Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

وعلى الرغم من أهمية وظيفية والطبية من منطقة ما تحت المهاد،

Abstract

التعديل الوراثي للمناطق معينة من أدمغة الثدييات النامية هو المنهج التجريبي قوية جدا. ومع ذلك، وتوليد المسوخ الماوس الرواية غالبا ما تكون بطيئة بشكل محبط. ولقد ثبت أن الوصول إلى مخ الفأر النامية في الرحم مع بقاء ما بعد الجراحة معقول هو ممكن. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن النتائج مع هذا الإجراء على وجه الحصر تقريبا في معظمها سطحية ويمكن الوصول إليها بسهولة من الدماغ النامية، أي القشرة. وقد ثبت المهاد، وهي منطقة أضيق وأكثر وسطي، أكثر صعوبة لهدف. ترنسفكأيشن لتكوين نواة أكثر عمقا، خصوصا تلك من منطقة ما تحت المهاد، وربما تم الإبلاغ عن النتائج الأكثر تحديا، وبالتالي عدد قليل جدا. هنا علينا أن نبرهن إجراء لاستهداف الظهارة العصبية طائي بأكمله أو جزء منه (المناطق طائي) لترنسفكأيشن من خلال electroporation. مفاتيح لنهجنا الأوقات الخدر لفترة أطول، حقن في تيهيرد البطين، ونوع وتحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا نتائج الاستهداف والتحليل النسيجي لاحقة من نواة تحت المهاد البصري الأكثر راحة، والجسم الحلمي.

Introduction

التلاعب الجيني للدماغ الفأر الجنينية هو النهج المفضل لمعرفة المزيد عن تنظيم التنموية. الجيل من خطوط الماوس متحولة ولكن هو بطيئة ومكلفة. واحد طريقة قوية لإدخال تغييرات جينية محددة في تطوير الخلايا العصبية للدماغ الثدييات هو electroporation في الرحم. أساسا، تتكون هذه التقنية من transfecting الحمض النووي في الظهارة العصبية الجنينية الدماغ عن طريق نبضات كهربائية، ثم السماح الجنين إلى البقاء على قيد الحياة لفترة معينة من الزمن، وجمع الدماغ ودراستها لرواية ممكن، الظواهر غنية بالمعلومات. في هذه الطريقة، يمكن للمجرب اختبار الفرضيات على الفور تقريبا دون فترات انتظار طويلة اللازمة لإنتاج المسوخ الماوس.

التي ترنسفكأيشن من الحمض النووي في الأجنة النامية مع electroporation في البيضة على افراخ الدجاج 1. تم إجراء إثبات صحة مفهوم أساسي للماوس في الثقافة في الرحم 3،4.

والمشكلة الرئيسية هي لبالنقل دماغ الأجنة النامية في الرحم دون قتلهم أو الأم. تعلم لإجراء الجراحة اللازمة (البطن، والحقن، electroporation) يتطلب فترة تدريب طويلة. بمجرد يتقن عملية جراحية لنقطة حيث نسبة البقاء على قيد الحياة الجنين غير مقبول، فإن السؤال الرئيسي التالي هو: ما هي هياكل الدماغ يمكن الوصول إليها؟ ليس من المستغرب، أول الأبحاث المنشورة تظهر النتائج التي تم الحصول عليها مع electroporation في الرحم تركز على التنمية القشرية 5-9. هذا لا يزال صحيحا بالنسبة لمعظم المنشورات باستخدام هذه التقنية، منذ المنطقة من الدماغ الماوس النامية الأكثر متناول العمليات الجراحية هي القشرة (الشكل 1). وقد وصفت الإجراء لelectroporation في الرحم في اللحاءفي الطباعة 10 و 11-14 في الفيديو. وهناك تعديل لهذه التقنية يمكن استخدامها لاستهداف جزء البطنية من الدماغ الانتهائي، والعقد القاعدية 15.

ما وراء الدماغ الانتهائي، والدماغ البيني (مقسمة تقليديا إلى المهاد المهاد و) هي منطقة من الدماغ الأمامي من الصعب الوصول إليها. وهناك عدد قليل من التقارير أوراق استهداف جانبها الظهرية والتي يمكن الوصول إليها، المهاد 16-19.

ما تحت المهاد هو الجزء الأكثر البطنية من الدماغ الأمامي، وبالتالي فإن واحدة المترجمة معظم عميق من السطح الظهري (اللحاء) (الشكل 1). لا تزال هذه المنطقة تحديا صعبا للباحثين ملتزمة التلاعب وراثيا مخ الفأر في الرحم. على حد علمنا، يقدم سوى عدد قليل جدا مقالات عن نتائج في ترنسفكأيشن الرحم في منطقة ما تحت المهاد الماوس 20،21. ومع ذلك، فإن أهمية وظيفية من منطقة ما تحت المهاد المدفعر يكون مبالغا فيه، لأنه ينظم السلوكيات مثل الأكل والشرب، والتزاوج والتربية والأبوة والأمومة 22. وعلاوة على ذلك، وتعديلات في التنمية طائي تسهم أن تنشأ لاحقا في ظروف الحياة مثل السمنة وارتفاع ضغط الدم والسكري والبلوغ المبكر 23. سوف تكون قادرة على تغيير وراثيا تحت المهاد خلال تنمية تقدم أداة قوية جدا لفهم ذلك.

بروتوكول الجراحية الأساسية لفتح البطن من الفئران الحوامل التي نستخدمها هنا هي مماثلة لتلك المستخدمة في البروتوكولات الأخرى 11،13،14،24. سنقوم بشرح منهم هنا لفترة وجيزة للتأكد من اكتمالها. مفتاح الإجراء لدينا، من ناحية أخرى، هي نوع من التخدير، ومكان الحقن، نوع من الأقطاب الكهربائية والإدراج والموقف من القطب الموجب فيما يتعلق رأس الجنين. ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال استنشاق الغاز على تخدير داخل الصفاق بسيطة، منذ السابق يسمح للفترات أطول نوعا من الخدر اللازمة لعملية جراحية صعبة. النتائج استنشاق isoflurane والانتعاش في أسرع من التخدير، منذ يوضح عادة الأم السلوك العادي بالفعل دقائق بعد الجراحة. أسهل نقطة الحقن من الحل DNA مع الزجاج micropipette هو البطين الجانبي، والتي مع ذلك غير مناسب تماما ل electroporation تحت المهاد. حقن مباشرة في البطين الثالث هو في الواقع حاسمة لاستهداف هياكل الدماغ البيني عميق. فمن الممكن لبالنقل منطقة ما تحت المهاد من E12.0 أو E12.5 مع معيار، أقطاب قبالة الجاهزة للاستخدام. لقد تم العثور على بعض من الأقطاب الكهربائية المصنعة من قبل نيبا جين (تشيبا، اليابان) مناسبة خاصة لهذا الغرض.

مع إجراءاتنا نحصل على ترنسفكأيشن من الظهارة العصبية طائي كامل أو جزئي ترنسفكأيشن الإقليمية، اعتمادا على اتجاه القطب. نحن هنا لشرح هذه التقنية عليها بنقل الجسم الحلمي، يمكن القولأعمق وأكثر راحة من كل نواة تحت المهاد البصري. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا التحليل النسيجي مفصل لالخلايا transfected وصولا الى المستوى الخلوي من القرار.

مقارنة بين electroporation في الرحم مع المناهج الأخرى لtransfecting البلدان النامية مخ الفأر في الرحم يمكن العثور عليها في الجزء المتعلق بالمناقشة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي وزجاج بال micropipettes للحقن

  1. نوعية جيدة بال micropipettes الزجاج ضرورية للحد من ارتفاع نسبة الإجهاض الأولي بسبب فقدان السائل الذي يحيط بالجنين. الإجراء لسحب بال micropipettes الزجاج تم توثيقه جيدا 13،18،25. استخدام 1.2 مم قطر الشعيرات الدموية سحبت في سوتر التقليدية P-97 جهاز مع الإعدادات P = 500؛ الحرارة = 300؛ سحب = 40؛ السرعة = 50؛ الوقت = 50. تناسب ساحبة مع 3 ملم خيوط "الحوض الصغير" (سوتر الصك FT330B). وقد أسفرت خيوط حجم 2 مم بالنسبة لنا نتائج مرضية أقل. من ناحية أخرى، الميلا من micropipette نصائح لا يبدو لتحسين النتائج بالنسبة لنا.
  2. حل تنقيته، DNA البلازميد خالية من الذيفان الداخلي في برنامج تلفزيوني (الصف خلية الثقافة) تحتوي على 0.1٪ سريع الأخضر إلى تركيز النهائي من 1-2 ميكروغرام / ميكرولتر. سوف الأخضر سريعة تجعل من حل حقن مرئية في البطين الدماغ الجنينية.
  3. تحميل 10 ميكرولتر من الحل الحمض النووي في micropipette الزجاج. ربط micropipette الزجاج لنظام حقن (مضخة بيكو) أو ماصة الفم.

2. خدر

إعداد جداول التشغيل مع وسادة التدفئة والأدوات الجراحية. بدوره على مصادر الباردة ضوء لتسهيل التصور من الأجنة. تطهير الأدوات الجراحية باستخدام على سبيل المثال حبة تعقيم الزجاج.

ثلاثة إجراءات التخدير مختلفة ممكنة لهذا البروتوكول (انظر المناقشة). هنا سوف نقوم بوصف واحد ونحن نعتبر أفضل، وذلك باستخدام استنشاق isoflurane ولتحريض التخدير (معدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة)، وكذلك صيانة (معدل التدفق 1 لتر / دقيقة).

  1. أعرض الماوس الحوامل في وعاء صغير شفاف (بحيث يبقى الماوس مرئية) متصلا Komesaroff مارك 5 جهاز التخدير من قبل طول قصيرة من الأنابيب.
  2. ملء مع المرذاذ isoflurane و، ثم فتح زجاجة الأكسجين تعلق على الجهاز. ضربة واحدة أو اثنين من البقول isoflurane / الأكسجين (0.5 لتر / دقيقة) في وعاء الضغط على الماوس ووتش للتخدير لتعيين فيها
  3. خذ الماوس خارج، وتغطية عينيه مع مرهم لمنعهم من التجفيف وتناسب قناع التخدير تدفق رأسا على عقب على الفور.

3. البطن

  1. ضع الماوس البطن حتى على وسادة التدفئة (وإلا درجة حرارة جسمها سوف تنخفض سريع جدا مما يقلل فرص الشفاء) وتأمين جسمها في مكانها عن طريق تحديد أربع أرجل لها على الجانبين مع الشريط. تقييم عمق التخدير عن طريق التحقق من فقدان استجابة لتحفيز رد الفعل (على سبيل المثال اصبع القدم أو قرصة الذيل مع الضغط الثابت).
  2. حلق سطح البطن وتعقيمها مع iodophorpovidone-اليود (Braunoderm).
  3. إجراء شق طولي (1-1،5 سنتيمترا) على الجلد في منطقة البطن. ثم قطع الصفاق. وضع الشاش والقطن حول شق. جعل قرن الرحم واحدة مرئية وتخلعها بعناية مع ملقط حادة على PBS-تشطف gauzه. شطف الرحم مع برنامج تلفزيوني في كثير من الأحيان للحفاظ على ترطيبها دائما (أرقام 2A و 2B). أثناء الإجراء بأكمله تجنب سحب مسراق الرحم أو الرحم ضيق، منذ ارتفاع الضغط داخل الرحم وسوف تحيل إلى الجنين يزيد من فرص فقدان السوائل على حقن مما أدى إلى الإجهاض.

4. حقن الحمض النووي في البطين الدماغ

  1. عقد الرحم في مثل هذه الطريقة التي البطينين الدماغ يمكن تصور. لا إعادة على نطاق واسع الجنين الذي يكمن في وضع غير موات - وهذا يزيد من فرص الإجهاض.
  2. أبحث في رأس الجنين من أعلى، توطين بصريا الفجوة أو الشق بين نصفي الكرة الأرضية القشرية اليسار واليمين. نصفي الكرة الأرضية سهلة للتمييز وعادة ما يمكن أن ينظر إليها البطينين الوحشي داخلها (وينبغي عدم استهداف) كأشكال أكثر قتامة نوعا ما. إذا تم العثور على الجنين لتكون موجهة تماما لحقن الحمض النووي (الارقام ..ES 2C و 2D)، فمن الممكن أن تخترق جدار الرحم وأدخل البطين الثالث في آن واحد. عقد micropipette الزجاج في 45 ° إلى جدار الرحم وثقب في نهاية منقاري من الفجوة بين نصفي الكرة الأرضية القشرية، اختراق لحوالي 1 مم. وبهذه الطريقة غيض من الزجاج micropipette ستدخل البطين الثالث من الدماغ (وليس البطين الجانبي) (أرقام 2C و 2D). في الأجنة أقل المنحى بشكل إيجابي ومن المفيد لأول اختراق جدار الرحم (دائما عند 45 درجة) على مقربة من الرأس جنينية، ضع رأس micropipette في المكان المناسب بين نصفي الكرة الأرضية القشرية، وعندها فقط خرم الدماغ. حقن حوالي 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي في البطين الثالث (حقنة جيدة يملأ البطين بسائل أخضر). كرر نفس الإجراء مع كل الأجنة من الرحم واحد القرن. هذا يسمح لبعض الوقت من أجل حل الحمض النووي لخلط بالتساوي مع السائل البطين والوصول إلى entirه الظهارة العصبية.

5. استهداف المهاد ل electroporation

  1. تبديل electroporator على وضبط إعدادات وفقا لعمر الجنينية (لE12.5 نستخدمها 5 البقول مربع موجة، 50 V، 50 ميللي ثانية ON/950 ميللي ثانية OFF). كما استخدم القطب الموجب الفولاذ المقاوم للصدأ القطب إبرة (CUY550-10)، وكما القطب السالب القطب شقة جولة (CUY700P4L). (ومن المهم أن الأقطاب الكهربائية هي أصغر من الجنين، منذ وإلا فإن التدفقات الحالية قاب الجنين ولكن ليس من خلال ذلك.)
  2. حدد ل electroporation تلك الأجنة التي ظهري الجانب متروك (أي تحول نحو مجرب) (حيث أن معظم منهم)، وتجاهل أولئك الذين توجه ليست مواتية. هي عليه الآن آمنة للمس أصابع الرحم مع الايثانول تطهيرها أو مع قفازات. عقد الرحم بالملقط، ومع ذلك، من شأنها أن تتداخل مع تدفق التيار خلال electroporation.
  3. تخترق جدار الرحم بواسطة رأس الجنين بين الامنSAC iotic والمشيمة من خلال دفع إلى أسفل من خلال ذلك مع غيض من القطب إبرة. استخدام السبابة من اليد الأخرى وكتلة التوجه. حوالي 5 ملم من طرف القطب يجب أن يكون الآن بين الكيس الذي يحيط بالجنين وجدار الرحم، عند حوالي مستوى الدماغ المتوسط ​​(أرقام 2E و2F). تذكر أن هذا هو "استهداف القطب"، لذلك سوف تحدد موقفها الذي هو الأكثر احتمالا للحصول على transfected جزء من الظهارة العصبية طائي. الجنين يجب أن يكون بلطف جدا "تقلص" بين الأقطاب.
  4. مع من ناحية أخرى، موقف القطب شقة جولة خارج جدار الرحم على الجانب الآخر من رأس الجنين (أرقام 2E و 2G).
  5. استخدام دواسة التبديل إلى تطبيق الجهد (V 50، 50 ميللي ثانية ON، 950 ميللي ثانية OFF، 5 البقول مربع موجة).
  6. سحب ببطء القطب إبرة للخروج من الرحم في حين تحجم الرحم مع السبابة من اليد الأخرى - إذا السلىيتم فقدان عرة السائل من خلال ثقب الجدار، وعادة ما تجري عملية إجهاض الجنين. كرر الإجراء مع كل الأجنة.
  7. العودة قرن الرحم في البطن وتكرار الحقن و electroporation في القرن بقية.

6. الانتهاء من الجراحة

  1. بعد الحقن و electroporation من جميع الأجنة، وضع الرحم مرة أخرى في البطن بعناية فائقة، وضعه تماما كما كانت عليه من قبل ورطبة التجويف البريتوني مع المياه المالحة قبل إغلاقه.
  2. خياطة البريتوني مع الخيوط الجراحية (VICRYL Polyglactin 910، 5-0، [إثيكن V4914). لإغلاق استخدام الجلد "توقف غرزة" methodwith خياطة أكثر مقاومة (Supramid نايلون، 6-0، سراج يسنر TO 07171L).
  3. تطهير سطح البطن مع بوفيدون اليود (Braunoderm) وحقن غير الستيرويدية المضادة للالتهابات تحت الجلد (على سبيل المثال 100 ميكرولتر من محلول 01:10 من Rimadyl في 0.9٪ كلوريد الصوديوم)، أو حتى أفضل، وهو الأفيونية مثل بوprenorphine (Temgesic، 0.05 و 0.1 مغم / كغم من وزن الجسم في 0.9٪ كلوريد الصوديوم) لتخفيف الألم.
  4. إزالة الأم من الجهاز مخدر ووضعه في قفص الذي يتم تسخينه بواسطة وسادة التدفئة. رصد الماوس باستمرار حتى يتم استرداد تماما من التخدير. في وقت لاحق، والتحقق من الحيوانات يوميا لضمان أنهم يتماثلون للشفاء من الإجراء دون أي علامة على الإصابة أو الألم.

7. تحليل النتائج

  1. حصاد الأجنة (أو postnatals) وفقا إلى اليوم المطلوب من التحليل. وقتل الفئران بعد الولادة (1-2 يوم من العمر) بواسطة قطع الرأس.
  2. فصل كل الجنين وفقا لهذا الشرح electroporation السابقة. تشريح الدماغ تحت stereomicroscope والاختيار تحت المجهر للإشارة الفلورية الخضراء (GFP من مراسل) في المنطقة المناسبة.
  3. الدماغ اختيارها يمكن تحليلها "جديدة": إصلاح الأنسجة لفترة قصيرة في بارافورمالدهيد 4٪ وتغرس في الاغاروز 4٪ أو الجيلاتين في واحدlbumin، ثم قسم على جهاز vibratome من نوع (الشكل 3). لمزيد من التحليل المناعى مفصلة (الشكل 4)، البرد حماية المخ في 30٪ من محلول السكروز، تغرس في أكتوبر تصاعد المتوسطة (الأنسجة تيك) ثم قص المقاطع 20 ميكرون في ناظم البرد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يولد معظم الخلايا العصبية تحت المهاد بين E11.5 إلى E15.2، وفقا لتحليل الميلاد التي يرجع تاريخها في الفئران 26 ترجمتها إلى تطوير الماوس أقصر إلى حد ما 27،28. يتم الوصول إلى الذروة من تكوين الخلايا العصبية طائي في E12.5 29-31. وفقا لذلك، في سن ترنسفكأيشن الذي تم اختياره لهذه الدراسة (E12.5)، يمكن أن توصف نسبة كبيرة من الخلايا العصبية طائي على أي مستوى rostro-الذيلية معين.

تحليل في E18.5 على أبواب vibratome من نوع سميك (أرقام 3A و3B) يدل على أن تمديد rostro-الذيلية كامل من الظهارة العصبية طائي هي في متناول electroporation (الشكل 3A). في أي سن معينة، يمكن أن توصف الخلايا العصبية على جميع المستويات MEDIO-الجانبية (الشكل 3B)، في اتفاق مع دراسات النسب 32. الجسم الحلمي (MBO) هو نواة الخلايا العصبية النامية من الظهارة العصبية المبطنة عطلة في معظم ventraL وجزء الذيلية من الدماغ الأمامي. هذا يجعل MBO من حيث المبدأ من الصعب جدا أن هدف. وظيفيا، وMBO هو بنية أساسية لتوطيد الذاكرة ونتائجها المرضية انحطاط في فقدان الذاكرة تقدمي 33. تمكنا ل transfect البلازميدات مراسل تحديدا جدا في هذه النواة (أرقام 3C و 3D). الخلايا العصبية MBO تمديد محاور تشكيل اثنين مساحات هامة مميزة جدا وظيفيا والتي وصفت أيضا بعد ترنسفكأيشن (النصال في الشكل 3C). تظهر المقاطع العرضية أن الخلايا العصبية ولد في E12.5 (عمر ترنسفكأيشن) تشكيل "طبقة" منحني حول كتلة غير المسمى من الخلايا العصبية ولدت في وقت سابق (أي قبل تولي التجربة ترنسفكأيشن مكان) (الشكل 3D).

ما وراء أنماط الهجرة العام الذي أبدته الفحص على أبواب سميكة مع مساعدة من البروتينات مراسل فلوري، تحليلا أقرب للنتائج غير POSS إيبل باستخدام أجسام مضادة معينة على المقاطع ناظم البرد (الشكل 4). لتحليل مثال اختاره هنا، MBO، ونحن على استعداد أقسام أفقية موازية لطائرة من العمليات الدبقية شعاعي المنبثقة من العطلة الحلمي (الشكل 4A). نحن ثم حدد الخلايا العصبية MBO لدت من الظهارة العصبية المسمى على E12.5 عن طريق الأجسام المضادة ضد GFP (الشكل 4B). كما هو متوقع، وصفت الضد مجموعة محدودة من الخلايا MBO (رأس السهم في أرقام 4B، 4C، 4D و). وتقع هذه المجموعة بين اثنين غير المسماة المناطق MBO الوحشي والإنسي المقابلة على التوالي إلى الخلايا العصبية MBO ولدوا قبل (الوحشي) وبعد (وسطي) E12.5. وكمثال على ذلك، ونحن هنا المشارك ملطخة الأجسام المضادة ضد nestin (أحمر في أرقام 4C و 4D) من أجل إظهار وضع الهجرة من الخلايا العصبية المسماة بشكل فردي على عمليات الدبقية شعاعي من الظهارة العصبية.

المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. الأوضاع النسبية للالمهاد واللحاء في midgestation. سهمي (A) والعرضي (B) الرسوم البيانية من الدماغ من جنين فأر midgestation يبين الهيكل الدماغ الأمامي الظهري الأكثر والأكثر سطحية، والقشرة (CTX، أزرق) وكذلك معظم عميق بنية الدماغ الأمامي وضعت، ما تحت المهاد (HY، أحمر).

الشكل 2
الشكل 2. الرسم التخطيطي لهذا الإجراء. (أ) سد الحوامل هو تخدير والرحم عرضة للخطر. (B) وفي كل تورم الرحم تحديد الإدراج المشيمة (أسود رأس السهم)،المشيمة (PL) والجنين. ME، مسراق الرحم. (ج) تحديد نقطة الحقن في منتصف الكرة الأرضية القشرية اليسار واليمين (أحمر X). (D) حقن محلول الحمض النووي في البطين الثالث. (E) القطب إبرة (إيجابية) يخترق جدار الرحم بين الجنين والمشيمة الإدراج. القطب شقة (سلبي) تقع على الجانب خالية من الرحم. (F) عرض افتراضية من الجانب المشيمة تبين موقف القطب الموجب على طول منطقة ما تحت المهاد. (G) عرض من الجانب خالية من الرحم التي تبين موقف القطب السالب.

الشكل (3)
الشكل (3). Transfecting منطقة ما تحت المهاد بأكمله أو جزء منه. سميكة أقسام تهتز-مشراح من أربعة أنواع مختلفة مننوع البرية E18.5 أدمغة فئران تظهر ما تحت المهاد بعد في الرحم ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد تحمل مراسل الفلورسنت الجينات GFP (A، C) أو CFP (B، D) في E12.5. (A) مقطع سهمي (منقاري إلى اليسار) يظهر تحت المهاد transfected من منقاري إلى الذيلية. شريط مقياس 500 ميكرون. (B) المقطع العرضي. على الجانب transfected، الخلايا المسمى ويمكن الاطلاع على جميع المستويات MEDIO الاطراف. (C) مقطع سهمي يظهر الجسم الحلمي transfected على وجه التحديد (خط متقطع، النجمة) ووسم لها محور عصبي شجرة مميزة (السهام). (D) المقطع العرضي من خلال الجسم الحلمي (خط متقطع). على الجانب electroporated (النجمة)، والفرقة المسماة الموافق الخلايا العصبية ولدت في E12.5 يمكن أن يرى. HY، تحت المهاد؛ TH، المهاد

الشكل 4 الشكل 4. تحليل خطوات محددة في التنمية طائي. (A) رسم تخطيطي لمقطع أفقي من خلال الدماغ النامية تظهر فيه جثة الحلمي (الحمراء). المنطقة هو مبين في (B) و (C) هو مؤطر. (B) وضع العلامات الضد من GFP على القسم الأفقي من خلال الجسم الحلمي E18.5 بعد ترنسفكأيشن GFP في E12. خلايا ولد في E12.5 تشكيل الفرقة متميزة في النواة (رأس السهم في B، C و D). شريط مقياس 100 ميكرون. (C) وضع العلامات الضد من عصبية ظهارية nestin علامة (الحمراء) فى القسم هو مبين في (B). شريط مقياس 100 ميكرون. (D) ويمكن تحديد الخلايا الفردية في E12.5 الفرقة محددة في الجسم الحلمي تحت التكبير عالية. شريط مقياس 20 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حول التخدير: منذ electroporation في الرحم في منطقة ما تحت المهاد يمكن أن تكون شاقة تقنيا وتتطلب مرات الخدر لفترة أطول، ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال الإدارة من خليط من الأكسجين وisoflurane و. في تجربتنا، ويمكن أن تبقى الحيوانات مخدرة بشكل مناسب في هذه الطريقة لفترات تصل إلى ساعة واحدة على الأقل، واستعادة الأم هو سريع جدا، وتحسين بقاء الجنين. مناهج أخرى للتخدير وتتوفر أيضا. يتكون الإجراء الأكثر بسيطة على إحداث وصيانة الخدر عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2.5 مل / كجم من وزن الجسم من خليط من الكيتامين (25 ملغ / مل)، Xylazin (1.2 ملغ / مل)، وAcepromazin (0.35 ملغ / مل) في 0.9 ٪ العقيمة كلوريد الصوديوم ("التحرير والسرد الثلاثي"). مع هذا الخليط وحدها، في الجرعات الموصى بها هنا، هو فعل والخدر من حوالي 30 دقيقة (تصل إلى 45 دقيقة في بعض الحالات). هذا هو عادة ما يكفي لelectroporation في الرحم في اللحاء في E12.5 (من خلال ينجection في البطين الجانبي). وميزة هذا الأسلوب هو أنه يتجنب تماما الحاجة إلى الجهاز الخدر وغيرها من المعدات. ومع ذلك، فإن هذا النوع من التخدير داخل الصفاق غير مستحسن إذا مرات أطول من الجراحة ضرورية، لأن غالبا ما يتم اتباع المزيد من الحقن في تخدير الحيوان من أجل إطالة فترة التخدير عليها بالإعدام. ومن الممكن أيضا أن الجمع بين داخل الصفاق والتخدير عن طريق الاستنشاق بواسطة الأول باستخدام حقنة من "التحرير والسرد الثلاثي" (على النحو الوارد أعلاه) من أجل حمل الخدر، ثم الحفاظ عليه عن طريق استنشاق isoflurane و/ الأكسجين. على الرغم من أن مع هذا الأسلوب سيما الخدر لا يمكن الحفاظ عليه طالما هناك حاجة إليها، فإن الانتعاش من الفأرة الحوامل بعد العملية ليست جيدة كما مع استنشاق وحدها. الى جانب ذلك، كلما نستخدم "التحرير والسرد الثلاثي" الحقن داخل الصفاق، وبقاء الجنين النقصان.

تحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية على رأس الجنين كما هو مبين في

في البطن واضح وصريح بما فيه الكفاية. ومع ذلك، فإن المجرب تصل إلى مستوى من المهارة التي تسمح لنسبة البقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة (بعد الحقن داخل البطيني الذي اتبعته الإدارة من نبضات كهربائية) بعد منحنى التعلم مسطحة. مهارة الفرد هو عامل مهم بحيث في الرحم electroporation بشكل عام وتطبيقه على منطقة ما تحت المهاد في خاصة يمكن أن يثبت غير عملي تماما بالنسبة لبعض الطلاب . لتقصير فترة التعلم، فضلا عن زيادة التكاثر والتحليل الإحصائي وجدنا أنه من المفيد لملء بروتوكول مفصلة بما في ذلك معلومات عن عدد وموقف الأجنة، والمظهر، ونوعية الحقن وموقف تقريبي من الأقطاب الكهربائية لل الأجنة الفردية. وقد ثبت مقارنة هذه البيانات عن التجربة مع النتائج النهائية، على أساس الجنين تلو الجنين مفيدة لفهم وتحسين إجراءات.

تقارير أخرى 20،21 استهدفت منطقة ما تحت المهاد مع Nepagene الملقط من نوع الأقطاب. نحن باستمرار الحصول على نتائج أفضل مع تطبيق واحد إبرة قطب كهربائي واحد مسطح غطاء كهربائي من نفس الشركة المصنعة. في تجربتنا، واستخدام هذا الأسلوب يجعل rostro-الذيلية استهداف أسهل. يبدو أقطاب الملقط تتطلب إما أكثر خبرة / مهارة أو عدد أكبر بكثير من التجارب من أجل تحقيق نتائج مفيدة.

jove_content "> اثنين على الأقل من المناهج الأخرى ل transfect بنيات الحمض النووي في منطقة ما تحت المهاد الماوس النامية يمكن مقارنة في الرحم electroporation. ويستند أول واحد أيضا على البطن وحقنها في البطين الدماغ الجنينية، والفرق بينهما أن الحمض النووي من الفائدة التي تحملها الجسيمات الفيروسية الفيروس يصيب الخلايا الظهارية العصبية وبهذه الطريقة transfects بناء لدينا التجريبية - ليس هناك حاجة إلى electroporation المزايا:. الإجراء يتجنب النبضات الكهربائية اللازمة ل electroporation، وبالتالي بقاء الجنين يحسن ربما أهم عيوب هذا الأسلوب. هي: 1) العمل مع الفيروسات يتطلب احتياطات خاصة ومرافق S2، 2) الاستهداف هو وارد على الإطلاق، لأن الجسيمات الفيروسية سوف تنتشر خلال البطين كامل مما يجعله من حيث المبدأ المحتمل أيضا أن بالنقل أي منطقة عصبية ظهارية (طبعا بعض درجة من ترنسفكأيشن في المنطقة ذات الاهتمام هو على الأرجح)، وبطبيعة الحال، في الرحم في الرحم electroporation، أي إجراء جراحة صعبة نسبيا، مع منحنى التعلم مدى اعتمادا قويا على المهارات الفردية للمجرب.

المجموعة الأخرى من النهج يتجنب الجراحة تماما، لأنها مبنية على حقن من بنيات ل transfect في مجرى الدم من الفأرة الحوامل. الذيل الوريد (الوريد الذيلية) حقن shRNA 34،35 أو 36 البلازميدات لديه القدرة على التلاعب وراثيا الأجنة في وقت مبكر جدا، على الرغم من استهداف منطقة محددة غير ممكن مع هذا الأسلوب. لا يبدو هذا النهج واعدة مستعدة بعد للتطبيق العام. الجسيمات الفيروسية (الغدة المرتبطة الفيروسات) حقن في الوريد الوجهي من الفئران حديثي الولادة (ولكن ليس الفئران الأكبر سنا) قادر على بالنقل الخلايا العصبية في الدماغ 37. وأخيرا، يمكن أن الجسيمات النانوية، والتي يمكن في نهاية المطاف أن تستخدم ناقلات الحمض النووي، وتصل إلى المخ بعد الذيل الخامسحقن عين في الفئران البالغة 38. هاتين الطريقتين، التي تفتح إمكانية transfecting الأجنة في وقت مبكر جدا، وعلى حد علمنا لم تستخدم حتى الآن على الفئران الحوامل.

عمر ترنسفكأيشن وجمع: لتعلم الإجراء، وربما هو أفضل لمحاولة بالنقل E14.5 الأجنة، ومن ثم تخرج إلى وقت سابق، الأعمار الجنينية أكثر صعوبة. في تجربتنا، GFP التعبير مرئيا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بالفعل 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. بعد E12.5 ترنسفكأيشن، GFP التعبير على E18.5 قوية جدا. لقد electroporated في E12.5، E13.5، E14.5، وE15.5 وتحليلها في E17.5، E18.5، وP0 P1 التمكن من العثور على التعبير مراسل قوية في جميع الحالات. عندما يسمح الأجنة التي تم transfected في الرحم العقول للوصول إلى مصطلح (لجمع البيانات بعد الولادة)، وأحيانا تؤكل بشكل انتقائي من قبل الأم. وهذا يشير إلى التغييرات الطفيفة في المظهر أو السلوك الجرو الناجمة عن التلاعب الدماغ (درجة حرارة بهمتلح يمكن أن يكون أقل، أو ربما أنها لا تتسبب في انبعاث إشارات الصوت اليمين). في تلك الحيوانات بعد الولادة أن البقاء على قيد الحياة إعدام الأمهات، لاحظنا التعبير مراسل حتى P1 على الأقل. تقارير في الأدب المعرض التعبير عن بنيات transfected حتى بعد مرور أربعة أشهر الميلاد 10.

ناقلات ل electroporation: نحن نستخدم bicistronic البلازميدات مراسل مدفوعا المروج CAG 39، تليها [كدنا] من الجينات في المصالح، مفصولة موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES) 40، من [كدنا] من مراسل الفلورسنت، على سبيل المثال تعزيز بروتين الفلورية الخضراء 41. المروج CAG قوي جدا في الخلايا العصبية التي يمكن أن تنتج مستويات الحمض النووي عالية جدا لالخلايا transfected، قتلهم. على الرغم من أننا لاحظنا أبدا موت الخلايا المبرمج الضخمة بعد ترنسفكأيشن، حلا ممكنا، يجب أن تظهر المشكلة، سيكون استخدام المروج أقل كفاءة، مثل EF1 ألفا 42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (الألمانية للبحوث).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Tags

علم الأعصاب، العدد 77، بيولوجيا الأعصاب وعلم الوراثة وعلم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، والهندسة الطبية الحيوية، والبيولوجيا التطورية، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، جنين، الثدييات، الدماغ، الدماغ البيني، المهاد، تقنيات وراثية، ترنسفكأيشن، والتخدير، والتنمية، والأقطاب، electroporation،
التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, … More

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N. E., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter