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Biology

इमेजिंग और भ्रूणीय Zebrafish में cerebrovascular संरचनाएं की 3 डी पुनर्निर्माण

Published: April 22, 2014 doi: 10.3791/50417
Automatic Translation
1,2,3, 1,4
1Molecular Neurobiology, Western University of Health Sciences, 2Graduate College of Biomedical Sciences, Western University of Health Sciences, 3College of Osteopathic Medicine of the Pacific, Western University of Health Sciences, 4College of Optometry, Western University of Health Sciences

Summary

लार्वा zebrafish में प्रमस्तिष्कवाहिकीय विकास की इमेजिंग वर्णित है. 3 डी इमेजिंग की सुविधा और रासायनिक उपचार का उपयोग प्रमस्तिष्कवाहिकीय विकास को संशोधित करने के लिए तकनीक भी उपलब्ध कराए गए हैं.

Abstract

Zebrafish विवो में विकासात्मक जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. छोटे आकार और zebrafish भ्रूण के रिश्तेदार पारदर्शिता जैसे हृदय और संवहनी विकास के रूप में प्रक्रियाओं के दृश्य परीक्षा के लिए उन्हें विशेष रूप से उपयोगी है. कई हाल ही के अध्ययन में संवहनी endothelial कोशिकाओं में EGFP व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish छवि का इस्तेमाल किया गया और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, मस्तिष्क और रेटिना में जटिल संवहनी नेटवर्क का विश्लेषण. वर्णन, तैयार इलाज के लिए और छवि बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) व्यक्त कि zebrafish भ्रूण, और फिर प्रमस्तिष्कवाहिकीय प्रणाली की व्यापक 3 डी renderings उत्पन्न करने के लिए प्रदान की जाती हैं. प्रोटोकॉल भ्रूण के उपचार, confocal इमेजिंग, और EGFP प्रतिदीप्ति संरक्षित है कि निर्धारण प्रोटोकॉल में शामिल हैं. इसके अलावा, इस तरह के हानिकारक पास तंत्रिका ऊतक के बिना हटाने आंख के रूप में प्रमस्तिष्कवाहिकीय संरचनाओं के उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने पर उपयोगी सुझाव प्रदान की जाती हैं. संभावित नुकसानconfocal इमेजिंग के साथ स्वतंत्र रूप से उपलब्ध खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर confocal छवि के ढेर से 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम के साथ साथ चर्चा कर रहे हैं.

Introduction

Zebrafish विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करते हैं, और उनके भ्रूण के रिश्तेदार पारदर्शिता इमेजिंग आधारित अध्ययन 1 के लिए उत्तरदायी है. zebrafish अब दशकों के लिए हड्डीवाला विकास के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. Zebrafish सहित teleosts, अकशेरूकीय में कोई उचित Homolog है कि एक सरलीकृत हड्डीवाला नाड़ी तंत्र है. खून oxygenated है जहां गहरे नाले के माध्यम से एक दो संभाग दिल की पूर्वकाल कक्ष से पंप है. गहरे नाले से रक्त पृष्ठीय महाधमनी पर converges और कहा कि छोटे और छोटे जहाजों में शाखा धमनियों, अंग के ऊतकों में अंततः तक पहुँचने केशिकाओं से होकर गुजरता है. केशिकाओं ऑक्सीजन के भीतर जारी है और कार्बन डाइऑक्साइड अवशोषित कर लेता है. केशिकाओं की शिरापरक तरफ खून बड़ा और बड़ा रगों में बहती है और अंत में चक्र को दोहराता है, जहां दिल के पीछे कक्ष में तैयार की है.

एक वयस्क zebrafish एक समय में 200 या उससे अधिक अंडे देना, और ONC कर सकते हैंई निषेचित, वे जल्दी से 2 का विकास. एक दिन के भीतर शरीर अक्ष में अच्छी तरह से कोरियोनिक झिल्ली के अंदर चारों ओर भ्रूण कदम है कि अनुबंध और मांसपेशियों सहित विकसित कर रहा है. 2-7 दिनों से पोस्ट निषेचन (DPF) सबसे शरीर प्रणालियों आँखें और भोजन की ओर या दूर चमकदार रोशनी से तैराकी समन्वय कर सकते हैं कि एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सहित, विकास. ऊपर से 7 DPF भ्रूण माइक्रोस्कोपी के साथ दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए काफी छोटे हैं. फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक लाइनों confocal या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया जा सकता है. Confocal इमेजिंग संवहनी विकास का एक सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण प्रदान करते हैं कि zebrafish भ्रूण में पूरा संवहनी संरचनाओं के 3 डी renderings बनाने के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर 3 के साथ जोड़ा जा सकता है. यह संवहनी नेटवर्क 4,5 के एक सिस्टम स्तर के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के रूप में संवहनी और cerebrovascular जटिलता में परिवर्तन के साथ संबंध अध्ययन इस प्रोटोकॉल से लाभ होगा. तरीकों और संसाधनों का एक संकलन प्रदान कर रहे हैंभ्रूण zebrafish में संवहनी संरचनाओं के इमेजिंग की आवश्यकता है कि अध्ययन के लिए आसान गोद लेने के लिए और इन तकनीकों की अनुमति देने के लिए डी. एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish की लागत दक्षता हड्डीवाला विकास और homeostasis में आणविक मार्ग की वाहिकाजनक प्रभाव का आकलन करने के साथ जो नए प्लेटफार्म प्रदान करने के लिए उभरती प्रौद्योगिकियों इमेजिंग के साथ संयोजन है.

Protocol

1. Zebrafish पशुपालन, भ्रूण पीढ़ी है, और उपचार

  1. एक संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के मार्गदर्शन में और एनआईएच या अन्य नियामक निकायों / दिशानिर्देशों के जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के भीतर निम्नलिखित zebrafish प्रोटोकॉल का संचालन.
  2. विशिष्ट ऊतकों, कोशिकाओं, या अंगों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि zebrafish उपभेदों Zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र (Zirc) से उपलब्ध हैं. उदाहरण के लिए, टीजी (KDR: EGPF) इस प्रोटोकॉल के रूप में दिखाया पूर्ण 3 डी संवहनी संरचनाओं का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो संवहनी endothelial कोशिकाओं 6, में EGFP व्यक्त s843. ट्रांसजेनिक zebrafish के अन्य लाइनों Zirc से उपलब्ध हैं.
  3. पीएच, लवणता, तापमान, भंग ऑक्सीजन, प्रकाश, और अन्य पर्यावरणीय कारकों 7 पर नज़र रखता है कि एक उचित जल कृषि प्रणाली में सदन वयस्क zebrafish. यहाँ दिखाए गए zebrafish एक 14 घंटे lig के साथ 28.5 डिग्री सेल्सियस पर एक Aquaneering इंक प्रणाली (सैन डिएगो, सीए) में रखे थेht/10 घंटे अंधेरे चक्र. वयस्क zebrafish नमकीन चिंराट और NRD 4/6 मछली खाना (नमकीन चिंराट सीधी, ओगडेन, यूटा) के एक संतुलित आहार फ़ीड.
  4. वयस्क पुरुष और प्रजनन आयु की महिला zebrafish संभोग सफल बढ़ाने के लिए अलग से रखा जाना चाहिए.
  5. साथ में अंडे के माध्यम से गिर करने के लिए काफी बड़ा छेद के साथ एक जाल नीचे है कि एक संभोग कंटेनर में महिलाओं (2-4) और पुरुषों (4-6) रखकर अंडे बिछाने और निषेचन उत्तेजित है, लेकिन बहुत छोटा zebrafish वयस्कों पारित करने के लिए . इससे पहले शाम matings स्थापित; अंडे दिन प्रकाश चक्र धीरे धीरे तीव्रता (डॉन) में बढ़ जाती है आमतौर पर है, जबकि सुबह के पास रखी हैं. संभोग कंटेनर के नीचे हर 15-30 मिनट पर अंडे के लिए जाँच करें.
  6. E3 बफर (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी MgSO 4) के साथ एक जाल झरनी और स्वच्छ का उपयोग अंडे ले लीजिए. एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में E3 बफर और दुकान से भर में 100 मिमी संस्कृति प्लेटों के लिए अंडे स्थानांतरण.
  7. प्रमाणपत्र को बदलने वाले रसायनों का अध्ययन करने के लिएebrovascular वांछित रासायनिक सांद्रता जोड़ने शाखाओं में बंटी. उदाहरण के लिए neovasular शाखाओं में 24 शुरुआत γ-secretase अवरोध करनेवाला DMSO 4 में solubilized (जीएसआई IX/DAPT/N- [एन (3,5-Difluorophenacetyl एल alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl एस्टर), के साथ प्रेरित किया जा सकता है घंटे के बाद निषेचन (HPF). उस समय सूत्री भ्रूण में जरायु के भीतर अभी भी कर रहे हैं, और कई रसायनों यह 8 के माध्यम से पारित कर सकते हैं. एक इलाज हालत जरायु से मुक्त तोड़ने के लिए भ्रूण की क्षमता क्षीण हो सकता है कि तंत्रिका या मोटर असर पड़ता है, तो भ्रूण pronase 2 के दोनों संदंश के साथ किया जा सकता है, जो 24 और 48 HPF के बीच de-chorionated किया जाना चाहिए. प्रदान की चित्र में दिखाया भ्रूण धीरे दो तीव्रता संदंश के साथ जरायु हथियाने और इसे खुला फाड़ द्वारा dechorionated गया.
  8. यदि आवश्यक हो / वांछित, वर्णक गठन 24 HPF पर E3 बफर करने के लिए 0.003% एन Phenylthiourea (पी टी यू) जोड़कर हिचकते जा सकता है.

Cerebrovascular struct की 2. Confocal इमेजिंगनिश्चित zebrafish भ्रूण में ures

  1. 250 मिलीग्राम / एल Tricaine methanesulfonate में भ्रूण त्याग, और फिर 2 में विसर्जन से उन्हें ठीक - 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 4% paraformaldehyde फ्लोरोसेंट भ्रूण के साथ कंटेनर पन्नी में लपेटा जाना चाहिए. Imaged जब तक एक बार तय, भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहित किया जाना चाहिए - EGFP प्रतिदीप्ति तीव्रता के बारे में एक सप्ताह के बाद कम से हल हो जाता है, लेकिन आकारिकी (उज्ज्वल क्षेत्र में देखा के रूप में) बहुत लंबे समय तक सुरक्षित रहता है.
  2. पहले एक तेज टंगस्टन सुई का उपयोग कर एक आंख निकाल कर भ्रूण माउंट करने के लिए तैयार करते हैं. आँख जोड़ने ऊतक आसपास कटौती पहले तो मांसपेशियों में कटौती, और अंत में आंख को विस्थापित करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका में कटौती. (नोट: दोनों पक्षों इमेजिंग वांछित है हटायें दोनों आँखें.)
  3. आंख निकाले जाने के बाद, 3% methylcellulose की एक बूंद का उपयोग कर एक coverglass पर भ्रूण माउंट. हटाया आंख के साथ कंधे coverglass सामना करना पड़ रहा है और संभव के रूप में कांच के करीब है इतना है कि भ्रूण पूरबी. बहुत से कार्बनिक योगिकों का आधार के साथ पूरे भ्रूण आवरणइमेजिंग के दौरान सुखाना को रोकने के लिए lcellulose.
  4. छवि तुरंत एक उच्च गुणवत्ता 20x प्लान ए पी ओ उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = 0.75 या बेहतर) के साथ सुसज्जित एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग घुड़सवार भ्रूण. यह विन्यास दो गिलास विमानों के बीच भ्रूण sandwiching, और ऊपर कांच के खिलाफ भ्रूण दबाने की आवश्यकता होगी कि एक गैर उलटा माइक्रोस्कोप के लिए बेहतर है.
  5. एक मध्यम या बड़े एपर्चर सेटिंग का उपयोग 1 माइक्रोन वेतन वृद्धि में ऑप्टिकल स्लाइस लीजिए. 2.5 माइक्रोन का बड़ा कदम भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह छोटी वस्तुओं के स्थानिक क्रम निर्धारित करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है. छोटे apertures तेज विस्तार उपज है, लेकिन आवश्यक अब स्कैन EGFP ब्लीच और भी प्राप्त किया जा सकता है कि भ्रूण में इमेजिंग की गहराई सीमित कर सकता है. एक confocal खुर्दबीन के एक भ्रूण के माध्यम से आधे रास्ते के बारे में इमेजिंग के लिए अनुमति देता है.
  6. पूरे मछली की इमेजिंग वांछित है, (3.2 कदम में नोट देखें) शुरू में दोनों आँखें निकाल, कल्पना के बाद भ्रूण बारी बारीविपरीत पक्ष के लिए 2.5 - जी एक तरफ और दोहराने 2.3 दोहराएँ.

भ्रूणीय Zebrafish Cerebrovasculature की 3. 3 डी पुनर्निर्माण

  1. नि: शुल्क, 3 डी renderings के लिए अनुकूलित किया है, और पीसी, मैक और लिनक्स कंप्यूटर के साथ संगत है जो खुले स्रोत ImageJ की फिजी वितरण 3 (http://fiji.sc), का प्रयोग करें.
  2. प्लगइन्स> loci> BioFormats आयातक 9 तब, Nikon के ढेर (2A चित्रा) के लिए जैसे name.ids confocal फ़ाइल का चयन करने के लिए जा रहा द्वारा फिजी के लिए आयात confocal ढेर. विभाजित चैनलों की जांच, लपेटकर जाँच, स्केल: Hyperstack, रंग मोड के साथ दृश्य ढेर का चयन करें.
  3. ये चयन चार अलग चैनल पैनल खुल जाएगा; EGFP के लिए केवल एक ही है, आमतौर पर तीसरे एक नीचे की जरूरत होगी. सी = 1 (2A चित्रा) के बाद एक लंबे नाम के साथ 16 बिट छवि छोड़ने अन्य तीन पैनलों (लाल, नीला और अल्फा) बंद.
  4. छवि स्क्रॉल प्रादेशिक सेना का उपयोग हालांकि स्कैनिंग द्वारा सीमा समायोजित करेंबी ब्याज के क्षेत्र या संरचना है कि एक टुकड़ा खोजने के लिए नीचे के साथ, तो (चित्रा -2)> दहलीज समायोजित> छवि के लिए जाने.
  5. ऊपर आता है कि पैनल में, संरचना की पृष्ठभूमि पर काफी अच्छी तरह से देखा जा सकता है कि इतने बाईं ओर ऊपर पट्टी (काले स्तर) स्लाइड, और यह (चित्रा 2 डी) है जहां नीचे स्लाइड (सफेद स्तर) छोड़ दें. बी और डब्ल्यू का चयन करें, डार्क पृष्ठभूमि का चयन करें. विभिन्न समायोजन प्रत्येक टुकड़ा के लिए, काले रंग की पृष्ठभूमि का चयन आवश्यक हैं जब तक प्रत्येक छवि के लिए गणना थ्रेसहोल्ड का चयन न करें. इस प्रक्रिया को एक नया 8 बिट छवि बनाता है.
  6. चेतावनी: थ्रेसहोल्ड पूर्ववत या बचाया ImageJ में, तो confocal ढेर एक बदलाव की जरूरत है हर बार पुनः लोड करना होगा नहीं किया जा सकता. संख्या लिख ​​लें और वांछित परिणाम हासिल की है जब तक अलग सेटिंग्स की कोशिश.
  7. कारक 1 (सर्वोत्तम) या 2 (अच्छा) resampling, प्लगइन्स> 3D व्यूअर> थ्रेसहोल्ड 0 के पास जाओ, एक हरे रंग की 3 डी उत्पादन बनाने के लिए लाल और नीले रंग बक्से अचयनित - अन्यथा यह वाईकरूँगा एक सफेद प्रतिपादन उत्पादन - (नहीं ऑटो) (चित्रा 2 ई) लागू करें का चयन करें.
  8. , घुमाएँ स्पिन और माउस और कीबोर्ड नियंत्रण (चित्रा 2 एफ) का उपयोग कर 3 डी छवि ज़ूम.
  9. मेनू में कब्जा विकल्प का उपयोग कर किसी भी बिंदु पर अभी भी छवियों को बचाओ. स्क्रीन पर छवि बॉक्स के आकार का उत्पादन छवि के पिक्सेल आयाम पैदा करती है, तो एक उच्च संकल्प छवि बनाने के ठीक नीचे कोने खींचकर बॉक्स बड़ा वांछित है.
  10. देखें> रिकॉर्ड 360 डिग्री रोटेशन (चित्रा 2 जी) का चयन करके एक कताई 3 डी फिल्म बनाएं. कदम के अनुसार 2 डिग्री रोटेशन चूक, लेकिन यह बहुत छोटे फ़ाइल आकार बनाएगा जो उदाहरण के लिए 5 डिग्री, बदला जा सकता है, लेकिन एनीमेशन को झटका जोड़ सकते हैं.
  11. बाद में, मीडिया खिलाड़ियों के साथ देखने के लिए इंटरनेट पर अपलोड करने, या प्रस्तुतियों में उपयोग करने के लिए कई उपलब्ध स्वरूपों में से एक में फ़ाइल सहेजें. खुला स्रोत मीडिया प्लेयर, वीएलसी ( HT) :/ / www.videolan.org / VLC / index.html टी.पी., नि: शुल्क है और बहुत अच्छी तरह से इन वीडियो संभालती है.

Representative Results

संवहनी संरचनाओं के 3D पुनर्निर्माण zebrafish विकास के लिए एक व्यापक और नेत्रहीन दिलचस्प परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है. वे आम तौर पर किया के रूप में 1 और 2 शो तरीकों रु. चित्रा 3 endothelial कोशिकाओं में EGFP व्यक्त कि zebrafish भ्रूण DPF एक 6 में संवहनी संरचनाओं के कई कोणों से पता चलता है. एक ठोस हरे या सफेद रंग के साथ यह संकेत तीव्रता की सराहना करने के लिए मुश्किल हो सकता है; छद्म रंग एक नज़र ऊपर तालिका से छवि तीव्रता प्रदान करने और संरचनाओं ओवरलैप जब बेहतर गहराई धारणा की अनुमति देता है. में vasculature की एक छद्म रंग 3 डी छवि का एक उदाहरण एक 6 zebrafish 4 चित्र में प्रदान की जाती है DPF. लाइव भ्रूण की प्रतिदीप्ति इमेजिंग आंख और शरीर आंदोलन भी शामिल है कि शारीरिक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और हृदय की गतिविधि. 3 और 4 आंकड़े ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन का उपयोग कर, इन तरीकों के साथ प्राप्त की प्रतिनिधि परिणाम दिखाने वर्णित. इमेजिंग संकल्प माइक्रोस्कोप विशेषताओं पर निर्भर करता है, लेकिन EGFP संकेत की चमक सबसे वाणिज्यिक प्रणालियों के साथ अच्छी छवि गुणवत्ता के लिए पर्याप्त है. 3 डी निरूपण के पुनर्निर्माण और प्रतिपादन अनुरूप है और यह खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के अंदर विकल्प लगातार अच्छे परिणाम प्रदान करते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. आँख हटाने. ए) एक टंगस्टन जरूरत के साथ एक निश्चित 3 DPF भ्रूण आंख के बगल में तैनात. ऊतक) इस स्थिति. बी से आंख के आसपास कट जाता है आँख है टूट जाता है और अंतर्निहित आंख की मांसपेशियों और ऑप्टिक तंत्रिका में कटौती कर रहे हैं. खाली थैली धराशायी चक्र के साथ संकेत दिया है. सी) एक ही भ्रूण खत्म कर दिया और मिथाइल सेलूलोज के साथ मुहिम शुरू की है, ऊपर का सामना करना पड़ बरकरार आँख के साथ. hres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. कदम दर कदम एक confocal छवि ढेर के 3D पुनर्निर्माण. ए) हित के क्षेत्र के साथ एक टुकड़ा खोजने के बाद. बी) का चयन करने के लिए प्लगइन्स> loci> Bioformat का उपयोग फिजी भीतर भरी हुई खोलें (4104.1.ids), सीमा समायोजन दिखाया. सी) के रूप में चयन किया गया है थ्रेसहोल्ड शीर्ष का उपयोग कर 214 करने के लिए निकाला जाता है स्लाइडर और लागू चयनित है. के रूप में दिखाया डी) 3D व्यूअर कहा जाता है. ई) 3 डी पुनर्निर्माण उन्मुखीकरण के लिए बरकरार आँख के साथ एक zebrafish,. एफ) छवि तेजी से बढ़ी और. जी) एक 360 डिग्री रोटेशन फिल्म घुमाया गया है की दिखाया गया है पता चला के रूप में बनाया जाता है. res.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. 3 डी पुनर्निर्माण से परिप्रेक्ष्य. ए) 10x उद्देश्य के साथ imaged 6 DPF भ्रूण की औसत दर्जे परिप्रेक्ष्य, मुंह पर सही है, मुंह के अंदर नहीं गहरे नाले. बी एक ही भ्रूण की) लेटरल, नोट फिन बीच में एक पाश है. 20x उद्देश्य के साथ imaged सी) समान भ्रूण, 20x उद्देश्य इमेजिंग की औसत दर्जे का परिप्रेक्ष्य, नोट गिल संकल्प. डी) लेटरल परिप्रेक्ष्य. फिन पैनल के ठीक किनारे पर है. 20x उद्देश्य इमेजिंग की ई) Antero औसत दर्जे देखें, सही करने के लिए एक 20x उद्देश्य, सिर इसके साथ imaged एक ही भ्रूण के मुंह के अंदर नोट गहरे नाले. एफ) पेट. नीचे सही पर जर्दी थैली पर वाहिका संरचना पर ध्यान दें.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
संकेत तीव्रता के लिए एक pseudocolor देखो सारणी का उपयोग कर एक 6 DPF पुनर्निर्माण के 6 DPF भ्रूण में चित्रा 4. तीव्रता मतभेद. छवि. मुंह, मस्तिष्क, गहरे नाले और जर्दी थैली उन्मुखीकरण के लिए चिह्नित कर रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
एक 4 DPF zebrafish में खंगाला नाड़ी तंत्र की चित्रा 5. मूवी. मछली 2.5 माइक्रोन में उतारी थी. छवियों थेभ्रूण में से एक आधा इमेजिंग से. चित्रा 6 में प्रदान की एक जीएसआई इलाज zebrafish में संरचनाओं के साथ संवहनी संरचनाओं तुलना कर लें. सिर में रक्त वाहिकाओं के कम घनत्व और बड़े गहरे नाले नोट. (डाउनलोड तहत "Zfish_spin.avi" पूरक फाइल देखें)

चित्रा 6
चित्रा 6. 4 DPF पर एक जीएसआई का इलाज भ्रूण में नाड़ी तंत्र की 3 डी मूवी. मछली midline के पार्श्व से के माध्यम से 2.5 माइक्रोन में उतारी थी. चित्रा 5 में दिखाया मछली DPF नियंत्रण 4 के साथ संवहनी संरचनाओं की तुलना करें. धनुषाकार पीठ और छोटे आकार के इस रसायन के साथ इलाज भ्रूण में विशिष्ट हैं. (डाउनलोड तहत "जीएसआई-treated_4dpf_fish.avi" पूरक फाइल देखें)

Discussion

यहाँ वर्णित विधि zebrafish विकसित करने में नाड़ी तंत्र के दृश्य के अध्ययन के लिए एक आधार प्रदान करते हैं. तय नमूने उच्च संकल्प confocal इमेजिंग. ड्रोसोफिला और सी. के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लाइव नमूनों, इस तरह के हृदय की दर और दिल स्ट्रोक मात्रा के रूप में शारीरिक मापदंड, का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एलिगेंस पूरे शरीर इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन zebrafish रीढ़ हैं और एक endothelial सेल लाइन नाड़ी तंत्र सहित हड्डीवाला ऊतकों के लिए एक उपयोगी मॉडल, प्रदान करते हैं. इन अध्ययनों zebrafish अनुसंधान समुदाय से महत्वपूर्ण ट्रांसजेनिक लाइनों और जीनोमिक संसाधनों को शामिल कर सकते हैं. 3D पुनर्निर्माण और भ्रूण zebrafish से confocal छवियों का प्रतिपादन, यहाँ वर्णित है, संवहनी शाखाओं में बंटी और इस तरह के चूहों और चूहों के रूप में बड़ा पशु मॉडलों के साथ संभव नहीं है कि रक्त वाहिका घनत्व के लिए एक सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, zebrafish एक परिवर्तनीय पर्यावरण (E3 बफर) में विकसित अम्निओट जीवों के रूप में, जहां एक बड़ी आसानी से सी जोड़ सकते हैंसंवहनी विकास को प्रभावित करने वाले विशिष्ट एंजाइमों या अन्य प्रक्रियाओं को बाधित कि hemicals. रासायनिक वितरण की एकाग्रता और समय शोधकर्ता को ठीक धुन उपचार शर्तों को सक्षम करने, बदला जा सकता है.

1. संशोधन और निवारण

इस प्रणाली के लिए संशोधन ऊतक, अंग या क्षेत्र विशेष पैटर्न 10 की एक किस्म में EGFP या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि zebrafish के ट्रांसजेनिक लाइनों को शामिल कर सकते हैं. इसके अलावा, zebrafish रेटिना में neovascular परिवर्तन का विश्लेषण हाल ही में 5 प्रकाशित किया गया है. पुराने भ्रूण और वयस्क zebrafish में रंजकता के साथ कोई समस्या पैमाने पिगमेंट या रेटिना वर्णक उपज नहीं है कि ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ पार करके मुआवजा दिया जा सकता है. कम प्रतिदीप्ति के साथ कोई समस्या आम तौर पर अनुचित निर्धारण की स्थिति से परिणाम. 1 दिन के लिए paraformaldehyde (4%) इष्टतम है, लेकिन इस तरह के glutaraldehyde, आज़मियम tetroxide या शराब के रूप में मजबूत fixatives मईEGFP प्रतिदीप्ति नष्ट. निर्धारण के बाद, भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रखा जाना चाहिए और हमेशा सीधे धूप से रक्षा की.

इस तकनीक के 2. सीमाएं

इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पादन 3 डी renderings की गुणवत्ता और संकल्प उत्पन्न छवियों की गुणवत्ता पर निर्भर करती है. इन भ्रूण के माध्यम से प्रकाश पैठ एक मानक confocal खुर्दबीन का उपयोग मध्य बाण के समान विमान तक सीमित है. इमेजिंग के इस पहलू पुराने भ्रूण और वयस्कों में इमेजिंग की गहराई सीमा है, लेकिन और अधिक उन्नत बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी प्रणाली अधिक से अधिक गहराई में इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं.

मौजूदा तरीकों के संबंध में 3. महत्व

इस प्रोटोकॉल एक संपूर्ण जानवर शामिल कर सकते हैं कि एक सिस्टम स्तर पर रक्त वाहिका नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है. इस तरह के डेटा की इससे पहले अभ्यावेदन अक्सर एक साथ बाहर रखी छवियों की श्रृंखला पर भरोसा किया, लेकिन 3 डी प्रतिपादन स्थानिक असली का बेहतर समाधान प्रदान करता हैशामिल tionships.

4. भविष्य अनुप्रयोगों

इमेजिंग और ऊतक प्रसंस्करण में नई घटनाओं पुराने भ्रूण या वयस्कों पारदर्शी 11-14 बनाने शामिल हो सकते हैं कि इन तरीकों के लिए कई नए अनुप्रयोगों प्रदान करेगा. बढ़ी पारदर्शिता बहुत confocal और बहु - फोटोन पराबैंगनीकिरण से ऊतक प्रवेश में वृद्धि होगी. इसके अलावा, कैमरों और photomultiplier ट्यूब की गति के रूप में यह जल्द ही विश्लेषण का एक 4 वें आयाम प्रदान करने, वास्तविक समय में मछली की 3 डी renderings का उत्पादन संभव हो सकता है वृद्धि हुई है.

5. महत्वपूर्ण कदम

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम उचित निर्धारण भी शामिल है जो इमेजिंग, के लिए तैयारी है. इमेजिंग उपलब्ध सर्वश्रेष्ठ संख्यात्मक apertures है कि उच्च गुणवत्ता के उद्देश्यों के साथ निर्धारण के बाद जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए. रिजोल्यूशन इमेजिंग प्रणाली पर निर्भर करता है, ताकि उच्च गुणवत्ता प्रणाली आम तौर पर बेहतर कर रहे हैं. 3 डी renderings सृजन स्मृति गहन हैस्मृति और अच्छा ग्राफिक्स प्रोसेसर की एक बड़ी राशि के साथ तो नए, उच्च अंत कंप्यूटर के लिए सिफारिश कर रहे हैं.

इन तरीकों न्यूरॉन्स, मांसपेशियों, ग्रंथियों या के किसी भी संख्या की आबादी में, GFP, या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक भ्रूण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि यहां वर्णित दृश्य जीव विज्ञान प्रणाली, संवहनी endothelial कोशिकाओं में EGFP व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish के लिए अनुकूलित किया गया है अन्य कोशिकाओं. इस प्रणाली के साथ काम करने में बड़ा लाभ यह निश्चित और / या जीवित पशुओं में, यह विकास की अवधि के दौरान किसी भी समय पूरे भ्रूण में क्या हो रहा है अध्ययन करने की क्षमता है.

Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों इन तकनीकों का विकास में मदद की जो हमारी प्रयोगशालाओं के अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद. आंशिक धन पुनर्योजी चिकित्सा / सीआईआरएम (RN1-00538) के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा डे के लिए प्रदान की है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N – Phenylthiourea  Alfa Aesar, catalog #41972 0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C
E3 buffer Sigma 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Confocal microscope  Nikon D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U
Glass bottom dishes Mat-Tek
GSI IX/DAPT N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences
24 well plates  Becton-Dickinson, cat# 351147 BD Falcon
Transfer pipettes  VWR, cat #414004-001 VWR disposable transfer pipettes
Methyl-cellulose  Alfa Aesar, cat#43146 3% in E3 buffer
NRD 4/6 Fish food  Brine Shrimp Direct Dried
Brine shrimp Brine Shrimp Direct Live
Tungsten wire  Small Parts # TW-016-60 0.016” OD
Tricaine VWR # 101107-950 Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकास जीवविज्ञान अंक 86 zebrafish cerebrovascular विकास इमेजिंग 3 डी भ्रूण confocal मस्तिष्क
इमेजिंग और भ्रूणीय Zebrafish में cerebrovascular संरचनाएं की 3 डी पुनर्निर्माण
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Ethell, D. W., Cameron, D. J.… More

Ethell, D. W., Cameron, D. J. Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (86), e50417, doi:10.3791/50417 (2014).

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