Summary
Malgré l'importance fonctionnelle et médicale de l'hypothalamus,
Abstract
La modification génétique des régions spécifiques du cerveau des mammifères en développement est une approche expérimentale très puissant. Cependant, générant des nouveaux mutants de souris est souvent d'une lenteur décourageante. Il a été démontré que l'accès au cerveau de souris en développement in utero à la survie post-opératoire raisonnable est possible. Pourtant, les résultats de cette procédure ont été signalés presque exclusivement pour la partie la plus superficielle et facilement accessibles du cerveau en développement, à savoir le cortex. Le thalamus, une région étroite et plus médial, s'est avéré plus difficile à cibler. Transfection dans des noyaux plus profond, en particulier ceux de l'hypothalamus, est peut-être les résultats les plus difficiles et donc très peu ont été rapportés. Ici, nous démontrons une procédure de cibler l'ensemble neuroépithélium hypothalamique ou une partie de celui-ci (régions hypothalamiques) pour la transfection par électroporation. Les clés de notre approche sont plus narcose fois, l'injection dans le troisi ventricule, et le type et le positionnement des électrodes approprié. En outre, nous montrons les résultats de ciblage et d'analyse histologique du noyau hypothalamique plus en retrait, le corps mamillaire.
Introduction
La manipulation génétique du cerveau embryonnaire de souris est une approche privilégiée pour en apprendre davantage sur la régulation du développement. La génération de lignées de souris mutantes est cependant lent et coûteux. Une méthode puissante pour introduire des modifications génétiques spécifiques dans le développement des neurones du cerveau des mammifères est en électroporation in utero. Essentiellement, la technique consiste à transfecter l'ADN dans le neuroépithélium cerveau embryonnaire au moyen d'impulsions électriques, puis permettre à l'embryon de survivre pendant un certain laps de temps, de recueillir le cerveau et les examiner une éventuelle roman, phénotypes informatives. De cette façon, l'expérimentateur peut tester des hypothèses presque immédiatement, sans les longues périodes d'attente nécessaires pour la production de mutants de souris.
Transfection d'ADN dans des embryons en développement a commencé par électroporation in ovo sur des embryons de poulet 1. La preuve de concept essentiel pour la souris a été réalisée dans la culture
Le principal problème consiste à transfecter le cerveau d'embryons en développement in utero sans eux ou la mère qui tue. Apprendre à effectuer la chirurgie nécessaire (laparotomie, l'injection, l'électroporation) nécessite une longue période de formation. Une fois que l'opération a été maîtrisé au point où le taux de survie des embryons est acceptable, la prochaine question clé est: quelles structures cérébrales sont-ils accessibles? Sans surprise, les premiers articles publiés montrant les résultats obtenus avec électroporation in utero axés sur le développement cortical 5-9. Cela est encore vrai pour la plupart des publications utilisant cette technique, car la région du cerveau de souris en développement plus accessible à des procédures chirurgicales est le cortex (Figure 1). La procédure d'électroporation in utero dans le cortex a été décriten version imprimée et en vidéo 10 11-14. Une modification de la technique peut être utilisée pour cibler une partie ventrale du télencéphale, les noyaux gris centraux 15.
Au-delà du télencéphale, diencéphale (classiquement divisé en thalamus et de l'hypothalamus) est une région du cerveau antérieur plus difficiles à atteindre. Un petit nombre de documents ciblant des rapports de sa partie dorsale et le plus accessible, le thalamus 16-19.
L'hypothalamus est la partie la plus ventrale du cerveau antérieur, donc celle localisée plus profondément de la surface dorsale (cortex) (Figure 1). Cette région reste un défi difficile pour les chercheurs engagés à manipuler génétiquement le cerveau de souris in utero. À notre connaissance, seuls quelques articles un rapport sur les résultats de transfection in utero dans l'hypothalamus de souris 20,21. Cependant, l'importance fonctionnelle de l'hypothalamus cannot être surestimée, car elle régule les comportements comme manger et de boire, l'accouplement, la reproduction et la parentalité 22. En outre, les altérations dans le développement hypothalamique contribuent à provenir tard dans des conditions de vie comme l'obésité, l'hypertension, le diabète et la puberté précoce 23. Être capable de modifier génétiquement l'hypothalamus au cours du développement constituerait un outil très puissant pour comprendre.
Le protocole chirurgical de base pour la laparotomie de souris gravides que nous utilisons ici est similaire à celle utilisée dans les autres protocoles 11,13,14,24. Nous allons décrire ici brièvement par souci d'exhaustivité. La clé de notre procédure, d'autre part, sont le type d'anesthésie, l'endroit de l'injection, le type d'électrodes et de l'insertion et de la position de l'électrode positive par rapport à la tête de l'embryon. Nous préférons pour induire et maintenir une anesthésie par inhalation de gaz plus simples anesthésie intrapéritonéale, puisque le premier permet l'un peu plus longues périodes de narcose nécessaires pour une chirurgie difficile. Résultats d'inhalation isoflurane chez une récupération plus rapide de l'anesthésie, car, généralement, la mère démontre un comportement normal déjà minutes après la chirurgie. Le point d'injection de la solution d'ADN avec la micropipette de verre la plus simple est le ventricule latéral, ce qui est cependant tout à fait impropre à l'électroporation de l'hypothalamus. Injection directement dans le troisième ventricule est en effet crucial de cibler les structures diencéphaliques profondes. Il est possible de transfecter l'hypothalamus de E12.0 ou E12.5 à la norme électrodes, off-the-shelf. Nous avons trouvé quelques-uns des électrodes fabriquées par Nepa Gene (Chiba, Japon) particulièrement adapté à cet effet.
Grâce à notre procédure nous obtenons transfection de l'ensemble neuroépithélium hypothalamique ou transfection régionale partielle en fonction de l'orientation de l'électrode. Ici, nous démontrons la technique par transfection du corps mamillaire, sans doutele plus profond et le plus en retrait de tous les noyaux hypothalamiques. En outre, nous montrons l'analyse histologique détaillée des cellules transfectées jusqu'au niveau cellulaire de la résolution.
Une comparaison des électroporation in utero avec d'autres approches de la transfection le développement du cerveau de la souris in utero peut être trouvée dans la section Discussion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de l'ADN et verre Micropipettes pour injection
- Bonne Pipette en verre de qualité sont essentiels pour réduire le taux élevé d'avortements initiale due à la perte de liquide amniotique. La procédure de tirer micropipettes de verre a été bien documenté 13,18,25. Utiliser 1,2 mm de diamètre capillaires tirée dans une Sutter classique P-97 appareil avec les paramètres P = 500; chaleur = 300; Tirer = 40; Velocity = 50; Temps = 50. Monter l'extracteur avec 3 mm de filaments de «creux» (Sutter Instrument FT330B). Les filaments de taille de 2 mm ont donné pour nous des résultats moins satisfaisants. D'autre part, le biseautage des pointes de micropipette ne semble pas améliorer les résultats pour nous.
- Dissoudre purifié, l'ADN plasmidique sans endotoxine dans PBS (Cell Culture Grade) contenant 0,1% de Fast Green à une concentration finale de 1 à 2 pg / pl. The Green rapide fera la solution injectée visible dans le ventricule cérébral embryonnaire.
- Charge de 10 pi de la solution d'ADN dans la micropipette de verre. Raccorder la micropipette de verre pour le système d'injection (pompe à Pico) ou d'une pipette de bouche.
2. Anesthésie
Préparer la table d'opération avec un coussin chauffant et les instruments chirurgicaux. Activer les sources de lumière froide pour faciliter la visualisation des embryons. Désinfecter les outils chirurgicaux en utilisant par exemple une bille de verre stérilisateur.
Trois procédures d'anesthésie sont possibles pour ce protocole (voir la discussion). Ici, nous allons décrire celui que nous considérons le meilleur, en utilisant inhalation isoflurane pour l'induction de l'anesthésie (débit de 0,5 L / min) ainsi que la maintenance (débit de 1 l / min).
- Introduire la souris enceinte dans un petit transparent (si la souris reste visible) récipient relié à la Komesaroff Mark 5 anesthésique périphérique par une courte longueur de tube.
- Remplir le vaporisateur avec de l'isoflurane, puis ouvrez la bouteille d'oxygène relié à l'appareil. Soufflez un ou deux impulsions de isoflurane / oxygène (0,5 L / min) dans le récipient tenant la souris et montre pour la narcose à mettre po
- Prenez la souris sur, couvrir les yeux avec de la pommade pour les empêcher de sécher et monter le masque d'anesthésie de l'écoulement sur la tête immédiatement.
3. Laparotomie
- Placez la souris ventre en l'air sur le coussin chauffant (sinon sa température corporelle va baisser très rapidement, ce qui diminue les chances de reprise) et sécuriser son corps en place en fixant ses quatre pattes sur les côtés avec du ruban adhésif. Évaluer la profondeur de l'anesthésie en vérifiant la perte de la réponse à la stimulation réflexe (par exemple orteil ou pincement de la queue avec une pression ferme).
- Raser la surface abdominale et désinfecter avec le iodophorpovidone-iode (Braunoderm).
- Faire une incision longitudinale (1 à 1,5 cm de longueur) sur la peau de l'abdomen. Ensuite, couper le péritoine. Placez la gaze de coton autour de l'incision. Faire une corne utérine visible et retirez-le délicatement avec une pince émoussée sur le PBS rincé gauze. Rincer l'utérus avec PBS très souvent pour le garder toujours humecté (Figures 2A et 2B). Pendant toute la procédure éviter de tirer le mésomètre ou de l'utérus serré, puisque haute pression à l'intérieur de l'utérus transmettra à l'embryon augmente les chances de perte de fluide lors de l'injection entraîne l'avortement.
4. Injection d'ADN dans le ventricule cérébral
- Maintenir l'utérus de manière à ce que les ventricules cérébraux peuvent être visualisées. Ne pas largement repositionner un embryon qui se trouve dans une position défavorable - cela ne fera qu'accroître les chances de l'avortement.
- En regardant la tête de l'embryon, de haut, de localiser visuellement l'écart ou fissure entre les deux hémisphères du cortex gauche et droite. Les hémisphères sont faciles à distinguer et les ventricules latéraux intérieur d'eux (pour ne pas être la cible) peuvent généralement être perçus comme des formes un peu plus sombres. Si l'embryon se trouve être parfaitement orientée pour l'injection d'ADN (Figures 2C et 2D), il est possible de percer la paroi utérine et entrent dans le troisième ventricule à la fois. Maintenez la micropipette de verre à 45 ° de la paroi utérine et une ponction à la fin rostrale de l'écart entre les hémisphères corticaux, pénétrant pendant environ 1 mm. De cette manière, la pointe de la micropipette de verre va entrer dans le troisième ventricule cérébral (pas le ventricule latéral) (figures 2C et 2D). En moins favorablement orientés embryons, il est utile de commencer par la paroi utérine Pierce (toujours à 45 °) dans le voisinage de la tête embryonnaire, placer la pointe micropipette dans la bonne position entre les hémisphères corticaux et seulement ensuite perforer le cerveau. Injecter environ 1 pl de solution d'ADN dans le troisième ventricule (une bonne injection remplit le ventricule avec du liquide vert). Répétez la même procédure avec tous les embryons d'une corne utérine. Ceci permet un certain temps pour la solution d'ADN à mélanger uniformément avec le fluide du ventricule et à atteindre la entire neuroépithélium.
5. Cibler l'hypothalamus pour l'électroporation
- Mettez le électroporateur et ajuster les réglages en fonction de l'âge embryonnaire (E12.5 nous utilisons pour 5 impulsions rectangulaires, 50 V, 50 msec ON/950 ms OFF). Utilisation telle que le pôle positif de l'électrode d'aiguille en acier inoxydable (CUY550-10) et en tant que pôle négatif d'une électrode plate ronde (CUY700P4L). (Il est important que les électrodes sont plus petits que l'embryon, puisque le courant contraire coule juste autour de l'embryon, mais pas au travers.)
- Sélectionnez pour l'électroporation ces embryons dont la face dorsale est en hausse (c. tourné vers l'expérimentateur) (comme la plupart d'entre eux sont), et jetez ceux dont l'orientation est pas favorable. Il est maintenant sûr de toucher l'utérus avec les doigts éthanol ou désinfectée avec des gants. Tenir l'utérus avec une pince, cependant, cela nuirait à la circulation du courant au cours de l'électroporation.
- Percer la paroi utérine par la tête de l'embryon entre le amniotic sac et le placenta en poussant vers le bas à travers elle à la pointe de l'électrode à aiguille. Utilisation de l'index de l'autre côté en tant que bloc de poussée. Environ 5 mm de la pointe de l'électrode doit être présent entre le sac amniotique et la paroi utérine, à peu près au niveau du mésencéphale (figures 2E et 2F). N'oubliez pas que c'est le "électrode ciblage», de sorte que sa position va déterminer quelle partie de la neuroépithélium hypothalamique est le plus susceptible de se transfectées. L'embryon doit être très doucement "pressé" entre les électrodes.
- Avec l'autre main, la position de l'électrode, plat et circulaire en dehors de la paroi de l'utérus, du côté opposé de la tête de l'embryon (figures 2E et 2G).
- Utilisez la pédale pour appliquer une tension (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 impulsions rectangulaires).
- Tirez doucement sur l'électrode d'aiguille de l'utérus tout en retenant l'utérus avec l'index de l'autre main - si amnioliquide tic est perdue par le mur percé, généralement l'embryon va subir un avortement. Répétez la procédure avec tous les embryons.
- Retour de la corne de l'utérus dans l'abdomen et répéter l'injection et l'électroporation dans la corne reste.
6. Finition de la chirurgie
- Après l'injection et l'électroporation de tous les embryons, placez l'utérus dans l'abdomen très soigneusement, positionné exactement comme ils étaient avant et humide de la cavité péritonéale avec une solution saline avant de le refermer.
- Suturer le péritoine avec Catguts (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Pour la fermeture de l'utilisation de la peau "interrompu point" methodwith un de suture plus résistant (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner AUX 07171L).
- Désinfecter la surface de l'abdomen avec povidone-iode (Braunoderm) et injecter un non-stéroïdien anti-inflammatoire cutanée (par exemple 100 pi d'une solution à 1:10 de Rimadyl dans NaCl à 0,9%) ou, mieux encore, un opioïde comme buprenorphine (Temgesic, de 0,05 à 0,1 mg / kg de poids corporel dans NaCl à 0,9%) pour soulager la douleur.
- Retirez la mère de l'appareil d'anesthésie et le placer dans une cage qui est chauffé par un coussin chauffant. Surveiller la souris continuellement jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli de l'anesthésie. Par la suite, vérifiez les animaux tous les jours pour s'assurer qu'ils se remettent de la procédure, sans aucun signe d'infection ou de la douleur.
7. Analyse des résultats
- Récolter des embryons (ou postnatals) en fonction du jour de l'analyse souhaitée. Souris postnatal (vieux de 1 à 2 jour) sont tués par décapitation.
- Séparez chaque embryon en fonction de la précédente annotation d'électroporation. Disséquer le cerveau sous une loupe binoculaire et regarder sous le microscope de signal fluorescent vert (de la journaliste GFP) dans la région appropriée.
- Le cerveau sélectionné peut être analysée "frais": fixer le tissu pendant une courte période dans du paraformaldéhyde 4% et l'intégrer dans agarose 4% ou dans de la gélatine-albumin, alors l'article sur un périphérique vibratome type (Figure 3). Pour une analyse immunohistochimique plus détaillée (figure 4), cryo-protéger le cerveau dans une solution de saccharose à 30%, intégrer dans un milieu de montage (OCT Tissue Tek) puis réduction de 20 sections um dans un cryostat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La plupart des neurones de l'hypothalamus sont nés entre E11.5 à E15.2, selon l'analyse naissance-dating chez le rat 26 traduit en développement un peu plus courte de souris 27,28. Le pic de la neurogenèse hypothalamique est atteint à E12.5 29-31. En conséquence, à l'âge de transfection choisi pour la présente étude (E12.5), une grande proportion des neurones hypothalamiques peut être marqué à n'importe quel niveau rostro-caudale donné.
Analyse à -18,5 en sections vibratome type épais (figures 3A et 3B) montre que la totalité de l'extension rostro-caudale du neuroépithélium hypothalamique est accessible à l'électroporation (figure 3A). A un âge donné, les neurones peuvent être étiquetés à tous les niveaux médio-latérale (figure 3B), en accord avec les études de la lignée 32. Le corps mamillaire (MBO) est un noyau en développement neuronal du neuroépithélium revêtement d'un évidement dans la plupart Ventral et la partie caudale du cerveau antérieur. Cela rend la MBO en principe très difficile à cibler. Fonctionnellement, la MBO est une structure clé pour la consolidation de la mémoire et de ses résultats de dégénérescence pathologique dans une amnésie antérograde 33. Nous avons été capables de transfecter plasmides rapporteurs très précisément dans ce noyau (figures 3C et 3D). Neurones MBO s'étendent axones formant deux voies importantes caractéristique et très fonctionnel qui sont également marqué après transfection (pointes de flèches dans la figure 3C). Des coupes transversales montrent que les neurones nés à E12.5 (âge de transfection) forment une "couche" courbe autour d'une masse non marqué de neurones générés plus tôt (avant l'expérience de transfection a eu lieu) (figure 3D).
Au-delà des schémas de migration générales indiquées par l'examen des sections d'épaisseur à l'aide de protéines rapporteurs fluorescents, une analyse plus fine des résultats est possible utilisant des anticorps spécifiques sur des coupes au cryostat (Figure 4). Pour analyser l'exemple choisi ici, la MBO, nous avons préparé des sections horizontales parallèles au plan des processus gliales radiales émanant de la cavité mamillaire (figure 4A). Nous avons ensuite identifié les neurones MBO nés de neuroépithélium marqué sur E12.5 à l'aide d'anticorps contre GFP (figure 4B). Comme attendu, l'anticorps marqué un groupe restreint de cellules MBO (pointe de flèche dans les figures 4B, 4C et 4D). Ce groupe était situé entre deux zones non marqué latéral et médial MBO correspondant respectivement aux neurones MBO nés avant (latéral) et après (médiale) E12.5. Par exemple, ici, nous co-colorées avec un anticorps dirigé contre la nestine (en rouge dans les figures 4C et 4D) afin de montrer le mode de neurones marqués individuellement sur les processus gliales radiales de la neuroépithélium de migration.
Figure 1. Les positions relatives de l'hypothalamus et le cortex au milieu de la gestation. Sagittale (A) et transversale (B) diagrammes du cerveau d'un embryon de souris de midgestation montrant la structure du cerveau antérieur le plus dorsal et le plus superficiel, le cortex (CTX, bleu) ainsi que le plus profondément la structure du cerveau antérieur placé, l'hypothalamus (HY, rouge).
Figure 2. Schéma de la procédure. (A) Le barrage enceinte est anesthésié et l'utérus exposé. (B) Dans chaque gonflement utérine identifier l'insertion placentaire (tête de flèche noire),placenta (PL) et de l'embryon. ME, mésomètre. (C) identifier le point d'injection dans le milieu des hémisphères corticaux gauche et droite (X rouge). (D) Injecter la solution d'ADN dans le troisième ventricule. (E) l'aiguille électrode (positive) perce la paroi utérine entre l'embryon et l'insertion placentaire. L'électrode plate (négatif) repose sur le côté libre de l'utérus. (F) vue hypothétique du côté placentaire montrant la position de l'électrode positive le long de l'hypothalamus. (G) Vue du côté libre de l'utérus montrant la position de la électrode négative.
Figure 3. Transfection de l'ensemble de l'hypothalamus ou une partie de celui-ci. Épaisses sections vibrante microtomiques de quatre différentstype sauvage -18,5 cerveaux de souris montrant l'hypothalamus in utero après transfection d'ADN plasmidique portant fluorescent gènes rapporteurs GFP (A, C) ou PCP (B, D) à E12.5. (A) Coupe sagittale (rostrale à gauche) montrant une hypothalamus transfectées de rostral à caudal. La barre d'échelle 500 (B) coupe transversale um.. Sur le côté transfectées, les cellules marquées peuvent être trouvées à tous les niveaux médio-latérale. (C) Coupe sagittale montrant un corps mamillaire spécifiquement transfectées (ligne en pointillés, astérisque) et l'étiquetage de son arbre axonal caractéristique (flèches). (D) Coupe transversale à travers le corps mamillaire (ligne pointillée). Sur le côté électroporé (astérisque), une bande marquée correspondant aux neurones nés à E12.5 peut être vu. Hy, l'hypothalamus, Th, thalamus
Figure 4. Analyse des mesures spécifiques en matière de développement hypothalamique. (A) Schéma d'une coupe horizontale à travers le développement du cerveau montrant le corps mamillaire (rouge). La zone représentée en (B) et (C) étant encadrée. (B) Anticorps étiquetage de la GFP sur une coupe horizontale à travers le corps -18,5 mamillaire GFP après transfection à E12. Cellules nés à E12.5 forment un groupe distinct dans le noyau (pointe de flèche en B, C et D). La barre d'échelle 100 um. (C) l'étiquetage des anticorps de neuro marqueur nestine (rouge) sur la section indiqués dans (B). La barre d'échelle 100 um. (D) des cellules individuelles peuvent être identifiées dans le E12.5 bande spécifique dans le corps mamillaire à fort grossissement. La barre d'échelle de 20 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A propos de l'anesthésie: Depuis électroporation in utero dans l'hypothalamus peut être techniquement difficile et nécessiter des temps de narcose plus, nous préférons pour induire et maintenir une anesthésie par administration d'un mélange d'oxygène et d'isoflurane. Dans notre expérience, les animaux peuvent rester suffisamment anesthésiés de cette façon pendant des périodes allant jusqu'à une heure au moins, la reprise de la mère est très rapide, et la survie de l'embryon améliorée. D'autres approches à l'anesthésie sont également disponibles. La procédure la plus simple consiste à induire et maintenir la narcose par injection intrapéritonéale de 2,5 ml / kg de poids corporel d'un mélange de kétamine (25 mg / ml), xylazine (1,2 mg / ml) et Acepromazin (0,35 mg / ml) à 0,9 NaCl stérile d'% ("triple combo"). Avec ce mélange seul aux doses recommandées ici, une narcose d'environ 30 minutes (jusqu'à 45 minutes dans certains cas) est induite. C'est généralement suffisant pour électroporation in utero dans le cortex à E12.5 (par injection dans le ventricule latéral). L'avantage de cette méthode est qu'elle évite complètement la nécessité d'un dispositif de narcose et d'autres équipements. Cependant, ce type d'anesthésie intrapéritonéale n'est pas recommandé si durées plus longues de la chirurgie sont nécessaires, puisque d'autres injections chez l'animal anesthésié afin de prolonger la période d'anesthésie sont souvent suivis par la mort. Il est également possible de combiner intrapéritonéale et l'anesthésie par inhalation en utilisant d'abord une injection de la «triple combo" (comme ci-dessus) afin d'induire une narcose, puis le maintenir par inhalation d'isoflurane / oxygène. Bien que cette méthode particulière de la narcose peut être maintenue aussi longtemps que cela est nécessaire, la reprise de la souris enceintes après l'opération n'est pas aussi bonne qu'avec inhalation seul. D'ailleurs, chaque fois que nous utilisons le "triple combo" injection intrapéritonéale, à la survie de l'embryon diminue.
Le positionnement des électrodes sur la tête de l'embryon tel que représenté sur La laparotomie est assez simple. Cependant, l'expérimentateur a atteint le niveau de compétence qui permet de ratio élevé de survie des embryons (après injection intraventriculaire suivie par l'administration d'impulsions électriques) après une courbe d'apprentissage à plat. Compétence individuelle est un facteur important pour que électroporation in utero en général et de son application à l'hypothalamus en particulier peut s'avérer pas tout à fait pratique pour certains étudiants . Pour raccourcir la période d'apprentissage ainsi que d'augmenter la reproductibilité et l'analyse statistique, nous avons jugé utile de remplir un protocole détaillé comportant des informations sur le nombre et la position des embryons, et l'apparence, la qualité de l'injection et de la position approximative des électrodes pour les embryons individuels. En comparant ces données à propos de l'expérience avec les résultats définitifs, sur une base embryon par embryon s'est avéré utile pour comprendre et améliorer la procédure. D'autres rapports ont ciblé 20,21 l'hypothalamus avec des électrodes pince de type Nepagene. Nous obtenons régulièrement de meilleurs résultats avec l'application d'une aiguille-électrode et une électrode plate couverture du même fabricant. Dans notre expérience, l'utilisation de cette méthode permet rostro-caudale ciblage plus facile. électrodes de brucelles semblent exiger soit plus d'expérience / compétence ou un plus grand nombre d'expériences afin de produire des résultats utiles.
L'autre groupe de méthodes permet d'éviter complètement la chirurgie, car il est basé sur l'injection des produits d'assemblage pour transfecter dans le flux de sang de la souris enceinte. veine (veine caudale) injection de queue de shRNA 34,35 ou 36 plasmides a le potentiel pour manipuler génétiquement des embryons très précoces, bien que le ciblage spécifique à la région n'est pas possible avec cette méthode. Cette approche prometteuse ne semble pas encore prête pour une application générale. Les particules virales (virus adéno-associé) injectés dans la veine faciale des souriceaux nouveau-nés (mais pas des souris âgées) est capable de transfecter des neurones du cerveau 37. Enfin, les nanoparticules, qui pourraient éventuellement être utilisés comme supports de l'ADN, peuvent atteindre le cerveau après queue vinjection de ein chez les souris adultes 38. Ces deux méthodes, qui ouvrent la possibilité de transfection embryons très précoces, ont à notre connaissance, pas encore été utilisé sur des souris gravides.
Age de la transfection et la collecte: Pour l'apprentissage de la procédure, il est probablement préférable d'essayer de transfection E14.5 embryons, puis son diplôme à l'heure, les âges embryonnaires plus difficiles. Dans notre expérience, l'expression de GFP est visible sous lumière UV déjà 24 heures après transfection. Après E12.5 transfection, expression de la GFP sur -18,5 est très forte. Nous avons électroporation à E12.5, E13.5, E14.5, E15.5 et E17.5 et analysées à, -18,5, P0 et P1 être capable de trouver l'expression du journaliste fort dans tous les cas. Lorsque des embryons dont les cerveaux ont été transfectées in utero sont autorisés à rejoindre terme (pour la collecte des données postnatal), parfois ils sont sélectivement mangés par la mère. Cela suggère des changements subtils dans l'apparence ou le comportement chiot induits par la manipulation du cerveau (leur températureture pourrait être plus faible, ou peut-être qu'ils n'émettent pas de signaux sonores à droite). Chez les animaux qui survivent après la naissance abattage maternelle, nous avons observé l'expression du journaliste jusqu'à P1 au moins. Rapports dans le show expression de la littérature de constructions transfectées même quatre mois après la naissance 10.
Vecteurs pour l'électroporation: Nous utilisons bicistroniques plasmides rapporteurs commandée par le promoteur CAG 39, suivie par l'ADNc du gène d'intérêt, séparés par un site d'entrée interne des ribosomes (IRES) 40, à partir de l'ADNc d'un rapporteur fluorescent, par exemple l'amélioration la protéine fluorescente verte 41. Le promoteur CAG est si forte dans les neurones qu'il peut produire des niveaux d'ADN trop élevée pour les cellules transfectées, de les tuer. Bien que nous ayons jamais observé une apoptose massive après la transfection, une solution possible, si le problème apparaît, serait l'utilisation d'un promoteur moins efficace, comme l'EF1 alpha 42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation allemande pour la recherche (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
