Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

Ondanks de functionele en medische belang van de hypothalamus,

Abstract

Genetische modificatie van specifieke gebieden van de ontwikkelende hersenen van zoogdieren is een zeer krachtige experimentele benadering. Echter, het genereren van nieuwe muismutanten is vaak frustrerend traag. Er is aangetoond dat de toegang tot de hersenen van muizen ontwikkelen in utero met redelijke post-operatory overleving mogelijk. Toch resultaten met deze procedure zijn bijna uitsluitend gerapporteerd voor de meest oppervlakkige en gemakkelijk toegankelijk deel van de ontwikkeling van de hersenen, dat wil zeggen de cortex. De thalamus, een smaller en middengebied is moeilijker doel gebleken. Transfectie in diepere kernen, met name die van de hypothalamus, is misschien wel de meest uitdagende en dus zeer weinig resultaten zijn gemeld. Hier laten we een procedure om de gehele hypothalamus neuroepithelium of deel daarvan (hypothalamische regio) voor transfectie door elektroporatie richten. De sleutels van onze aanpak zijn langer narcose keer, injectie in de third ventrikel en passende vorm en plaatsing van de elektroden. Daarnaast tonen we de resultaten van targeting en daaropvolgende histologische analyse van de meest verzonken hypothalamus nucleus, het mammillary lichaam.

Introduction

Genetische manipulatie van de embryonale hersenen van muizen is een geprefereerde aanpak te leren over ontwikkelingsregulatie. De generatie van mutante muizenlijnen echter traag en duur. Een methode wel specifieke genetische veranderingen in ontwikkeling neuronen van de hersenen van zoogdieren introduceren in utero elektroporatie. In wezen de techniek bestaat het transfecteren DNA in de embryonale hersenen neuroepithelium door middel van elektrische pulsen, waarna men het embryo te overleven gedurende een bepaalde tijd, het verzamelen van de hersenen en onderzoek ze mogelijke nieuwe, informatief fenotypes. Hierdoor kan de experimentator vrijwel direct testen hypotheses zonder lange wachttijden voor het samenstellen van muismutanten.

Transfectie van DNA in ontwikkelende embryo's begonnen met in-ovo elektroporatie op kippenembryo's 1. De essentiële proof-of-concept voor de muis werd uitgevoerd in de cultuur in de baarmoeder 3,4.

Het belangrijkste probleem is de hersenen van embryo ontwikkeling in utero transfecteren zonder hen of moeder doden. Leren om de noodzakelijke operatie uit te voeren (laparotomie, injectie, elektroporatie) vereist een lange trainingsperiode. Zodra de operatie is de knie tot het punt waar de embryo overleving verhouding aanvaardbaar is, de volgende belangrijke vraag is: welke hersenstructuren toegankelijk zijn? Niet verrassend, de eerste gepubliceerde artikelen tonen de resultaten verkregen met in utero elektroporatie gericht op de corticale ontwikkeling 5-9. Dit is nog steeds geldt voor de meeste publicaties met deze techniek, omdat het gebied van de ontwikkeling van muizenhersenen meest toegankelijke chirurgische procedures is de cortex (Figuur 1). De procedure in utero elektroporatie in de cortex is beschrevenin print 10 en in video 11-14. Een modificatie van de techniek kan worden gebruikt om een ventrale deel van de grote hersenen, de basale ganglia 15 richten.

Voorbij de grote hersenen, het diencephalon (klassiek verdeeld thalamus en hypothalamus) is een gebied van de voorhersenen moeilijker bereikbaar. Een klein aantal papers meldingen targeting van haar rug en meest toegankelijke deel, de thalamus 16-19.

De hypothalamus is het ventrale deel van de voorhersenen, daarom een gelokaliseerde diepste van het dorsale oppervlak (cortex) (figuur 1). Deze regio blijft een moeilijke uitdaging voor onderzoekers verbonden aan genetisch manipuleren van de hersenen van muizen in de baarmoeder. Voor zover wij weten, melden slechts zeer weinig artikelen over de resultaten van de in utero transfectie in de muis hypothalamus 20,21. De functionele betekenis van de hypothalamus cannot worden overdreven, omdat het reguleert gedrag zoals eten en drinken, paring, fokken en opvoeden 22. Bovendien, veranderingen in hypothalamus ontwikkeling helpen de latere leeftijd aandoeningen zoals zwaarlijvigheid, hypertensie, diabetes en voortijdige puberteit 23 ontstaan. In staat zijn om genetisch veranderen de hypothalamus tijdens de ontwikkeling zou zorgen voor een zeer krachtig instrument om het te begrijpen.

De basis chirurgische protocol voor laparotomie zwangere muizen die we hier gebruikt is vergelijkbaar met die in andere protocollen 11,13,14,24. We zullen ze hier kort beschrijven op volledigheid. Sleutel tot onze procedure, anderzijds, zijn de vorm van anesthesie, de plaats van toediening, de aard van de elektroden en de insertie en de positie van de positieve elektrode ten opzichte van het hoofd van de embryo's. We verkiezen voor inductie en handhaven verdoving door inhalatie gas via eenvoudige intraperitoneale anesthesie, aangezien de eerste maakt deiets langere narcose vereist een moeilijke operatie. Isofluraan inhalatie resulteert in sneller herstel van anesthesie, aangezien meestal de moeder toont normaal gedrag heeft minuten na de operatie. De eenvoudigste injectiepunt van de DNA-oplossing met de glazen micropipet is de laterale ventrikel, die echter volledig ongeschikt voor hypothalamus elektroporatie. Injectie rechtstreeks in het derde ventrikel is inderdaad cruciaal voor diepe diencephalic structuren te richten. Het is mogelijk om de hypothalamus transfecteren van E12.0 en E12.5 met standaard, off-the-shelf elektroden. We hebben een aantal van de elektroden vervaardigd door Nepa Gene (Chiba, Japan) bijzonder geschikt voor dit doel gevonden.

Met onze procedure transfectie van de gehele hypothalamus neuro-epitheel of gedeeltelijke, regionale transfectie afhankelijk elektrode oriëntatie krijgen we. Hier laten we de techniek door transfecteren van de mammillary lichaam, misschien welde diepste en meest verzonken van alle hypothalame kernen. Daarnaast tonen we gedetailleerde histologische analyse van de getransfecteerde cellen naar het cellulaire niveau van de resolutie.

Een vergelijking van de in utero elektroporatie met andere benaderingen transfecteren van de muis ontwikkelende hersenen in utero te vinden in de sectie discussie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van DNA en Glas Micropipetten voor injectie

  1. Goede kwaliteit glas micropipetten zijn essentieel om initiële hoge abortuscijfer wijten aan het verlies van vruchtwater verminderen. De procedure voor het glas micropipetten trekken is goed gedocumenteerd 13,18,25. Gebruik 1,2 mm diameter haarvaten getrokken in een conventionele Sutter P-97 toestel met de instellingen P = 500; Heat = 300; Trek = 40; Velocity = 50; Tijd = 50. Monteer de trekker met 3 mm "dal" filamenten (Sutter Instrument FT330B). De 2 mm formaat filamenten hebben opgeleverd voor ons minder bevredigende resultaten. Aan de andere kant, afschuinen van de micropipet tips lijkt geen resultaten voor ons te verbeteren.
  2. Los gezuiverd endotoxine-vrij plasmide DNA in PBS (Cell Culture Grade) dat 0,1% Fast Green tot een uiteindelijke concentratie van 1-2 ug / ul. De Fast Green zal de geïnjecteerde oplossing zichtbaar in de embryonale hersenen ventrikel maken.
  3. Plaats 10 gl van de DNA-oplossing in de glazen micropipet. Sluit het glas micropipet aan het inspuitsysteem (Pico pomp) of mond pipet.

2. Anesthesie

Bereid de chirurgische tafel met een verwarmingselement en de chirurgische instrumenten. Zet de koude lichtbronnen tot visualisatie van de embryo's te vergemakkelijken. Ontsmet de chirurgische instrumenten met behulp van bijvoorbeeld een glazen kraal sterilisator.

Drie verschillende anesthesie procedures mogelijk zijn voor dit protocol (zie discussie). Hier zullen we de ene beschouwen we de beste, met behulp van isofluraan inhalatie voor anesthesie-inductie (debiet 0,5 l / min) alsook het onderhoud (debiet 1 L / min) te beschrijven.

  1. Introduceer de zwangere muis in een klein doorzichtig (dus de muis zichtbaar blijft) container door een korte lengte van de slang aangesloten op de Komesaroff Mark 5 verdoving apparaat.
  2. Vul de verdamper met isofluraan, opent u vervolgens de zuurstoffles verbonden aan het apparaat. Blaas een of twee pulsen van isoflUrane / zuurstof (0.5 L / min) in de container met de muis en het horloge voor narcose te stellen inch
  3. Neem de muis uit, bedekken haar ogen met zalf om te voorkomen dat ze uitdrogen en past de doorstroming narcose masker op zijn hoofd onmiddellijk.

3. Laparotomie

  1. Plaats de muis buik tot aan de verwarming pad (anders zal haar lichaamstemperatuur zal dalen zeer snel gaan, het verminderen van de kans op herstel) en zijn lichaam veilig op zijn plaats door de vaststelling van haar vier poten aan de zijkanten met tape. Beoordelen van de diepte van de anesthesie door te controleren op verlies van respons op reflex stimulatie (bijvoorbeeld teen of staart knijpen met een stevige druk).
  2. Scheer de buik oppervlak en desinfecteer deze met de iodophorpovidone-jodium (Braunoderm).
  3. Maak een longitudinale incisie (1 tot 1,5 cm lang) op de buikhuid. Knip dan het buikvlies. Plaats een gaasje rond de incisie. Maak een baarmoedertak zichtbaar en trek het er voorzichtig met stompe tang op de PBS-gespoelde gauze. Spoel de baarmoeder met PBS vaak verband houden altijd bevochtigd (Figuren 2A en 2B). Tijdens de gehele procedure kan worden getrokken de mesometrium of uterus strakke, aangezien een hoge druk in de baarmoeder zendt de embryo vergroten van de kans op verlies van vocht bij injectie resulteert in abortus.

4. DNA Injectie in de hersenen ventrikel

  1. Houd de baarmoeder zodanig dat de hersenenventrikels kunnen worden gevisualiseerd. Hoeft niet uitgebreid te herpositioneren een embryo dat ligt in een ongunstige positie - dit alleen verhoogt de kans op abortus.
  2. Kijkend naar het hoofd van de embryo's van boven, lokaliseren visueel de opening of spleet tussen de linker en rechter corticale hemisferen. De hersenhelften duidelijk te onderscheiden en de laterale ventrikels erin (niet gericht) kunnen meestal als iets donkerder vormen worden waargenomen. Als een embryo wordt gevonden perfect georiënteerd te zijn voor DNA-injectie (Figures 2C en 2D), is het mogelijk te doorboren de baarmoederwand en voer de derde ventrikel tegelijk. Houd het glas micropipet bij 45 ° baarmoederwand en punctie bij de rostrale einde van de spleet tussen corticale hersenhelften doordringen ongeveer 1 mm. Op deze wijze het uiteinde van de glazen micropipet wordt de derde ventrikel van de hersenen (niet de laterale ventrikel) (Figuren 2C en 2D) invoeren. In embryo minder gunstig georiënteerde is het nuttig om eerst doorboren van de baarmoederwand (altijd 45 °) in de nabijheid van de embryonale hoofd plaatst de micropipet tip in de juiste positie tussen de corticale hemisferen en pas daarna perforeren hersenen. Injecteer ongeveer 1 pl DNA-oplossing in de derde ventrikel (een goede injectie vult het ventrikel met groene vloeistof). Herhaal dezelfde procedure met alle embryo's van een baarmoeder hoorn. Dit maakt het mogelijk enige tijd voor de DNA-oplossing gelijkmatig mengen met de ventriculaire vloeistof en bereiken de entire neuroepithelium.

5. Gericht op de Hypothalamus voor Elektroporatie

  1. Schakel de electroporator over en de instellingen aanpassen aan de embryonale leeftijd (voor E12.5 we gebruiken 5 blokvormige pulsen, 50 V, 50 msec ON/950 msec OFF). Gebruik als positieve pool van de roestvrij stalen naald elektrode (CUY550-10) en als negatieve pool van een ronde platte elektrode (CUY700P4L). (Het is belangrijk dat de elektroden kleiner dan de embryo, anders loopt de stroom net om de embryo maar niet doorheen.)
  2. Kies voor elektroporatie die embryo's waarvan dorsale zijde is up (dus gedraaid naar de experimentator) (zoals de meeste van hen zijn), en gooi die waarvan de oriëntatie is niet gunstig. Het is nu veilig om de baarmoeder te raken met ethanol-gedesinfecteerd vingers of met handschoenen. Houd de baarmoeder met een tang, maar zou interfereren met de stroom tijdens elektroporatie.
  3. Doorboren de baarmoederwand door het hoofd van de embryo's tussen de amniotic sac en de placenta door stoten beneden door het met de punt van de naald elektrode. Gebruik de wijsvinger van de andere hand als stuwkracht blok. Ongeveer 5 mm van de elektrode moet nu tussen de vruchtzak en de baarmoederwand, op ongeveer het niveau van de middenhersenen (figuren 2E en 2F). Herinner dat dit de "targeting elektrode", zodat de positie bepalen welk deel van de hypothalamus neuroepithelium is het meest waarschijnlijk te getransfecteerd. De embryo moet zeer voorzichtig "gecomprimeerde" tussen de elektroden.
  4. Met de andere hand, de positie van de ronde platte elektrode buiten de baarmoeder muur aan de andere kant van het hoofd van de embryo's (figuren 2E en 2G).
  5. Gebruik de pedaal schakelaar om de spanning toe te passen (50 V, 50 msec ON, 950 msec OFF, 5 blokvormige pulsen).
  6. Trek de naald elektrode uit de baarmoeder tijdje terug die de baarmoeder met de wijsvinger van de andere hand - als amniotic vloeistof verloren gaat door de lekke wand, meestal het embryo zal abortus te ondergaan. Herhaal de procedure met alle embryo's.
  7. Terug de baarmoeder hoorn in de buik en herhaal de injectie en elektroporatie in het overblijfsel hoorn.

6. Afwerking van de Chirurgie

  1. Na injectie en elektroporatie van alle embryo's, plaatst de baarmoeder terug in de buik zeer zorgvuldig, gepositioneerd precies zoals ze vóór en vochtig de buikholte met een zoutoplossing voor het sluiten van het ware.
  2. Hechten het buikvlies met catgut (Vicryl polyglactine 910, 5-0, Ethicon V4914). Voor de sluiting van de huid gebruik "onderbrak stitch" methodwith een meer resistente hechtdraad (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
  3. Desinfecteren de buik oppervlak met povidon-jood (Braunoderm) en injecteer een niet-steroïde anti-inflammatoire subcutaan (bijv. 100 ui van een 1:10 oplossing van Rimadyl in 0,9% NaCl) of, nog beter, een opioïde zoals buprenorphine (Temgesic, 0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht in 0,9% NaCl) om pijn te verlichten.
  4. Verwijder de moeder uit de narcose machine en plaats hem in een kooi die wordt verwarmd door een verwarmingselement. Toezien op de muis voortdurend tot deze volledig is hersteld van de narcose. Later, check de dagelijkse om te verzekeren dat ze zich herstellen van de procedure zonder enig teken van infectie of pijn dieren.

7. Het analyseren van de resultaten

  1. Oogst de embryo's (of postnatals) volgens de gewenste dag van de analyse. Postnatale muizen (1 tot 2 dagen oud) worden gedood door onthoofding.
  2. Scheid elk embryo volgens de voorgaande elektroporatie annotatie. Ontleden van de hersenen onder een stereomicroscoop en kijk onder de microscoop voor groen fluorescerend signaal (van de GFP reporter) in de juiste regio.
  3. De geselecteerde hersenen kunnen worden geanalyseerd "vers": fix het weefsel voor een korte tijd in 4% paraformaldehyde en inbedding in agarose 4% of gelatine-albumin, dan sectie op een vibratome-apparaat type (figuur 3). Voor meer gedetailleerde immunohistochemische analyse (figuur 4), cryo-bescherming van de hersenen 30% saccharose-oplossing, insluiten in oktober fixeermiddel (Tissue Tek) knip 20 urn secties in een cryostaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De meeste hypothalamus neuronen zijn geboren tussen E11.5 tot E15.2, volgens geboorte-dating-analyse bij de rat 26 vertaald in de wat kortere muis ontwikkeling 27,28. De piek van de hypothalamus neurogenese wordt bereikt bij E12.5 29-31. Dienovereenkomstig, op de leeftijd transfectie gekozen voor deze studie (E12.5), een groot deel van neuronen van de hypothalamus codeerbaar op elk rostro-caudale niveau.

Analyse op E18.5 op dikke vibratome-gedeelten die (Figuren 3A en 3B) toont dat de volledige rostro-caudale uitbreiding van de hypothalamus neuroepithelium toegankelijk is voor elektroporatie (Figuur 3A). Op een bepaalde leeftijd, kan neuronen worden geëtiketteerd helemaal mediolaterale niveaus (figuur 3B), in overeenstemming met de afstamming studies 32. De mammillary lichaam (MBO) is een neuronale kern ontwikkeling van de neuroepithelium voering een uitsparing in de meeste Ventral en het caudale deel van de voorhersenen. Dit maakt het MBO in principe zeer moeilijk te richten. Functioneel, het MBO is een belangrijke structuur voor het geheugen consolidatie en haar pathologische degeneratie leidt tot anterograde amnesie 33. We zijn erin geslaagd om reporterplasmiden transfecteren heel specifiek in deze kern (Figuren 3C en 3D) geweest. MBO neuronen breiden axonen vormen twee zeer karakteristiek en functioneel belangrijke traktaten die ook worden gelabeld na transfectie (pijlpunten in figuur 3C). Dwarsdoorsneden tonen aan dat de neuronen geboren op E12.5 (leeftijd van transfectie) vormen een gebogen "laag" rond een niet-gelabelde massa van neuronen eerder gegenereerd (dwz vóór de transfectie-experiment plaatsvond) (Figuur 3D).

Afgezien van de algemene migratiepatronen blijkt uit onderzoek op dikke secties met behulp van fluorescerende reporter eiwitten, een nadere analyse van de resultaten is possbaar met specifieke antilichamen op cryostaatsecties (figuur 4). Om het hier gekozen voorbeeld analyseren de MBO bereidden wij horizontale doorsneden parallel aan het vlak van de radiale gliale processen die uit de mammillary uitsparing (Figuur 4A). Vervolgens hebben we geïdentificeerd de MBO neuronen geboren uit neuroepithelium label op E12.5 met behulp van antilichamen tegen GFP (Figuur 4B). Zoals verwacht, het gemerkte antilichaam een beperkte groep MBO cellen (pijlpunt in figuren 4B, 4C en 4D). Deze groep is gelegen tussen twee gelabelde laterale en mediale MBO gebieden overeenkomende met MBO neuronen geboren voor (lateraal) en na (mediale) E12.5. Als voorbeeld, we co-gekleurd met een antilichaam tegen nestin (rood in figuren 4C en 4D) om de migratie wijze van individueel gemerkte neuronen op radiale gliale processen van de neuroepithelium tonen.


Figuur 1. De stand van de hypothalamus en bij Cortex midgestation. Sagittal (A) en transversale (B) schema's van de hersenen van een midgestation muisembryo met de dorsale en meest oppervlakkige voorhersenen structuur, de cortex (CTX, blauw) en de diepst geplaatst voorhersenen structuur, de hypothalamus (HY, rood).

Figuur 2
Figuur 2. Schema van de procedure. (A) De zwangere moeder is verdoofd en de baarmoeder blootgesteld. (B) In elke baarmoeder zwelling identificeren van de placenta inbrengen (zwarte pijlpunt),placenta (PL) en embryo. ME, mesometrium. (C) Identificeer de injectie punt in het midden van de linker en rechter corticale hemisferen (rode X). (D) Spuit DNA-oplossing in de derde ventrikel. (E) De naald elektrode (positief) doorboort de baarmoederwand tussen embryo en de placenta inbrengen. De platte elektrode (negatief) rust op de vrije kant van de baarmoeder. (F) Hypothetisch uitzicht vanaf de placenta kant toont positie van de positieve elektrode langs de hypothalamus. (G) bekijken van de vrije kant van de baarmoeder die de positie van de negatieve elektrode.

Figuur 3
Figuur 3. Transfecteren van de gehele hypothalamus of een deel ervan. Dik vibrerende microtoom gedeelten van vier verschillendewild-type E18.5 muis hersenen die de hypothalamus na in utero transfectie van plasmide DNA dat fluorescerende reporter genen GFP (A, C) of CFP (B, D) op E12.5. (A) Sagittale sectie (rostral naar links) toont een hypothalamus getransfecteerd van rostraal caudaal. Schaalbalk 500 micrometer. (B) Dwarsdoorsnede. Aan de getransfecteerde kant, kan gelabelde cellen zijn te vinden in alle mediolaterale niveaus. (C) Sagittale sectie toont een specifiek getransfecteerd mammillary lichaam (stippellijn, sterretje) en etikettering van zijn karakteristieke axonale boom (pijlpunten). (D) Dwarsdoorsnede door het mammillary lichaam (stippellijn). Aan de kant geëlektroporeerd (asterisk), een gemerkte band overeenkomend met neuronen geboren op E12.5 zichtbaar. Hy, hypothalamus, Th, thalamus

Figuur 4 Figuur 4. Het analyseren van specifieke stappen in de hypothalamus ontwikkeling. (A) Schematische weergave van een horizontale doorsnede door de ontwikkeling van de hersenen met de mammillary lichaam (rood). De regio afgebeeld in (B) en (C) is ingelijst. (B) Antibody etikettering van GFP op een horizontale doorsnede door het E18.5 mammillary lichaam na GFP transfectie bij E12. Cellen geboren op E12.5 vormen een duidelijke band in de kern (pijl in B, C en D). Schaalbalk 100 urn. (C) antilichaam labeling van neuro marker nestine (rood) van de sectie getoond in (B). Schaalbalk 100 micrometer. (D) Individuele cellen kunnen worden geïdentificeerd in de specifieke E12.5 band in het mammillary lichaam onder hoge vergroting. Schaalbalk 20 micrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Over de anesthesie: Aangezien in utero elektroporatie in de hypothalamus technisch lastig en vereisen een langere tijd narcose we bij voorkeur inductie en handhaven van verdoving door toediening van een mengsel van zuurstof en isofluraan. In onze ervaring, kunnen dieren goed verdoofd blijven op deze manier voor een periode van maximaal een uur op zijn minst, het herstel van de moeder is erg snel, en de overleving van embryo's verbeterd. Andere benaderingen van anesthesie zijn ook beschikbaar. De meest eenvoudige werkwijze omvat het induceren en handhaven narcose door intraperitoneale injectie van 2,5 ml / kg lichaamsgewicht van een mengsel van ketamine (25 mg / ml), Xylazin (1.2 mg / ml) en Acepromazin (0,35 mg / ml) in 0,9 % steriel NaCl ("triple combo"). Met dit mengsel alleen op de aanbevolen doses hier wordt een narcose van ongeveer 30 minuten (tot 45 min in sommige gevallen) geïnduceerd. Dit is meestal voldoende in utero elektroporatie in de cortex op E12.5 (via injeel in de laterale ventrikel). Het voordeel van deze methode is dat het geheel geen behoefte aan een narcose-apparaat en andere apparatuur. Echter, dit soort intraperitoneale anesthesie niet aanbevolen bij langere tijden van chirurgie noodzakelijk, aangezien opnieuw injecties in het verdoofde dier om de verdoving te verlengen wordt vaak gevolgd door de dood. Het is ook mogelijk om intraperitoneale en inhalatie anesthesie combineren door eerst een injectie van de "triple combinatie" (zoals hierboven) om verdoving te induceren, handhaven dan door inademing van isofluraan / zuurstof. Alhoewel met deze werkwijze de narcose kan worden gehandhaafd zolang als het nodig is, de terugwinning van de zwangere muis na de operatie is niet zo goed als bij inhalatie alleen. Trouwens, wanneer we gebruik maken van de "triple combo" intraperitoneale injectie, overleving van embryo's vermindert.

De plaatsing van de elektroden op het hoofd van het embryo zoals afgebeeld in

De laparotomie is eenvoudig genoeg. Echter, de experimentator bereikt het niveau van vaardigheid dat zorgt voor een hoge overleving verhouding van embryo's (na intraventriculaire injectie, gevolgd door toediening van elektrische pulsen) na een vlakke leercurve. Individuele vaardigheden is een belangrijke factor, zodat in utero elektroporatie in het algemeen en de toepassing ervan op de hypothalamus in het bijzonder niet kan bewijzen helemaal praktisch voor sommige studenten . Om het leren te verkorten, alsmede de reproduceerbaarheid en de statistische analyses verhogen we vonden het nuttig om een ​​gedetailleerd protocol dat informatie bevat over het aantal en de positie van de embryo's, en het uiterlijk, de kwaliteit van de injectie en de positie van de elektroden bij benadering te vullen de individuele embryo. Het vergelijken van deze gegevens over het experiment met de definitieve resultaten, op een embryo-by-embryo basis is nuttig om te begrijpen en verbeteren van de procedure bewezen.

Andere rapporten 20,21 hebben de hypothalamus gericht met Nepagene pincet-elektroden. We consequent betere resultaten te verkrijgen met de toepassing van een naald-elektrode en een platte afdekking-elektrode van dezelfde fabrikant. In onze ervaring, het gebruik van deze methode maakt rostro-caudale targeting makkelijker. Tweezer elektroden lijken ofwel meer ervaring / vaardigheid of een veel groter aantal experimenten nodig om bruikbare resultaten opleveren.

jove_content "> tenminste twee benaderingen DNA constructen transfecteren in de ontwikkelende muis hypothalamus te vergelijken in utero elektroporatie. Het eerste is ook gebaseerd op laparotomie injectie in de embryonale hersenen ventrikel, het verschil is dat het DNA van belang is gedragen door een virusdeeltje Het virus infecteert de neuro cellen en zo transfects onze experimentele constructie - geen elektroporatie nodig. Voordelen:. procedure vermijdt de elektrische pulsen die nodig zijn voor elektroporatie daarom embryo overleving verbetert waarschijnlijk de belangrijkste nadelen van deze methode. zijn: 1) werken met virussen vereist speciale voorzorgsmaatregelen en S2 voorzieningen; 2) targeting is uit den boze, omdat virale deeltjes zullen verspreid over het hele ventrikel waardoor het in principe even waarschijnlijk elke neuro regio transfecteren (natuurlijk een zekere mate van transfectie in de regio van belang is waarschijnlijk). Natuurlijk, in de baarmoeder in utero elektroporatie, dwz de relatief moeilijke chirurgische ingreep, met een lange leercurve afhankelijk sterk af van de individuele vaardigheden van de experimentator.

De andere groep benaderingen vermijdt operatie volledig omdat het is gebaseerd op de injectie van de constructen te transfecteren in de bloedstroom van de zwangere muis. Staartader (staartader) injectie van shRNA 34,35 of plasmiden 36 heeft de potentie om genetisch manipuleren zeer vroege embryo, hoewel regiospecifieke targeting is niet mogelijk met deze methode. Deze veelbelovende benadering lijkt nog niet klaar voor algemene toepassing. Virale deeltjes (adeno-geassocieerd virus) geïnjecteerd in het gezicht ader van neonatale muizen (maar niet oudere muizen) is in staat om de hersenen neuronen transfecteren 37. Tenslotte nanodeeltjes, die uiteindelijk kan worden gebruikt als DNA-dragers, de hersenen na staart v bereikenein injectie in volwassen muizen 38. Deze twee werkwijzen, die de mogelijkheid transfecteren zeer vroege embryo openen, moeten onze kennis nog niet toegepast op zwangere muizen.

Leeftijd van transfectie en collectie: Voor het leren van de procedure, is het waarschijnlijk het beste om te proberen om E14.5 embryo transfecteren, en vervolgens overstappen naar de eerdere, moeilijker embryonale leeftijden. In onze ervaring, GFP expressie is zichtbaar onder UV-licht al 24 uur na transfectie. Na E12.5 transfectie, GFP expressie op E18.5 is erg sterk. We hebben geëlektroporeerd op E12.5, E13.5, E14.5 en E15.5 en geanalyseerd E17.5, E18.5, P0 en P1 kunnen sterke reporter uitdrukking komen in alle gevallen. Als embryo's van wie de hersenen zijn getransfecteerd in utero mogen termijn te bereiken (voor postnatale dataverzameling), soms zijn ze selectief gegeten door de moeder. Dit suggereert subtiele veranderingen in jong uiterlijk of gedrag geïnduceerd door hersenen manipulatie (hun temperatuur kan lager zijn, of misschien hebben ze niet de juiste geluidssignalen uitzenden). In die postnatale dieren die moederlijke ruiming overleven, hebben we reporterexpressie totdat P1 minstens waargenomen up. Meldingen in de literatuur tonen expressie van getransfecteerde constructen zelfs vier maanden na de geboorte 10.

Vectoren voor elektroporatie: gebruiken we bicistronisch reporter plasmide aangestuurd door de CAG promotor 39, gevolgd door het cDNA van het gen van belang, gescheiden door een interne ribosoom toegangsplaats (IRES) 40, uit het cDNA van een fluorescerende reporter, bijvoorbeeld de versterkte groen fluorescent eiwit 41. Het CAG promotor is zo sterk in neuronen dat het niveau van DNA te hoog kan produceren voor de getransfecteerde cellen, hen te doden. Hoewel we hebben nooit massieve apoptose na transfectie, een mogelijke oplossing, moet het probleem weergegeven, het gebruik van een minder efficiënte promoter zijn, zoals de EF1 alfa 42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Tags

Neurowetenschappen neurobiologie genetica celbiologie moleculaire biologie biomedische technologie Developmental Biology Anatomie Fysiologie Embryo Zoogdier Brain Diencephalon Hypothalamus genetische technieken Transfection anesthesie ontwikkeling elektroden elektroporatie, Mammillary lichaam muis diermodel
Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, … More

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N. E., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter