cellen.
- Breng de celsuspensie in een 50 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Breken de cel pellet voor en voeg 10 ml koude (4 ° C) hypotone oplossing (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) tot erytrocyten te lyseren. Meng door werveling van de buis voorzichtig met de hand gedurende precies een minuut.
- Voeg 10 ml koude (4 ° C) hypertone oplossing (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), mix en tel de cellen met een hemocytometer (gewoonlijk> 95% zijn PMN).
Opmerking: Bewaar de buis met de celsuspensie op ijs, terwijl het tellen van de cellen. - Centrifugeer als hiervoor Resuspendeer PMN bij 107 cellen / ml in koud (4 ° C) PBS. Blijf op ijs.
Opmerking: Neutrofielen levensvatbaar blijven en functionele bij 4 ° C gedurende ongeveer 6 tot 8 uur.
2. Activeren van PMN
- Doe 100 pl PMN suspensie (1 x 10 7 cellen / ml) in een 1,5 ml Eppendorf buis.
Opmerking: Voorbeeld van buizen moeten worden gedaan ten minste in duplo. Gebruikelijke negatieve controles behelzen een eerste antilichaam alleen, en secundaire antilichaam alleen. - Voeg de overeenkomstige anti-integrine of anti-Fc receptor monoklonaal antilichaam (mAb) bij 10 ug / ml en geïncubeerd op ijs gedurende 15 minuten.
- PMN wassen door toevoeging van 1 ml koude (4 ° C) PBS, centrifugeren bij 1743 xg (4.500 rpm) in een microcentrifuge, en afzuigen van het supernatant.
- Breken de celpellet door op de bodem van de buis tegen een rack, voeg 1 ml koude PBS en was twee keer in de vorige stap.
Opmerking: Deze wast verwijder ongebonden antilichaam. - Resuspendeer PMN in dezelfde (initial) volume van warm (37 ° C) PBS die 60 ug / ml F (ab ') 2 geiten anti-muis IgG.
Opmerking: De secundaire anti-muis IgG antilichaam zal binden aan de eerste anti-receptor antilichaam en verknoping van de receptor veroorzaken. - Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 tot 20 min, afhankelijk van de nucleaire factor van belang. Voor NF-KB gewoonlijk 15 min, en Elk-1 meestal 5 min.
Opmerking: de cellen te incuberen bij 37 ° C induceert receptor crosslinking, die niet plaatsvinden bij 4 ° C. - Voeg 1 ml koude PBS en centrifugeer 3 min bij 1743 xg in microcentrifuge.
- Verwijder supernatant
- Freeze PMN onmiddellijk in dry-ice/ethanol bad en er hen gedurende 10 minuten te houden.
3. Isolatie en fixatie van Kernen
- Hersuspendeer pellet bevroren PMN in 100 pi koude (4 ° C) hypotonische buffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 en 1 mM vers toegevoegde DL-dithiothreitol [DTT]; PH = 7,9). Het wordt aanbevolen om de buizen te nemen uit het bad dry-ice/ethanol een voor een, en het reinigen van de bodem van de buis vegen voordat u de hypotonische buffer.
- Plaats op ijs, en controleer of kernen integriteit door kleuring een hoeveelheid van de kernen suspensie met trypan blauw. Kernen kijken rond en blauw. Intact PMN niet vies, en celresten verschijnt als blauwe deeltjes met een onregelmatige vorm.
Opmerking: Als kernen suspensie veel intacte cellen of vuil, is het beter om de voorbereiding verwijderen en de procedure met een ander monster herhalen. - Centrifugeer kernen op 775 xg (3.000 rpm) in microcentrifuge gedurende 10 min in een koude kamer. Op dit punt kernen zijn zeer kwetsbaar en extra zorg moeten worden genomen in het houden van de monsters koud en niet centrifugeren bij overmatige krachten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof door heel voorzichtig pipetteren.
- Voeg 100 ul koude 4% paraformaldehyde in PBS om kernen te lossen.
Opmerking: De pellet is zeer los eend toevoegen van de buffer voldoende is om de kernen te resuspenderen. En neer te pipetteren moet worden vermeden. - Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
- Immunolabel kernen voor flowcytometrie of houden gedurende 24 uur bij 4 ° C.
4. Kernen immunokleuring voor flowcytometrie-analyse
- Centrifugeer bij 1743 xg kernen (4.500 rpm) in microcentrifuge gedurende 1 minuut en verwijder supernatant door zeer zacht pipetteren.
- Voeg 100 pl koude (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehyde in PBS om kernen permeabiliseren. Incubeer in ijs gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer gepermeabiliseerd kernen op 1.743 xg in microcentrifuge en verwijder voorzichtig het supernatant. Op dit punt kernen pellets niet goed hechten aan de bodem van de buis. Het wordt aanbevolen om opnieuw gecentrifugeerd indien de pellet losraken.
- Resuspendeer kernen in 500 ul koude 4% foetaal bovine serum (FBS) in PBS om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, en incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Centrifugeerkernen op 1.743 xg gedurende 3 min in microcentrifuge en verwijder voorzichtig het supernatant.
- Resuspendeer kernen in 100 ul koude PBS met 4% FBS en 2,5 ug / ml van mAb tegen de nucleaire factor van belang. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
Opmerking: De gebruikelijke negatieve controles dienen anti-nucleaire factor antilichaam alleen, en FITC-gelabeld secundair antilichaam alleen. - Was tweemaal met 500 pi koude PBS met 4% FBS en centrifugeren bij 1743 xg gedurende 3 minuten.
- Verwijder het supernatant zorgvuldig, resuspendeer kernen in 100 ul koude PBS met 4% FBS en 10 ug / ml van de overeenkomstige FITC-gelabeld secundair antilichaam en incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
- Was tweemaal kernen met 500 pi koude PBS met 4% FBS als in de vorige stap.
- Resuspendeer kernen in 400 ul koude 4% paraformaldehyde in PBS.
Opmerking: Kernen worden in paraformaldehyde om de monster worden bewaard enkele dagen zonder besmettingproblemen die kunnen optreden in de aanwezigheid van serum. - Analyseren onmiddellijk door flowcytometrie of slaan in het donker bij 4 ° C gedurende drie dagen.
5. Flowcytometrie-analyse
- Analyseren immunolabeled kernen in een flowcytometer dergelijke FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) of soortgelijke inrichting.
- Pas overname instellingen: FSC op log-schaal 10-1, SSC bij log-schaal op 196, en poort kernen in een dot-plot.
- Acquire tienduizend kernen per monster.
- Analyseer fluorescentie van FITC-gekleurde kernen door middel van de FL-1-kanaal (506 nm) ingesteld op log-schaal op 400.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De zuiveringswerkwijze beschreven meestal biedt gestimuleerde neutrofielen (PMN) met een zuiverheid van meer dan 95% (Figuur 1A). Geïsoleerde PMN kan dan worden gestimuleerd door verknoping bijzonder receptoren met specifieke monoklonale antilichamen. We hebben gestimuleerd PMN door Fc receptoren en integrinen (Figuur 1B). Zodra gestimuleerd worden PMN gelyseerd en kernen die met hoge opbrengsten. Kernen worden vervolgens immunolabeled voor een bepaalde nucleaire factor, zoals de nucleaire factor kB (NF-KB), met specifieke antilichamen (Figuur 1B).
Kernen gemakkelijk worden herkend als een andere populatie intact PMN in de stromingscytometer een dot-plot (Figuur 2A). In rust PMN een basaal niveau van NF-KB wordt in de celkern (Figuur 2B). Na stimulatie door crosslinking β1 integrines, is NF-kB translocatie naar de kern en dit increm ent in nucleaire NF-kB wordt gedetecteerd als een toename in fluorescentie (Figuur 2B). Ook stimulatie van PMN door verknoping β2 integrines ook geïnduceerde NF-KB-activering zoals aangegeven door een toename in fluorescentie (figuur 2C). De gevoeligheid van deze methode kan de aanwezigheid van kleine wijzigingen in de nucleaire factor niveaus zoals blijkt uit het feit dat β1 integrines die extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, geïnduceerde sterker NF-KB-activering dan β2 integrines, om adhesie moleculen binden aan andere cellen binden (vergelijk figuren 2B en 2C).
Deze methode is ook met succes gebruikt om NF-kB 15 en Elk-1 16 nucleaire factoren in geïsoleerde kernen sporen na Fc receptor stimulatie van PMN. Deze methode is eenvoudig en economisch, zodat deze gemakkelijk worden aangepast aan nucleaire factoren in andere celtypes analyseren.
content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1. Schematische weergave van neutrofielen (PMN) zuivering van bloed, stimulatie van cellen, isolatie van kernen en immunokleuring van nucleaire factoren in geïsoleerde kernen. A) heparine bloed wordt gemengd met dextran aan erytrocyten te agglutineren. Na erytrocyten sediment, de leukocyt-rijk plasma boven op de rode cellen. Dit leukocyt-rijk plasma wordt overgedragen en gelaagd bovenop Ficoll-Paque in een andere buis. Na centrifugeren wordt een laag van mononucleaire cellen (MNC) vinden op de interfase van plasma en Ficoll-Paque. PMN bevinden zich aan de onderzijde van de buis. B) PMN Geïsoleerd gestimuleerd door verknoping celmembraan receptoren met specifieke monoklonale antilichamen (mAb) (oranje) en een secundair antilichaam (donkergroen). Nucleaire factor kappa B (NF-kB) scheidt van de inhibitor IkB en transloceert in de kern. Kernen worden dan geïsoleerd, gepermeabiliseerd en immunolabeled tegen NF-KB of andere nucleaire factor met een bepaald mAb (geel) en een FITC-gelabeld secundair antilichaam (lichtgroen). Vaste kernen worden geanalyseerd door flow cytometrie (FACS). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Analyse van NF-KB-activering in neutrofielen (PMN). A) Intact PMN (linker paneel) of geïsoleerde kernen (rechter paneel) weergegeven met twee verschillende populaties in flowcytometrie dot-plot grafieken. Cellen en kernen kunnen onafhankelijk worden geanalyseerdcreëren van verschillende poorten, R1 (rood) voor intacte cellen en R2 (blauw) voor geïsoleerde kernen. B en C) Kernen werden geïsoleerd uit PMN immunolabeled voor NF-kB (p50 subunit) vóór (groene stippellijn), of na cellen werden geactiveerd door verknoping β1 integrines (B), die specifiek monoklonaal antilichaam TS2/16 (blauwe lijn) of β2 integrines (C), die specifiek monoklonaal antilichaam IB4 (rode lijn). Het grijze gebied is de basale fluorescentie van het FITC-gelabeld secundair antilichaam alleen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zuiveringswerkwijze hier beschreven kan de isolatie van gestimuleerde neutrofielen (PMN) met zuiverheid van meer dan 95% (bepaald door microscopische waarneming), in een korte tijd. Soms neutrofielen kunnen worden verontreinigd door erytrocyten indien deze niet volledig gelyseerd. Dit heeft meestal geen invloed de techniek, aangezien erytrocyten en PMN kan gemakkelijk worden onderscheiden als afzonderlijke celpopulaties door flowcytometrie. Geïsoleerde PMN kan dan worden gestimuleerd door verknoping bijzonder receptoren met specifieke monoklonale antilichamen. In feite kan PMN ook worden gestimuleerd door farmacologische middelen of hechting op diverse substraten of andere cellen. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om signaalwegen die tot veranderingen van nucleaire factoren in PMN kernen nadat cellen worden geactiveerd door vrijwel elke relevante biologische stimulus analyseren.
Zodra PMN worden gestimuleerd, de werkwijze beschreven in dit document maakt een snelle en efficient zuivering van kernen en voor de detectie in deze kernen van NF-kB door immunofluorescentie en flowcytometrie analyse. Na PMN stimulatie van bepaalde receptoren, is NF-kB in het cytoplasma vrijkomt uit de inhibitor IkB en traslocated in de nucleus (Figuur 1B). Aldus wordt het niveau van NF-KB-activering bepaald door de hoeveelheid van NF-kB in de kern. Omdat deze methode kan detecteren en de hoeveelheid NF-kB meten in de kern kan gemakkelijk bepalen activering van deze nucleaire factor. De werkwijze kan detecteren op soortgelijke wijze activatie van andere nucleaire factoren, wanneer hun activering is gekoppeld aan wijzigingen in de nucleaire niveaus. Activeert wijzigingen van nucleaire factoren kunnen door veranderingen in de hoeveelheid factor in de kern, zoals het geval is voor NF-kB, of veranderingen zoals fosforylering in de moleculaire structuur van de factor, zoals het geval is voor Elk-1. Deze methode kan worden gebruikt om te detecteren cijzigingen van nucleaire niveaus van elke molecule waarvoor een specifiek antilichaam beschikbaar is.
Deze methode levert een zuivere populatie kernen in een eenvoudige en snelle wijze. Cellen worden bevroren en gelyseerd in een hypotonische buffer die barsten de cellen open en laat intacte kernen. Intact PMN of geïsoleerde kernen worden meestal weergegeven als twee verschillende populaties in de flowcytometrie dot-plot grafieken. Cellen en kernen onafhankelijk geanalyseerd door het creëren van verschillende poorten voor intacte cellen en geïsoleerde kernen. In een intacte cel monster een poort wordt gecreëerd rond het gebied waar de meeste cellen worden weergegeven. Ook met een kernen monster een poort wordt gecreëerd rond het gebied waar de meeste kernen verschijnen. Normaal worden deze twee poorten zijn op verschillende plaatsen van de dot-plot grafiek. Deeltjes die soms worden waargenomen uit deze poorten meestal cel of kernen puin, en ze zijn weggelaten uit de analyse. Als de cel en kernen poorten overlappen, betekent dit meestal dat de kernen preparaat niet is cleeen. Analyse van deze kernen preparaat niet betrouwbaar, en is het beter om de procedure te herhalen met verse buffers.
De methode is ontwikkeld om te werken met menselijke PMN, maar is ook met succes toegepast op verschillende cellijnen van leukocyten oorsprong 15. De werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan kernen isoleren van verschillende celtypes. Het is belangrijk om de procedure te beginnen met een minimum van 1 x 10 6 cellen om voldoende kiemen voor een efficiënte flowcytometrie analyse. Als kleine aantallen kernen op het einde, is het beter de werkwijze routinematig beginnen met 3 x 10 6 cellen.
Tijdens de lysis stap moet bevroren cellen niet mogen ontdooien. Dit resulteert in lage opbrengst door cel afbraak. Derhalve wordt aanbevolen om een buis vinden op het tijdstip van de dry-ice/ethanol bad om cellen te lyseren. Ook is het belangrijk om Neem de buitenkant van de buis te reinigen voordat het toevoegen van de hypotonische lysisbuffer. Als dat niet gebeurt, de buffer soms bevriest in de buis, hetgeen een inefficiënt cellysis en resulteert in kernen preparaten die zijn verontreinigd door intacte cellen. Toch is dit geen ernstig probleem omdat in de meeste gevallen intacte cellen en kernen kunnen worden gescheiden door flowcytometrie.
Omdat kernen zeer fragiel voordat ze vastgesteld, is het belangrijk om alle bufferoplossingen verkoudheid bij 4 ° C door ze in ijs. Na centrifugeren kernen pellets soms los op de bodem van de buis, moet dus extra zorg bij het verwijderen van de supernatant. Het is beter dat een micropipet dan met vacuüm aspiratie. Bij gelegenheid kan de buis opnieuw worden gecentrifugeerd, maar de aanbevolen centrifugeren marktkrachten mag niet buitensporig zijn, want dit beschadigt de kernen.
Werkwijze gedetecteerd NF-KB-activering met antilichamen die specifiek de p50 subeenheid (figuur 2) en ALSo de p65 subeenheid 15 van deze nucleaire factor. Ook werd kwantificering van receptor geïnitieerde nucleaire activering van ERK en Elk-1 ook met succes door middel van deze methode 16, met de bijbehorende specifieke antilichamen tegen deze moleculen. Bovendien is de gevoeligheid van deze methode kon detecteren van kleine veranderingen in NF-kB nucleaire niveaus door differentiële stimulatie van PMN door verschillende integrinen (figuur 2), en ook door farmacologische remming van Fc receptor geïnitieerde signaalroutes 16 . De combinatie van een goed specifiek antilichaam en een efficiënte fluorescent-gelabelde tweede antilichaam biedt grote gevoeligheid en maakt de detectie van kleine veranderingen in de hoeveelheid van de nucleaire factor plaats in kernen. Dit maakt een kwantitatieve vergelijking van de niveaus van de nucleaire factor voor en na stimulatie verschillende omstandigheden. Ook kan deze methode detecteren geïsoleerd nuCLEI, vrijwel elk molecuul waartegen een goed specifiek antilichaam beschikbaar is. Bovendien kan de immunokleuring deel worden vereenvoudigd met een antilichaam direct gelabeld met het fluorochome, die bovendien zal verbeteren gevoeligheid. Tenslotte de werkwijze heeft grote flexibiliteit omdat veel verschillende fluorochomes worden gebruikt. Zo kan deze werkwijze worden toegepast op vele verschillende signaaltransductie studies dat veranderingen van eiwitniveaus in de kern omvatten.
Kortom, de brede toepasbaarheid en de gevoeligheid van de werkwijze beschreven in dit document, plaats als een eenvoudige en goedkope oplossing voor signaaltransductie studies dat veranderingen van eiwitniveaus in de kern van een verscheidenheid aan celtypen betrokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Nancy Mora bedanken voor haar technische bijstand.
Dit werk werd gefinancierd door subsidies voor onderzoek 48573-M en 168098 van Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexico, en door subsidies IN212308 en IN205311-2 van Dirección General de Asuntos del Persoonlijke academico, Universidad Nacional Autónoma de Mexico, Mexico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W.
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
