Summary
Apesar da importância funcional e clínico do hipotálamo,
Abstract
A modificação genética das regiões específicas do cérebro de mamíferos é o desenvolvimento de uma abordagem experimental, muito poderoso. No entanto, a geração de novos mutantes do mouse é muitas vezes frustrantemente lento. Demonstrou-se que o acesso ao cérebro do rato em desenvolvimento in utero com a sobrevivência pós-operatório é razoável possível. Ainda assim, os resultados com este procedimento foram relatados quase exclusivamente para a parte mais superficial e facilmente acessível do cérebro em desenvolvimento, ou seja, o córtex. O tálamo, uma região mais estreita e mais medial, tem se mostrado mais difícil de atingir. Transfecção em núcleos mais profundo, especialmente aqueles do hipotálamo, é talvez o resultado mais difíceis e, por conseguinte, muito poucas têm sido relatados. Aqui demonstramos um procedimento para atingir todo o neuroepithelium hipotálamo ou parte dela (regiões do hipotálamo) para transfecção por eletroporação. As chaves para a nossa abordagem é mais narcose tempos, injeção na third ventrículo, e tipo e posicionamento dos eletrodos apropriada. Além disso, mostramos resultados de segmentação e posterior análise histológica do núcleo hipotalâmico mais rebaixado, o corpo mamilar.
Introduction
A manipulação genética do cérebro embrionário do rato é uma abordagem preferida para aprender sobre regulação do desenvolvimento. A geração de linhas mutantes de rato, porém, é lento e caro. Um método poderoso para introduzir alterações genéticas específicas no desenvolvimento de neurónios do cérebro de mamíferos está em electroporação útero. Essencialmente, a técnica consiste na transfecção de DNA para o neuroepitélio cérebro embrionário, por meio de impulsos eléctricos, em seguida, permitindo que o embrião para sobreviver durante um certo período de tempo, recolher o cérebro e examiná-las para possível nova, fenótipos informativos. Desta forma, o experimentador pode testar hipóteses quase imediatamente, sem longos períodos de espera necessários para a produção de mutantes de rato.
Transfecção de DNA em embriões em desenvolvimento começou com a eletroporação in ovo em embriões de galinha 1. A prova-de-conceito essencial para o rato foi realizado na cultura
O principal problema é a transfecção do cérebro em desenvolvimento de embriões no útero, sem as matar ou a mãe. Aprender a realizar a cirurgia necessária (laparotomia, injeção, eletroporação) exige um longo período de treinamento. Uma vez que a cirurgia foi dominado até o ponto onde a taxa de sobrevivência do embrião é aceitável, a próxima pergunta chave é: quais estruturas cerebrais são acessíveis? Não surpreendentemente, os primeiros trabalhos publicados que mostram os resultados obtidos com a eletroporação utero focada no desenvolvimento cortical 5-9. O mesmo é válido para a maioria das publicações utilizando esta técnica, uma vez que a região do cérebro do rato em desenvolvimento mais acessíveis para procedimentos cirúrgicos é o córtex (Figura 1). O procedimento para a electroporação útero no córtex foi descritoem versão impressa e 10 em vídeo 11-14. Uma modificação da técnica pode ser usada para atingir uma parte ventral do telencéfalo, os gânglios da base 15.
Além do telencéfalo, diencéfalo (classicamente dividido em tálamo e hipotálamo) é uma região do cérebro anterior mais difícil de alcançar. Um pequeno número de relatórios de trabalhos de segmentação de sua parte dorsal e mais acessível, o tálamo 16-19.
O hipotálamo é a parte mais ventral do cérebro anterior, por conseguinte, a uma localizada mais profundamente da face dorsal (córtex) (Figura 1). Esta região continua a ser um desafio difícil para os pesquisadores comprometidos com a manipular geneticamente o cérebro do rato no útero. Para nosso conhecimento, só muito poucos artigos relatam os resultados de transfecção in utero no hipotálamo do rato 20,21. No entanto, a importância funcional do hipotálamo Canhãot ser exagerada, uma vez que regula comportamentos como comer e beber, acasalamento, reprodução e parentalidade 22. Além disso, alterações no desenvolvimento do hipotálamo contribuir para originar mais tarde, em condições de vida, como obesidade, hipertensão, diabetes e puberdade precoce 23. Ser capaz de alterar geneticamente o hipotálamo durante o desenvolvimento seria uma ferramenta muito poderosa para compreendê-lo.
O protocolo cirúrgico de base para a laparotomia de ratas grávidas que usamos aqui é similar ao utilizado em outros protocolos 11,13,14,24. Vamos descrevê-los aqui brevemente para ser completo. A chave para o nosso processo, por outro lado, são do tipo de anestesia, o local de injecção, do tipo de eléctrodos e a posição de inserção e o eléctrodo positivo em relação à cabeça do embrião. Nós preferimos para induzir e manter a anestesia por inalação de gás sobre anestesia intraperitoneal simples, uma vez que a primeira permite que peloum pouco mais longos períodos de narcose necessária para uma cirurgia difícil. Isoflurano resultados inalação em uma recuperação mais rápida da anestesia, já que geralmente a mãe demonstra um comportamento normal já minutos após a cirurgia. O ponto de injecção mais fácil da solução de ADN com a micropipeta de vidro é o ventrículo lateral, que, contudo, é totalmente inadequado para electroporação hipotálamo. Injeção direta no terceiro ventrículo é de fato crucial para atingir estruturas diencefálica profundas. É possível transfecção do hipotálamo ou da E12.0 E12.5 com eletrodos padrão, off-the-shelf. Encontraram-se alguns dos eléctrodos fabricados por Nepa Gene (Chiba, Japão), particularmente adequado para esta finalidade.
Com o nosso procedimento obtemos transfecção de todo o neuroepitélio hipotalâmica ou transfecção parcial, dependendo da orientação da região do eléctrodo. Aqui vamos demonstrar a técnica de transfecção do corpo mamilar, sem dúvida,o mais profundo e recesso de todos os núcleos do hipotálamo. Além disso, mostramos análise histológica detalhada das células transfectadas até ao nível celular de resolução.
Uma comparação de electroporação no útero com outras abordagens para transfecção do cérebro do rato em desenvolvimento in utero pode ser encontrado na secção Discussão.
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Protocol
1. Preparação de DNA e vidro Micropipetas para Injeção
- Bons micropipetas de vidro de qualidade é essencial para reduzir a taxa de abortos inicial elevado, devido à perda de líquido amniótico. O procedimento para puxar micropipetas de vidro tem sido bem documentada 13,18,25. Use 1,2 milímetros de diâmetro capilares puxado em um dispositivo convencional Sutter P-97 com as configurações de P = 500; Calor = 300; Puxe = 40; Velocity = 50; Time = 50. Monte o extrator com três milímetros filamentos "vale" (Sutter Instrument FT330B). Os filamentos de dois milímetros de tamanho produziram para nós, resultados menos satisfatórios. Por outro lado, o bisel da micropipeta dicas não parece melhorar os resultados para nós.
- Dissolver purificada, isenta de endotoxinas DNA de plasmídeo em PBS (Grau cultura celular) contendo 0,1% de verde rápido para uma concentração final de 1 a 2 mg / mL. O verde rápido tornará visível a solução injectada no ventrículo do cérebro embrionário.
- Carregar 10 ml de solução de ADN para a micropipeta de vidro. Ligue a micropipeta de vidro para o sistema de injeção (bomba Pico) ou pipeta de boca.
2. Anestesia
Preparar a mesa cirúrgica com uma almofada de aquecimento e os instrumentos cirúrgicos. Ligar as fontes de luz fria para facilitar a visualização dos embriões. Desinfetar os instrumentos cirúrgicos, utilizando, por exemplo, um talão esterilizador de vidro.
Três procedimentos de anestesia diferentes são possíveis para este protocolo (ver Discussão). Aqui descrevemos a que consideramos o melhor, usando inalação de isoflurano para a indução da anestesia (taxa de fluxo de 0,5 L / min), bem como a manutenção (caudal de 1 L / min).
- Introduzir o mouse grávida em uma pequena transparente (para que o rato permanece visível) recipiente ligado ao Marcos 5 anestésico dispositivo Komesaroff por um curto período de tubulação.
- Encher o vaporizador com isoflurano, em seguida, abrir o frasco de oxigénio ligado ao dispositivo. Soprar um ou dois pulsos de isoflurane / oxigênio (0,5 L / min) para o recipiente com o mouse e relógio para narcose para definir pol
- Leve o mouse para fora, cubra seus olhos com pomada para impedi-los de secagem e ajustar a máscara de anestesia o fluxo em sua cabeça imediatamente.
3. Laparotomia
- Posicione o mouse de barriga para cima sobre a almofada de aquecimento (caso contrário, a temperatura do corpo vai descer muito rápido, diminuindo as chances de recuperação) e garantir o seu corpo no lugar, fixando suas quatro pernas para os lados com fita adesiva. Avaliar a profundidade da anestesia através da verificação de perda de resposta à estimulação de reflexo (por exemplo, do dedo do pé ou de aperto da cauda, com uma pressão firme).
- Raspar a superfície abdominal e desinfectá-la com o iodophorpovidone-iodo (Braunoderm).
- Adicione uma incisão longitudinal (1 a 1,5 cm de comprimento) sobre a pele abdominal. Em seguida, corte o peritônio. Coloque gaze de algodão ao redor da incisão. Faça um corno uterino visível e puxe-o cuidadosamente com uma pinça sem corte para o PBS-lavadas gauze. Lavar o útero com PBS muito frequentemente para mantê-lo sempre humedecido (Figuras 2A e 2B). Durante todo o procedimento evitar puxar o mesométrio ou do útero apertado, uma vez que a alta pressão no interior do útero irá transmitir ao embrião aumentando as chances de perda de líquido sobre injeção, resultando em aborto.
4. Injecção de DNA para o ventrículo cerebral
- Segurar o útero de tal forma que os ventrículos cerebrais podem ser visualizados. Não extensivamente reposicionar um embrião que se encontra em uma posição desfavorável - isso só aumenta as chances de aborto.
- Olhando para a cabeça do embrião a partir de cima, localizar visualmente o espaço ou fissura entre os hemisférios esquerdo e direito do córtex. Os hemisférios são fáceis de distinguir e os ventrículos laterais dentro deles (a não ser alvo) pode geralmente ser entendido como formas ligeiramente mais escuras. Se um embrião é encontrado para ser perfeitamente orientada para a injeção de DNA (Figures 2C e 2D), é possível perfurar a parede uterina e se introduzir o terceiro ventrículo de uma vez. Segurar a micropipeta de vidro a 45 ° em relação à parede do útero e punção no final rostral do fosso entre os hemisférios corticais, penetrando para cerca de 1 mm. Deste modo, a ponta da micropipeta de vidro vai entrar no terceiro ventrículo do cérebro (não no ventrículo lateral) (Figuras 2C e 2D). Em embriões menos favorável orientadas é útil para perfurar a primeira parede uterina (sempre a 45 °), na vizinhança da cabeça embrionária, colocar a ponta da micropipeta na posição correcta entre os hemisférios corticais e só depois perfurar o cérebro. Injectar cerca de 1 ul de solução de ADN para o terceiro ventrículo (uma boa injecção enche com fluido no ventrículo verde). Repita o mesmo procedimento com todos os embriões de um chifre útero. Isso permite algum tempo para a solução de ADN para misturar uniformemente com o fluido atingir o ventricular e entire neuroepithelium.
5. Segmentação do hipotálamo para Eletroporação
- Desligue o electroporator e ajustar as configurações de acordo com a idade embrionária (para E12.5 usamos 5 pulsos de onda quadrada, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Use como pólo positivo do eletrodo de agulha de aço inoxidável (CUY550-10) e como pólo negativo de um eletrodo liso rodada (CUY700P4L). (É importante que os eléctrodos são menores do que o embrião, pois caso contrário, a corrente flui através do embrião, mas não por ele.)
- Selecione para eletroporação os embriões cujo lado dorsal é para cima (ou seja, voltada para o experimentador) (como a maioria deles são), e descartar aqueles cuja orientação não é favorável. Agora é seguro para tocar o útero com os dedos etanol desinfetadas ou com luvas. Segurar o útero com uma pinça, no entanto, iriam interferir com o fluxo de corrente durante a electroporação.
- Perfuram a parede uterina por cabeça do embrião entre a amnsac iotic ea placenta empurrando para baixo com ele através da ponta do eléctrodo de agulha. Use o dedo indicador da outra mão, como bloco de empuxo. Cerca de 5 mm da ponta do eléctrodo deve ser agora entre o saco amniótico e a parede uterina, a cerca do nível do mesencéfalo (figuras 2E e 2F). Lembre-se que este é o "alvo eletrodo", pelo que a sua posição vai determinar qual parte do neuroepithelium hipotálamo é o mais provável de ser transfectadas. O embrião tem que ter muito cuidado "espremido" entre os eletrodos.
- Com a outra mão, a posição do eléctrodo plano rodada do lado de fora da parede do útero, no lado oposto da cabeça do embrião (Figuras 2E e 2G).
- Utilize o pedal para aplicar tensão (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 pulsos de onda quadrada).
- Puxe lentamente o eletrodo de agulha para fora do útero, mantendo o útero de volta com o dedo indicador da outra mão - se amniocentesetic líquido é perdida através da parede perfurada, usualmente o embrião vai sofrer aborto. Repita o procedimento com todos os embriões.
- Voltar trompa do útero no abdômen e repetir a injeção e eletroporação no corno restante.
6. Finalizando a cirurgia
- Após a injeção e eletroporação de todos os embriões, coloque o útero de volta ao abdômen com muito cuidado, posicionado exatamente como eram antes e úmido da cavidade peritoneal com solução salina antes de fechá-la.
- Sutura do peritônio com Categutes (Vicryl poliglactina 910, 5-0, Ethicon V4914). Para o encerramento do uso de pele ", interrompeu ponto" methodwith uma sutura mais resistente (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
- Desinfectar a superfície abdominal com iodo-povidona (Braunoderm) e injectar um não-esteróide anti-inflamatório, por via subcutânea (por exemplo, 100 ul de uma solução a 1:10 de Rimadyl em 0,9% de NaCl), ou, ainda melhor, um opiáceo como buprenorphine (Temgesic, 0,05 a 0,1 mg / kg de peso corporal em 0,9% de NaCl), para aliviar a dor.
- Remover a mãe do aparelho de anestesia e colocá-lo em uma gaiola, que é aquecida por uma almofada de aquecimento. Monitorizar o rato continuamente até que esteja completamente recuperado da anestesia. Mais tarde, verifique os animais diariamente para garantir que eles estão se recuperando do procedimento, sem qualquer sinal de infecção ou dor.
7. Analisando os resultados
- Colher os embriões (ou postnatals) de acordo com o dia da análise desejada. Ratos pós-natais (1 a 2 dias de idade) são sacrificados por decapitação.
- Separar cada embrião de acordo com a anotação electroporação anterior. Dissecar o cérebro sob um estereomicroscópio e vá ao microscópio para o sinal fluorescente verde (GFP a partir do repórter) na região adequada.
- O cérebro seleccionado pode ser analisada "fresco": fixar o tecido durante um curto período de tempo, em 4% de paraformaldeído e incorporar em agarose a 4% e em microesferas de gelatina a umlbumin, em seguida, a secção de um dispositivo do tipo vibratome (Figura 3). Para uma análise mais pormenorizada imunohistoquímica (Figura 4), crio-protegem o cérebro em solução de sacarose a 30%, em outubro incorporar o meio de montagem (Tissue Tek) depois cortar secções 20 mM num criostato.
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Representative Results
A maioria dos neurônios do hipotálamo nascem entre E11.5 a E15.2, de acordo com análise de nascimento-dating no rato 26 traduzido para o desenvolvimento um pouco mais curto do rato 27,28. O pico de neurogênese hipotálamo é atingido a E12.5 29-31. Por conseguinte, com a idade de transfecção escolhido para o presente estudo (E12.5), uma grande proporção dos neurónios hipotalâmicos podem ser marcados em qualquer nível rostro-caudal.
Análise em E18.5 em secções espessas do tipo vibratome (Figuras 3A e 3B) mostra que toda a extensão rostro-caudal do neuroepitélio hipotalâmica é acessível a electroporação (Figura 3A). Em qualquer idade, os neurônios podem ser rotulados em todos os níveis médio-lateral (Figura 3B), de acordo com estudos da linhagem 32. O corpo mamilar (MBO) é um núcleo de desenvolvimento neuronal a partir do neuroepitélio forro uma reentrância na maioria ventral e a parte caudal do prosencéfalo. Isto faz com que, em princípio, o MBO muito difícil de atingir. Funcionalmente, o MBO é uma estrutura fundamental para a consolidação da memória e seus resultados degeneração patológicas na amnésia anterógrada 33. Temos sido capazes de transfecção de plasmídeos repórter muito especificamente para este núcleo (Figuras 3C e 3D). MBO neurônios estendem axônios formando dois setores muito importantes características e funcionalmente, que também são rotulados após transfecção (setas na Figura 3C). As secções transversais mostram que os neurónios carregados em E12.5 (idade de transfecção) formar uma "camada" curvo em torno de uma massa não-rotulados de neurónios gerados anteriormente (ou seja, antes da experiência de transfecção realizou-se) (Figura 3D).
Além dos padrões gerais de migração mostrados pelo exame em seções espessas, com a ajuda de proteínas repórter fluorescentes, uma análise mais detalhada dos resultados é posssíveis usando anticorpos específicos em secções criostáticas (Figura 4). Para analisar o exemplo aqui escolhido, o MBO, foram preparadas secções horizontais paralelos ao plano dos processos gliais radiais que emanam do recesso mamilar (Figura 4A). Em seguida, identificou os neurônios MBO nascidos de neuroepithelium rotulado em E12.5 por meio de anticorpos contra GFP (Figura 4B). Tal como esperado, o anticorpo marcado um grupo restrito de células MBO (ponta de seta nas figuras 4B, 4C e 4D). Este grupo foi localizado entre duas áreas não marcadas MBO medial e lateral, respectivamente, correspondentes a neurónios MBO nascidos antes (lateral) e depois (medial) E12.5. Como um exemplo, aqui a co-coradas com um anticorpo contra a nestina (vermelho nas Figuras 4C e 4D), para mostrar o modo de migração de neurónios marcados individualmente sobre os processos gliais radiais do neuroepitélio.
Figura 1. As posições relativas do hipotálamo e no córtex. Midgestation sagital (A) e transversal (B) os diagramas do cérebro de um embrião de rato midgestation que mostra a estrutura do prosencéfalo, mais dorsal, e mais superficial, o córtex (CTX, azul), bem como o mais profundamente estrutura prosencéfalo colocado, o hipotálamo (HY, vermelha).
Figura 2. Diagrama do processo. (A) A barragem grávida é anestesiado e o útero exposto. (B) Em cada inchaço uterino identificar a inserção da placenta (ponta de seta preta),placenta (PL) e do embrião. ME, mesométrio. (C) Identificar o ponto de injeção no meio dos hemisférios corticais esquerda e direita (X vermelho). (D) Injetar solução de DNA para o terceiro ventrículo. (E) O eletrodo de agulha (positivo) perfura a parede uterina entre o embrião e a inserção da placenta. O eléctrodo plano (negativo) repousa sobre o lado livre do útero. (F) Hipotético vista a partir do lado da placenta que mostra a posição do eléctrodo positivo ao longo do hipotálamo. (G), vista do lado livre do útero mostrando a posição do eletrodo negativo.
Figura 3. Transfecção de todo o hipotálamo ou parte dela. Grosso seções vibrando-micrótomo de quatro diferentesTipo de E18.5 cérebro do rato selvagem mostrando o hipotálamo no útero após a transfecção de ADN do plasmídeo transportando genes repórter fluorescente GFP (A, C) ou PCP (B, D) em E12.5. (A) Secção sagital (rostral à esquerda) mostrando um hipotálamo transfectadas de rostral caudal. Barra de escala 500 mm. (B) de seção transversal. No lado transfectada, as células marcadas podem ser encontradas em todos os níveis de medio-lateral. (C) Secção sagital que mostra um corpo mamilar especificamente transfectadas (linha tracejada, asterisco) e etiquetagem da sua árvore característica axonal (setas) (D). Secção transversal através do corpo mamilar (linha a tracejado). No lado electroporated (asterisco), uma banda correspondendo aos neurónios rotulados nascidas em E12.5 pode ser visto. Hy, o hipotálamo; Th, o tálamo
Figura 4. Analisando passos específicos no desenvolvimento do hipotálamo. (A) Diagrama de um corte horizontal através do cérebro em desenvolvimento mostrando o corpo mamilar (vermelho). A região descrita em (B) e (C) é moldado. (B) de rotulagem de anticorpos da GFP em um corte horizontal através do corpo mamilar E18.5 GFP após transfecção em E12. As células carregadas em E12.5 formar uma banda distinta no núcleo (seta em B, C e D). Barra de escala 100 uM. (C) Anticorpo rotulagem de neuroepitelial marcador nestina (vermelho) na secção mostrado em (B). Barra de escala 100 uM. (D), as células individuais podem ser identificadas na faixa específica E12.5 no corpo mamilar sob alta ampliação. Barra de escala de 20 mM.
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Discussion
Sobre a anestesia: Como no útero electroporação no hipotálamo pode ser tecnicamente difícil e narcose requerem tempos mais longos, preferimos para induzir e manter a anestesia por meio da administração de uma mistura de oxigénio e isoflurano. Na nossa experiência, os animais podem permanecer convenientemente anestesiados deste modo por períodos de até, pelo menos, uma hora, a recuperação da mãe é muito rápido, e melhorou a sobrevivência dos embriões. Outras abordagens para a anestesia, também estão disponíveis. O procedimento mais simples consiste em induzir e manter a narcose por injecção intraperitoneal de 2,5 ml / kg de peso corporal de uma mistura de cetamina (25 mg / ml), xilazina (1,2 mg / mL) e acepromazina (0,35 mg / ml) em 0,9 % estéril NaCl ("triple combo"). Com esta mistura por si só, nas doses recomendadas aqui, uma narcose de cerca de 30 min (até 45 minutos, em alguns casos), é induzida. Isto é geralmente suficiente para in utero de electroporação para o córtex no E12.5 (através de injexão no ventrículo lateral). A vantagem deste método é que ele evita completamente a necessidade de um dispositivo de narcose e outros equipamentos. No entanto, este tipo de anestesia intraperitoneal não é recomendada se mais vezes da cirurgia são necessários, uma vez mais injeções no animal anestesiado a fim de prolongar o período de anestesia são muitas vezes seguida de morte. Também é possível combinar intraperitoneal e anestesia por inalação usando primeiro uma injecção de "tripla combinação" (como acima), a fim de induzir a narcose, em seguida, mantê-la por inalação de isoflurano / oxigénio. Embora com este método particular, a narcose possa ser mantida durante o tempo que for necessário, a recuperação do rato grávida após a operação não é tão bom como com a inalação só. Além disso, sempre que usar o "triple combo" injeção intraperitoneal, sobrevivência embrionária diminui.
O posicionamento dos eléctrodos na cabeça do embrião, conforme ilustrado na A laparotomia é bastante simples. No entanto, o experimentador atinge o nível de habilidade que permite um elevado rácio de sobrevivência de embriões (após a injecção intraventricular, seguido pela administração de pulsos elétricos) depois de uma curva de aprendizagem plana. Habilidade individual é um fator importante para que no utero eletroporação em geral e sua aplicação para o hipotálamo em particular, não pode provar totalmente prático para alguns alunos . Para encurtar o período de aprendizagem, bem como para aumentar a reprodutibilidade ea análise estatística foi acharam útil para preencher um protocolo detalhado, incluindo informações sobre o número ea posição dos embriões, ea aparência, a qualidade da injeção e posição aproximada dos eletrodos para Os embriões individuais. Comparando estes dados sobre o experimento com os resultados finais, em caráter embrionário-by-embrião tem se mostrado útil para entender e melhorar o processo. Outros relatos 20,21 têm como alvo o hipotálamo com eletrodos do tipo pinça Nepagene. Nós sempre obter os melhores resultados com a aplicação de uma agulha-eletrodo e um plano cover-eletrodo do mesmo fabricante. Na nossa experiência, a utilização deste método permite rostro-caudal alvo mais fácil. Eléctrodos de pinça parece exigir tanto mais experiência / habilidade ou um número muito maior de experimentos, a fim de produzir resultados úteis.
O outro grupo de abordagens evita completamente a cirurgia, uma vez que se baseia na altura da injecção das construções para transfectar para a corrente sanguínea do ratinho grávida. Veia (veia caudal) de injecção de cauda de shRNA 34,35 ou 36 plasmídeos tem o potencial para manipular geneticamente embriões muito precoces, embora a segmentação de região específica não é possível com este método. Esta abordagem promissora parece não ainda pronta para aplicação geral. As partículas virais (vírus adeno-associado) injectados na veia facial de ratos neonatais (mas não de ratinhos mais velhos) é capaz de transfectar neurónios cerebrais 37. Finalmente, as nanopartículas, que podem eventualmente ser utilizadas como transportadores de ADN, pode atingir o cérebro após cauda vein injeção em ratos adultos 38. Estes dois métodos, que abrem a possibilidade de transfecção de embriões muito cedo, ter ao nosso conhecimento ainda não foi usado em ratas grávidas.
Idade de transfecção e coleta: Para aprender o procedimento, provavelmente é melhor tentar transfecção E14.5 embriões, e, em seguida, mudar para anteriores idades embrionárias, mais difíceis. Na nossa experiência, a expressão da GFP é visível sob luz UV já 24 horas após a transfecção. Após E12.5 transfecção, a expressão da GFP em E18.5 é muito forte. Temos electroporados em E12.5, E13.5, E14.5 e E15.5 e analisadas em E17.5, E18.5, P0 e P1 ser capaz de encontrar forte expressão repórter em todos os casos. Quando os embriões cujos cérebros foram transfectadas in utero são permitidos para chegar prazo (para a coleta de dados pós-natal), por vezes, eles são seletivamente comido pela mãe. Isto sugere mudanças sutis na aparência filhote ou comportamento induzidas pela manipulação do cérebro (sua temperaturature poderia ser menor, ou talvez eles não emitem os sinais sonoros à direita). Nesses animais pós-natais que sobrevivem abate materna, observamos expressão repórter até P1, pelo menos. Relatos na literatura mostram expressão de construções transfectadas até quatro meses após o nascimento 10.
Vectores de electroporação: usamos bicistrônico plasmídeos repórter conduzido pelo promotor de CAG 39, seguido pelo ADNc do gene de interesse, separadas por um local de entrada de ribossoma interno (IRES) de 40, a partir do ADNc de um repórter fluorescentes, por exemplo, a maior proteína verde fluorescente 41. O promotor CAG é tão forte em neurónios que se pode produzir níveis muito altos de ADN para as células transfectadas, as matar. Embora nunca tenham observado apoptose massiva após transfecção, uma solução possível, caso o problema aparece, seria a utilização de um promotor menos eficiente, como o EF1 alfa 42.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
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