Summary
Несмотря на функциональные и медицинское значение гипоталамуса
Abstract
Генетическая модификация конкретных регионах развивающегося мозга млекопитающих является очень мощным экспериментальным подходом. Однако, создавая мутантов романа мыши часто удручающе медленно. Было показано, что доступ к мозга мышей развивается внутриутробно с разумной пост-операторы выживание возможно. Тем не менее, результаты этой процедуры были зарегистрированы почти исключительно для самого поверхностного и легко доступной частью развивающегося мозга, то есть мозга. Таламус, более узком и медиальной области, оказалось более трудным для ориентации. Трансфекции в глубоком тех ядер, которые гипоталамуса, является, пожалуй, самым сложным и поэтому очень мало результатов не поступало. Здесь мы показываем, процедура ориентирована на весь гипоталамуса нейроэпителия или его часть (гипоталамус регионов) для трансфекции через электропорации. Ключи к нашему подходу длиннее наркоза раз, инъекции в тHird желудочка, и надлежащий вид и расположение электродов. Кроме того, мы покажем результаты адресности и последующим гистологическим анализом наиболее встраиваемые ядра гипоталамуса, тело сосцевидный.
Introduction
Генетические манипуляции с эмбриональными мозга мыши является предпочтительным подходом, чтобы узнать о развитии регулирования. Поколение мутантных линий мышей, однако, медленно и дорого. Один мощный метод введения специфических генетических изменений в развивающихся нейронов мозга млекопитающих является внутриутробно электропорации. По сути, методика состоит из трансфекции ДНК в эмбриональных нейроэпителия мозг посредством электрических импульсов, затем позволяя эмбриона выжить в течение определенного периода времени, собирают мозга и исследовать их возможного романа, информативным фенотипов. Таким образом, экспериментатор может проверить гипотезу почти сразу же, без длительных периодов ожидания необходимые для производства мутантных мышей.
Трансфекции ДНК в развивающихся эмбрионах началось с ово в электропорации на куриных эмбрионах 1. Существенным доказательством правильности концепции для мыши проводили в культуре
Основная проблема заключается в трансфекции мозга эмбрионов развивается внутриутробно, не убивая их или матери. Изучение выполнить необходимые операции (лапаротомию, инъекцию, электропорацию) требует длительного периода подготовки. Как только операция была освоена до точки, где соотношение выживаемость эмбрионов является приемлемым, следующий ключевой вопрос: какие структуры мозга доступны? Не удивительно, что первые опубликованных работ показывает результаты, полученные с внутриутробно электропорации сосредоточены на развитии коркового 5-9. Это по-прежнему верно для большинства публикаций с помощью этой техники, так как область развивающегося мозга мыши наиболее доступной для хирургических процедур коры (рис. 1). Процедура внутриутробно электропорации в коре была описанав печати в 10 и 11-14 видео. Модификация методика может быть использована для нацеливания на вентральной частью конечного мозга, базальных ганглиев 15.
За конечный мозг, промежуточный мозг (классически разделен на таламус и гипоталамус) является областью переднего мозга труднее достичь. Небольшое число работ, отчетов адресности его спинной и наиболее доступной части таламуса 16-19.
Гипоталамус является самой вентральной части переднего мозга, поэтому один локализованный наиболее глубоко из дорсальной поверхности (кора) (рис. 1). Этот регион остается трудной задачей для исследователей стремится к генетически манипулировать мозга мышей в период внутриутробного развития. Насколько нам известно, лишь очень немногие статьи отчета об итогах внутриутробно трансфекции в гипоталамусе мышей 20,21. Однако функциональное значение гипоталамуса cannoт быть завышена, так как она регулирует поведение, как еда и питье, спаривание, селекции и воспитания 22. Кроме того, изменения в развитии гипоталамуса способствовать происходят позже в жизни условиях, таких как ожирение, гипертония, диабет и преждевременное половое созревание 23. Будучи в состоянии изменить генетически гипоталамуса во время развитию обеспечит очень мощный инструмент, чтобы понять это.
Основной хирургический протокол для лапаротомии беременных мышей, которые мы используем здесь аналогична использованной в других протоколов 11,13,14,24. Мы опишем здесь кратко рассказать для полноты картины. Ключом к нашему процедура, с другой стороны, являются тип анестезии месте инъекции, тип электродов и вставки и позиции положительного электрода по отношению к голове эмбриона. Мы предпочитаем, чтобы вызвать и поддерживать наркоз посредством вдыхания газа по сравнению с простыми анестезии внутрибрюшинной, поскольку оно включает в себяНесколько более длительных периодов наркоза при тяжелую операцию. Isoflurane результаты ингаляции в быстрое восстановление после анестезии, так как обычно мать демонстрирует нормальное поведение уже минут после операции. Самый простой точке ввода этого раствора ДНК со стеклянной микропипетки в боковой желудочек, который, однако, совершенно непригодны для гипоталамус электропорации. Инъекций непосредственно в третий желудочек действительно важно, чтобы целевой глубоко диэнцефальных структур. Вполне возможно, для трансфекции гипоталамус от E12.0 E12.5 или со стандартными, имеющийся в наличии электроды. Мы обнаружили некоторые из электродов производства Nepa гена (Chiba, Япония), особенно хорошо подходят для этой цели.
С нашим образом получаем трансфекции всего гипоталамуса нейроэпителия или частичное, региональных трансфекции в зависимости от ориентации электрода. Здесь мы показываем, метод, с помощью трансфекции тела сосцевидный, возможно,Самая глубокая и встраиваемые всех ядрах гипоталамуса. Кроме того, мы покажем подробный гистологический анализ трансфекции клеток вплоть до клеточного уровня разрешения.
Сравнение внутриутробно электропорации с другими подходами к трансфекции мыши развивающегося мозга внутриутробно, можно найти в разделе обсуждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка ДНК и стеклянные микропипетки для инъекций
- Хорошее качество стекла микропипетки существенное значение для снижения начальной большим количеством абортов в связи с потерей амниотической жидкости. Процедура вытащить стекло микропипетки была хорошо документирована 13,18,25. Используйте 1,2 мм в диаметре капилляров тянут в обычных Саттер Р-97 устройства с настройками P = 500; Тепло = 300; Потяните = 40; Скорость = 50; Время = 50. Установите съемник с 3 мм "корыта" нитей (Саттер инструмент FT330B). 2 нити мм Размер дали для нас менее удовлетворительные результаты. С другой стороны, скашивать микропипетки советы не кажется, чтобы улучшить результаты для нас.
- Растворить очищенный, без эндотоксина плазмидной ДНК в PBS (степень клеточной культуры), содержащем 0,1% Fast Green до конечной концентрации от 1 до 2 мкг / мкл. Быстрый зеленый сделает введенного раствора видны в эмбриональном желудочка мозга.
- Загрузите 10 мкл раствора ДНК в стекло микропипетки. Подключите стекла микропипетки для системы впрыска (Pico насоса) или рот пипеткой.
2. Анестезия
Подготовьте хирургический стол с грелкой и хирургических инструментов. Включите холодного света источников, что облегчает визуализацию эмбрионов. Лечить хирургические инструменты использованием, например, стеклянная бусина стерилизатор.
Три различные процедуры анестезии возможны для этого протокола (см. обсуждение). Здесь мы опишем тот, который мы считаем лучшим, изофлураном ингаляции для вводного наркоза (расход 0,5 л / мин), а также техническое обслуживание (скорость потока 1 л / мин).
- Введем беременных мышей в небольшой прозрачный (так мышь остается видимым) контейнер соединен с Komesaroff Mark 5 Обезболивающее Устройство по короткой длины трубки.
- Заполните испаритель с изофлуран, а затем открыть кислородный баллон прикреплен к устройству. Удар одной или двумя импульсами isoflurane / кислорода (0,5 л / мин) в контейнер, содержащий мыши и часы для наркоза установить дюйма
- Отводим мышь, накройте глаза мазью, чтобы предотвратить их от высыхания и соответствующие маске анестезия с ног на голову немедленно.
3. Лапаротомия
- Наведите брюхом вверх на грелку (в противном случае его температура тела понизится очень быстро, уменьшая шансы на выздоровление) и закрепите его тело на место, фиксируя свои четыре ноги в стороны с лентой. Оценить глубину анестезии, проверяя потери ответ на рефлекторная стимуляция (например, ноги или хвост щепотку с фирмой давления).
- Бритье брюшной поверхности и дезинфицировать его с iodophorpovidone-йод (Braunoderm).
- Сделайте продольный разрез (от 1 до 1,5 см в длину) на кожу живота. Затем вырежьте брюшины. Наведите хлопка марли вокруг разреза. Сделайте один рог матки видимый и вытащить его тщательно с тупыми щипцами на PBS-промытую гаузé. Промойте матки с PBS очень часто, чтобы держать его всегда влажной (2А и 2В). Во время всей процедуры Не вытягивайте mesometrium или матки плотно, так как высокое давление внутри матки будет передавать в эмбрион увеличивает шансы потери жидкости при инъекции приводит к аборту.
4. Инъекции ДНК в желудочек головного мозга
- Держа матки таким образом, что желудочки мозга может быть отображено. Не широко репозиция эмбрион, который находится в неблагоприятном положении - это только увеличивает шансы на аборт.
- Глядя на голове эмбриона сверху, визуально локализовать разрыв или трещина между левым и правым полушариями корковой. Полушарий легко отличить и боковых желудочков в них (не целевые), как правило, воспринимается как несколько темнее формы. Если эмбрион оказывается прекрасно ориентируются для инъекции ДНК (Figurы 2С и 2D), то можно проколоть стенку матки и ввести третий желудочек сразу. Держа стекло микропипетки углом 45 ° к стенке матки и пункции в ростральной конце зазора между кортикальной полушарий, проникающие в течение примерно 1 мм. Таким образом, кончик стеклянной микропипетки войдет в третий желудочек головного мозга (не бокового желудочка) (фиг. 2С и 2D). В эмбрионы менее благоприятно ориентированных полезно первого прокалывания стенки матки (всегда при 45 °) в непосредственной близости от эмбриональной головы, поместить кончик пипетки в правильном положении между кортикальной полушарий и только тогда проникать в мозг. Введите приблизительно 1 мкл ДНК-раствора в третий желудочек (хорошая инъекции заполняет желудочка с зеленой жидкости). Повторите ту же процедуру со всеми эмбрионов одной матки рога. Это позволяет некоторое время раствор ДНК, чтобы смешать поровну с жидкостью желудочка и достичь entirэлектронной нейроэпителия.
5. Таргетинг Гипоталамус для электропорации
- Включите электропоратора и настройте параметры в соответствии с эмбриональными возраст (для E12.5 мы используем 5 прямоугольных импульсов, 50 В, 50 мс ON/950 мс OFF). Использование в качестве положительного полюса нержавеющей стали игольчатый электрод (CUY550-10), так и отрицательным полюсом круглый плоский электрод (CUY700P4L). (Важно, что электроды являются меньшими, чем эмбрион, так как в противном случае текущий просто течет вокруг эмбриона, но не через него.)
- Выберите для электропорации эти эмбрионы которых спинной стороной вверх (т.е. повернулся к экспериментатору) (как большинство из них), и отказаться от тех, чья ориентация не является благоприятным. Теперь можно коснуться матки с этанолом дезинфекцию пальцами или рукой в перчатке. Холдинг матки щипцами, однако, будет вмешиваться в протекание тока во время электропорации.
- Пирс стенке матки по голове эмбриона между АНМiotic мешок и плацента, толкая вниз через его с кончика иглы электрода. Используйте указательный палец другой руки, как тяга блока. Около 5 мм кончик электрода должны быть теперь между амниотической и стенкой матки, примерно на уровне среднего мозга (рис. 2E и 2F). Помните, что это "ориентации электрода", так что его позиция будет определять, какие части гипоталамуса нейроэпителия, скорее всего, получите трансфицированными. Эмбрион должен быть очень аккуратно "сжал" между электродами.
- С другой стороны, положение круглый плоский электрод вне матки стены на противоположной стороне головы эмбриона (фиг. 2Е и 2G).
- Используйте педаль подавать напряжение (50 В, 50 мс ON, OFF 950 мс, 5 прямоугольные импульсы).
- Медленно вытяните игольчатый электрод из матки в то время сдерживает матки с указательным пальцем другой руки - если amnioTIC жидкости теряется через стены проколотые, как правило, эмбрион будет аборт. Повторите процедуру со всеми эмбрионов.
- Вернуться рога матки в брюшную полость и повторить инъекции и электропорации в рог остатка.
6. Отделочные хирургии
- После инъекции и электропорации всех эмбрионов, поместите матку обратно в животе очень тщательно, расположены именно так, как они были до и влажной брюшной полости физиологическим раствором перед его закрытием.
- Ушивания брюшины с кетгут хирургический (Vicryl полиглактин 910, 5-0, Ethicon V4914). Для замыкания кожей использовать "узловой шов" methodwith более устойчивы шва (Supramid нейлон, 6-0, Serag Wiessner К 07171L).
- Лечить живот поверхность с повидон-йод (Braunoderm) и вводят нестероидных противовоспалительных подкожно (например, 100 мкл раствора 1:10 Римадила в 0,9% NaCl) или, еще лучше, как опиоидные BUprenorphine (Temgesic от 0,05 до 0,1 мг / кг массы тела в 0,9% NaCl), чтобы облегчить боль.
- Снимите мать из наркозно-дыхательного аппарата и поместить его в клетку, которая нагревается грелку. Монитор мыши постоянно, пока она не будет полностью оправилась от наркоза. Позже, проверьте животных ежедневно, чтобы застраховать их экономика восстанавливается после процедуры без каких-либо признаков инфекции или боль.
7. Анализ результатов
- Урожай эмбрионов (или postnatals) в соответствии с желаемым день анализа. Послеродовая мышей (с 1 по 2 дневных) погибают путем обезглавливания.
- Отделить каждый эмбрион в соответствии с предыдущим аннотации электропорации. Проанализируйте мозга под стереомикроскопом и проверить под микроскопом на зеленый флуоресцентный сигнал (от репортера GFP) в соответствующем регионе.
- Выбранная мозга могут быть проанализированы "свежий": зафиксировать ткань в течение короткого времени в 4% параформальдегиде и вставлять в 4% агарозном или желатиномlbumin, то раздел о Vibratome типа устройства (рис. 3). Для получения более подробной иммуногистохимического анализа (рис. 4), крио защитить мозг в 30% раствор сахарозы, вставлять в ОСТ монтажа среды (Tissue Tek), то сократить 20 мкм срезы в криостат.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Большая часть нейронов гипоталамуса рождаются между E11.5 к E15.2, в соответствии с рождения-знакомства анализа в крысу 26 переведены на несколько короче развития мышей 27,28. Пик гипоталамуса нейрогенезом достигается при E12.5 29-31. Соответственно, при трансфекции возраста выбранных для данного исследования (E12.5), большая часть нейронов гипоталамуса могут быть помечены в любой данный ростро-каудальном уровне.
Анализ на E18.5 на толстой Vibratome типа секций (фиг.3А и 3В) показывает, что весь ростро-расширение хвостового гипоталамо нейроэпителия является доступным для электропорации (фиг. 3А). В любом возрасте, нейроны могут быть помечены на всех боковых Медио-уровней (рис. 3В), что согласуется с линии исследования 32. Тело маммиллярных (MBO) является нейронов ядра развивается из нейроэпителия накладки выемку в наиболее Вентрал и каудальной части переднего мозга. Это делает МВО в принципе очень трудно цели. Функционально MBO является ключевой структурой для консолидации памяти и ее патологические результаты вырождения в антероградная амнезия 33. Мы были в состоянии трансфекции репортера плазмиды очень конкретно в это ядро (рис. 3C и 3D). MBO нейронов аксоны образуя два очень характерных и функционально важные участки, которые также помечены после трансфекции (показаны стрелками на рисунке 3в). Поперечные срезы показывают, что нейроны, рожденных в Е12.5 (возраст трансфекции) образуют изогнутый "слой" вокруг немеченого массы нейронов созданный ранее (т.е. до трансфекции эксперимент имел место) (рис. 3D).
Помимо общих закономерностей миграции показал экзамен на толстых секций с помощью флуоресцентных белков репортером, при более детальном анализе результатов вероятныйIBLE с использованием специфических антител на криостат секций (рис. 4). Для анализа примера выбраны здесь, MBO, мы приготовили горизонтальных участков параллельно плоскости радиальной глии процессов, исходящих из выемка маммиллярных (Фиг.4А). Затем мы определили MBO нейронов рожденных от нейроэпителия помечены на E12.5 с помощью антитела против GFP (фиг. 4В). Как и ожидалось, антитела, меченного ограниченной группе MBO клеток (стрелка на рис 4B, 4C, 4D и). Эта группа была расположена между двумя немеченого латеральной и медиальной MBO областей, соответствующих соответственно MBO нейронов, рожденных до (боковой) и после (медиальной) E12.5. В качестве примера здесь мы совместно окрашивали антителами против нестин (красный на рисунках 4C и 4D) для того, чтобы показать режиме миграции индивидуально меченых нейронов на радиальных глиальных процессов нейроэпителия.
Рисунок 1. Относительные положения гипоталамуса и коры в середине беременности. Сагиттальных (А) и поперечных (B) диаграммы мозга эмбрионов мыши середине беременности показывает наиболее спинной и самые поверхностные структуры переднего мозга, кора (CTX, синий), а также наиболее глубоко размещены передний мозг структуры, гипоталамус (HY, красный).
Рисунок 2. Схема процедуры. (A) беременных плотины находится под наркозом и матка подвергается. (B) В каждой матки отек выявления плацентарной вставки (черная стрелка),Плацента (PL) и эмбриона. ME, mesometrium. (С) определение точки ввода в середине левого и правого полушарий корковых (красный X). (D) Введите раствора ДНК в третий желудочек. (Е) игольчатый электрод (положительный) проникает в стенку матки между эмбрионом и плацентарный вставки. Плоский электрод (отрицательный) опирается на свободной стороне матки. (F) Гипотетический вид из плацентарной сбоку, показывающий положение положительного электрода вдоль гипоталамуса. (G) Вид со стороны свободного матки, показывающий положение отрицательного электрода.
Рисунок 3. Трансфекции всего гипоталамус или его часть. Толстые вибрационного микротомом участках четырех различныхдикого типа E18.5 мозг мыши показывает гипоталамуса после внутриутробного трансфекции ДНК плазмиды, несущей гены флуоресцентного репортера GFP (A, C) или CFP (B, D) на E12.5. (A) Сагиттальный разделе (ростральнее слева) показывающие гипоталамусе трансфицированными от ростральнее хвостового. Шкала бар 500 мкм. (B) Поперечный срез. На трансфицированных стороны, меченые клетки могут быть найдены на всех средне-боковой уровней. (C) сагиттальный разрез, показывающий в частности трансфицированных маммиллярных тела (пунктирная линия, звездочка) и маркировка характерной аксонального дерева (стрелки). (D) Поперечное сечение через тело сосцевидный (пунктирная линия). На сторону электропорации (звездочка), меченая полоса, соответствующая нейронам родился E12.5 можно увидеть. Hy, гипоталамус, Th, таламус
Рисунок 4. Анализируя конкретные шаги в развитии гипоталамуса. (А) Схема горизонтальный разрез развивающегося мозга показывает тело сосцевидный (красный). Область показано на (B) и (C) оформлена. (B) антител маркировки GFP на горизонтальный разрез E18.5 тело маммиллярных после трансфекции GFP в E12. Клетки родился в E12.5 составляют отдельную группу в ядре (стрелка в B, C и D). Масштабной линейки 100 мкм. (C) антител маркировки нейроэпителиальная маркер нестин (красный) на сечение, показанное на (B). Шкала бар 100 мкм. (D) Отдельные клетки могут быть идентифицированы в конкретной группе E12.5 в организме сосцевидный при большом увеличении. Шкала бар 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Об анестезии: С внутриутробно электропорации в гипоталамусе может быть технически трудной и требует большего времени наркоза, мы предпочитаем, чтобы вызвать и поддержания анестезии при введении смеси кислорода и изофлурана. По нашему опыту, животные могут оставаться соответствующей анестезии таким образом в течение периодов до одного часа, по крайней мере, восстановление мать очень быстро, и выживаемость эмбрионов улучшилось. Другие подходы к анестезии, также доступны. Самый простой способ заключается индуцирования и поддержания наркоз путем интраперитонеальной инъекции 2,5 мл / кг массы тела в смеси кетамина (25 мг / мл), Xylazin (1,2 мг / мл) и Acepromazin (0,35 мг / мл) в 0,9 % стерильного NaCl ("тройной комбо»). С этой смеси в одиночку, в дозах, рекомендованных здесь, наркоз около 30 мин (до 45 мин, в некоторых случаях) индуцируется. Обычно этого достаточно для внутриутробно электропорации в коре на E12.5 (через инъекциюперегиба в боковой желудочек). Преимуществом этого способа является то, что полностью исключает необходимость в наркоз-устройство и другое оборудование. Тем не менее, этот тип анестезии внутрибрюшинной не рекомендуется, если более длительное время операции являются необходимыми, так как дальнейшие инъекции у анестезированных животных для того, чтобы продлить срок анестезии, часто с последующей смертью. Кроме того, можно объединить внутрибрюшинный и ингаляционной анестезии на первом использованием инъекции "тройной комбо» (см. выше), чтобы вызвать наркоза, а затем поддерживать его при вдыхании изофлуран / кислород. Хотя с этим конкретным способом наркоз может поддерживаться так долго, как это необходимо, восстановление беременных мышей после операции не такое хорошее, как при вдыхании в покое. Кроме того, всякий раз, когда мы используем "тройной комбо" внутрибрюшинного введения, выживаемость эмбрионов уменьшается.
Расположение электродов на голове эмбриона, как показано на Лапаротомии достаточно проста. Тем не менее, экспериментатор достигает уровня умения, что позволяет высокий коэффициент выживаемости эмбрионов (после внутрижелудочкового инъекции с последующим введением электрических импульсов) после плоской кривой обучения. Индивидуальное мастерство является важным фактором, так что внутриутробно электропорации в целом и его применении в гипоталамус, в частности, может оказаться не совсем практично для некоторых студентов . Для сокращения периода обучения, а также для повышения воспроизводимости и статистического анализа мы сочли целесообразным, чтобы заполнить подробный протокол в том числе информация о количестве и положении эмбриона, а также внешний вид, качество впрыска и приблизительное положение электродов для отдельных эмбрионов. Сравнивая эти данные об эксперименте с окончательными результатами, на эмбрион за основу эмбриона оказалась полезной для понимания и совершенствования порядка. Другие сообщения 20,21 которые ориентированы гипоталамусе Nepagene пинцет типа электродов. Мы последовательно получить лучшие результаты с применением одной иглы-электрода и одной плоской крышкой-электродом того же производителя. По нашему опыту, использование этого метода позволяет ростро-каудальном таргетинга легче. Пинцет электроды, кажется, требуют либо больше опыта / навыка или гораздо большее число экспериментов для того, чтобы привести к полезным результатам.
Другая группа подходов позволяет избежать операции полностью, поскольку он основан на инъекции конструкции для трансфекции в поток крови беременной мыши. Хвостовую вену (хвостовую вену) инъекции ShRNA 34,35 или 36 плазмид имеет потенциал, чтобы манипулировать генетически очень ранних эмбрионов, хотя конкретного региона целевой группы не возможно с помощью этого метода. Это перспективный подход, кажется, не готова еще для общего применения. Вирусные частицы (адено-ассоциированный вирус) вводили в лицевой вены новорожденных мышей (но не старых мышей) способен трансфекции нейронов головного мозга 37. Наконец, наночастицы, которое в конечном счете может быть использована в качестве ДНК-носители, можно достичь мозга после хвост объемЭйн-инъекции у взрослых мышей 38. Эти два метода, которые открывают возможность трансфекции очень ранних эмбрионов, должны наши знания еще не использовалась на беременных мышах.
Возраст трансфекции и сбор: для изучения процедуры, она, вероятно, лучше, чтобы попытаться трансфекции E14.5 эмбрионов, а затем перейти на ранних, более трудным эмбриональных возрастов. По нашему опыту, GFP выражения видна в ультрафиолетовом свете уже через 24 часа после трансфекции. После E12.5 трансфекции GFP выражение E18.5 очень сильна. Мы электропорации на E12.5, E13.5, E14.5, E15.5 и и проанализированы E17.5, E18.5, P0 и P1 в состоянии найти сильное выражение репортера во всех случаях. Когда эмбрионы, чьи мозги были трансфицированы внутриутробно разрешают достичь срок (для послеродового сбора данных), иногда они избирательно поедают матери. Это говорит о том тонкие изменения в щенка внешний вид или поведение индуцированных мозга манипуляции (их темперойтура может быть ниже, а может быть, они не излучают право звуковых сигналов). В те послеродовой животных, которые выживают материнской забой, мы не наблюдали экспрессию репортера вплоть до P1 по крайней мере. Отчеты в выражении литературы шоу трансфицирован конструкций даже через четыре месяца после рождения 10.
Векторы для электропорации: мы используем бицистронных репортера плазмиды обусловлен CAG промоутер 39, а затем кДНК представляющего интерес гена, разделенных внутренним входа рибосом (IRES) 40, из кДНК флуоресцентного репортера, например, расширенные зеленый флуоресцентный белок 41. CAG промоутера настолько сильна, в нейронах, что он может производить уровни ДНК слишком высока для трансфекции клеток, убивая их. Хотя мы никогда не наблюдали апоптоз клеток после трансфекции одним из возможных решений, должны появляться проблемы, было бы использование менее эффективно, промотор EF1 как альфа 42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Немецкого исследовательского фонда (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
