Bildebehandling og 3D Rekonstruksjon av cerebrovaskulære Structures i Embryonale Sebrafisk

Summary

Imaging av cerebrovaskulær utvikling i larvesebrafisk er beskrevet. Teknikker for å lette 3D avbildning og endre cerebrovaskulær utvikling ved hjelp av kjemiske behandlinger tilbys også.

Abstract

Sebrafisk er et kraftig verktøy for å studere utviklingsbiologi og sykdomslære in vivo. Den lille størrelse og relative åpenhet av sebrafisk embryoer gjør dem særlig anvendelige for visuell undersøkelse av prosesser slik som hjerte-og vaskulære utvikling. På flere nyere studier transgen sebrafisk som uttrykker EGFP i vaskulære endoteliale celler ble brukt til å analysere bildet og komplekse vaskulære nettverk i hjernen og netthinnen, ved hjelp av konfokal mikroskopi. Beskrivelser er gitt for å forberede, behandle og bilde sebrafisk embryo som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), og deretter generere omfattende 3D-gjengivelser av cerebrovaskulær system. Protokoller inkluderer behandling av embryoer, confocal bildebehandling, og festeprotokoller som bevarer EGFP fluorescens. Videre er nyttige tips om å skaffe bilder av høy kvalitet av cerebrovaskulære strukturer, som for eksempel fjerning av øyet uten å skade nærliggende nevrale vev gitt. Potensielle fallgruvermed confocal bildebehandling blir diskutert, sammen med de nødvendige skritt for å generere 3D rekonstruksjoner fra confocal bildestakker bruker fritt tilgjengelig programvare med åpen kildekode.

Introduction

Sebrafisk gi et kraftig system for å studere utviklingsbiologi, og den relative åpenhet av sine befruktede egg er mottagelig for bildebaserte studier ^en. Sebrafisk har nå blitt brukt som modell for virveldyr utvikling i flere tiår. Teleoster, inkludert sebrafisk, har et forenklet virveldyr karsystemet som ikke har noen rimelig homolog hos invertebrater. Blodet pumpes fra det fremre kammer i en to-kammer hjerte gjennom gjellene, hvor den oksygenerte. Blod fra gjellene konvergerer på dorsal aorta og går gjennom arterier som gren i mindre og mindre fartøy, til slutt nådde kapillærer i orgel vev. Innenfor kapillarer oksygen frigjøres og karbondioksyd er absorbert. På den venøse siden av kapillærene strømmer blod inn i større og større årer, og endelig er trukket inn i det bakre kammer av hjertet, hvor syklusen gjentas.

En voksen sebrafisk kan legge 200 eller flere egg om gangen, og once befruktet, utvikler de fort ^to. Innen en dag kroppen aksen er godt utviklet, inkludert muskler som kontrakten og flytte embryoet rundt inne i chorionic membran. Fra 2-7 dager etter befruktning (DPF) de fleste kroppens systemer utvikles, inkludert øyne og et sentralnervesystem som kan koordinere svømming mot mat eller bort fra sterkt lys. Opp til 7 DPF embryoer er små nok til å tillate visualisering med mikroskopi. Transgene linjer som uttrykker fluorescerende proteiner kan avbildes med confocal eller fluorescens mikroskopi. Confocal bildebehandling kan pares med åpen-kildekode ^tre for å lage 3D-gjengivelser av komplette vaskulære strukturer i sebrafisk embryo som gir en systembiologi perspektiv av vaskulær utvikling. Studier som er opptatt av endringer i vaskulær og cerebrovaskulær kompleksitet vil ha nytte av denne protokollen som gjør det mulig for et system nivå analyse av vaskulære nettverk ^4,5. En sammenstilling av metoder og ressurser er å gid for å tillate for enkel adopsjon og av disse teknikkene for studier som krever avbildning av vaskulære strukturer i embryonale sebrafisk. Kostnadseffektivitet av sebrafisk som en dyremodell er å kombinere med nye bildeteknologier for å gi nye plattformer med å vurdere angiogenetiske effekter av molekylære stier i virveldyr utvikling og homeostase.

Protocol

En. Sebrafisk Husbandry, Embryo generasjon, og behandling

1. Gjennomføre følgende sebrafisk protokoller under veiledning av en institusjonell dyr omsorg og bruk komité (IACUC) og innenfor retningslinjene for NIH eller andre regulerende myndigheter / retningslinjer dyr omsorg.
2. Sebrafisk stammer som uttrykker fluorescerende proteiner i bestemte vev, celler eller organer er tilgjengelige fra sebrafisk International Resource Center (zi). For eksempel Tg (KDR: EGPF) s843 uttrykker EGFP i vaskulære endotelceller ^6, som kan brukes til å produsere komplette 3D vaskulære strukturer som vist i denne protokollen. Andre linjer av transgen sebrafisk er tilgjengelig fra Zirc.
3. Hus voksen sebrafisk i en passende akvakultur system som overvåker pH, saltholdighet, temperatur, oksygen, lys, og andre miljøfaktorer ^7. Sebrafisk vist her ble plassert i en Aquaneering Inc. system (San Diego, CA) ved 28,5 ° C med en 14 timers LIGht/10 timers mørke syklus. Strøm voksen sebrafisk en balansert diett av saltlake reker og NRD 4/6 for fisk (Brine Shrimp Direct, Ogden, Utah).
4. Voksen hann og hunn sebrafisk av avl alder bør bli plassert separat for å øke parring vellykket.
5. Stimulere egglegging og befruktning ved å plassere kvinner (2-4) og menn (4-6) sammen i en parring beholder som har en maske bunn med hull store nok for eggene å falle gjennom, men for liten for de sebrafisk voksne til å passere . Sett opp parr kvelden før; Eggene legges i nærheten av daggry, vanligvis mens dagtid lys syklus øker sakte i intensitet (daggry). Kontroller for eggene ved bunnen av parings beholderen hver 15-30 minutter.
6. Samle egg ved hjelp av en sil og ren med E3 buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 mM _MgSo4). Overfør eggene til 100 mm petriskåler fylt med E3 buffer og oppbevar i en 28 ° C inkubator.
7. Å studere kjemikalier som endrer visseebrovascular forgrening legge til de ønskede kjemiske konsentrasjoner. For eksempel neovasular forgrening kan induseres med γ-sekretase inhibitor (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester) oppløseliggjort i DMSO ^{til 4,} starter 24 timer etter befruktning (HPF). På den tiden-punkts embryoer er fortsatt innenfor chorion, og mange kjemikalier kan passere gjennom den ^åtte. Hvis en behandling tilstand har nevrale eller motoreffekter som kan svekke evnen til embryo for å bryte fri fra chorion, da embryo skal bli de-chorionated mellom 24 og 48 HPF, som kan gjøres enten med pinsett av pronase ^to. Embryoer som vises i bildene gitt ble dechorionated ved å forsiktig ta tak i chorion med to skjerpet tang og rive den åpen.
8. Hvis det er nødvendig / ønskelig pigment dannelse kan hemmes ved tilsetning av 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) til E3 buffer ved 24 HPF.

2. Confocal Imaging av Cerebrovaskulær Structtiltak i Fixed sebrafisk embryo

1. Sacrifice embryoer i 250 mg / L Tricaine metansulfonatet, og deretter fikse dem ved nedsenkning i 2 - 4% paraformaldehyde natten ved 4 ° C. Beholdere med fluorescerende embryo bør pakkes i folie. Når fast, bør embryoer lagres i PBS ved 4 ° C inntil avbildes - EGFP fluorescens intensiteten blir mindre løst etter ca en uke, men morfologi (som vist i lyse feltet) er bevart mye lenger.
2. Forbered deg på å montere embryo ved først å fjerne det ene øyet ved hjelp av en skjerpet tungsten nål. Skjær rundt vevet som forbinder øyet først deretter klippe musklene, og til slutt kutte synsnerven til å fortrenge øyet. (Merk: Hvis bildebehandling begge sider ønskes fjerne begge øynene.)
3. Når øyet er fjernet, monteres embryo på et dekkglass ved hjelp av en dråpe 3% metylcellulose. Orientere embryo slik at siden med den fjernede øyet er vendt mot dekkglass og er så nær glasset som mulig. Dekk hele embryo med methylcellulose å hindre uttørking under bildebehandling.
4. Bilde montert embryo umiddelbart med en invertert konfokal mikroskop utstyrt med et høykvalitets 20x Plan Apo objektiv (numerisk apertur = 0,75 eller bedre). Denne konfigurasjonen er å foretrekke fremfor en ikke-invertert mikroskop som ville kreve sandwiching embryoet mellom to glassflater, og pressing av embryoet mot den øvre glassplate.
5. Samle optiske skiver i en mikrometer trinn ved hjelp av en mellomstor eller stor blenderinnstilling. Kan også brukes større trinn på 2,5 mikrometer, men det kan være vanskelig å bestemme den romlig rekkefølge av mindre gjenstander. Små åpninger produsere skarpere detalj, men de lengre skanninger nødvendig kan blekemiddel EGFP og også begrense dybden av avbildnings inn i embryo som kan oppnås. En konfokalmikroskop åpner for bildebehandling omtrent halvveis gjennom et embryo.
6. Hvis avbildning av hele fisken er ønskelig, ta av begge øyne i utgangspunktet (se merknad i trinn 3.2), roter embryo etter imaging ene siden og gjenta trinn 02.03 til 02.05 for motsatt side.

Tre. 3D Rekonstruksjon av Embryonale Sebrafisk Cerebrovasculature

1. Bruk Fiji distribusjon ³ av åpen kildekode ImageJ (http://fiji.sc), som er optimalisert for 3D-gjengivelser, gratis, og kompatibel med PC, Mac og Linux-maskiner.
2. Import confocal stabler til Fiji ved å gå til Plugins> Loci> BioFormats Importør ⁿⁱ velg deretter confocal filen, f.eks name.ids for Nikon stacks (Figur 2A). Velg Vis stabel med Hyperstack, fargemodus: gråtoner, sjekk autoscale, sjekk splittet kanaler.
3. Disse valgene vil åpne fire separate kanaler paneler; for EGFP bare ett vil være nødvendig, vanligvis den tredje ned. Lukk de tre andre paneler (rød, blå og alfa) forlater 16-bits bilde med et langt navn etterfulgt av C = 1 (Figur 2A).
4. Juster terskelen ved å skanne selv om bildet ved hjelp av bla tab nederst for å finne en skive som har regionen eller strukturen av interesse, så gå til Image> Adjust> Threshold (figur 2C).
5. I panelet som kommer opp, skyver den øverste linjen (black level) til venstre slik at strukturen kan sees ganske godt over bakgrunnen, og la den nedre lysbildet (hvitnivå) der det er (figur 2D). Velg B & W, velg Mørk bakgrunn. Ikke velg beregn Terskel for hvert bilde med mindre forskjellige justeringer er nødvendig for hver skive, velger svart bakgrunn. Denne prosessen skaper en ny 8-bits bilde.
6. ADVARSEL: Terskel kan ikke angres eller lagres i ImageJ, så confocal stabelen må lastes inn på nytt hver gang en endring er nødvendig. Skriv ned tallene og prøve forskjellige innstillinger til ønsket resultat er oppnådd.
7. Gå til Plugins> 3D Viewer> Threshold 0, resampling faktor 1 (best) eller 2 (god), velge bort de røde og blå fargeboksene for å gjøre en grønn 3D-utgang - ellers er det will produsere en hvit gjengivelse - velg Bruk (ikke automatisk) (figur 2E).
8. Rotere, spinne og zoome 3D-bildet ved hjelp av mus og tastatur kontroller (Figur 2f).
9. Lagre stillbilder når som helst ved hjelp av alternativet fangst i menyen. Størrelsen på bildeboksen på skjermen dikterer piksel dimensjonene på bildet som produseres slik at hvis et bilde med høy oppløsning er ønskelig gjøre boksen større ved å dra den nederste høyre hjørne.
10. Lag en roterende 3D-film ved å velge Vis> Record 360 grader rotasjon (Figur 2G). Rotasjon standard til to grader per trinn, men det kan endres til 5 grader for eksempel, noe som vil skape mye mindre filstørrelser, men kan legge jerkiness til animasjon.
11. Lagre filen i en av flere tilgjengelige formater for senere visning med mediespillere, opplasting til Internett, eller bruker i PowerPoint-presentasjoner. Den open source media player, VLC ( http :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), er gratis og håndterer disse videoene svært godt.

Representative Results

3D rekonstruksjon av vaskulære strukturer gir en omfattende og visuelt interessant perspektiv av sebrafisk utvikling. Figurene 1 og 2 viser fremgangsmåter slik de vanligvis utføres. Figur 3 viser flere vinkler av vaskulære strukturer i en 6 dpf sebrafisk embryo som uttrykte EGFP i endotelceller. Med en solid grønn eller hvit farge kan det være vanskelig å sette pris på signalintensitet; pseudo-farging gir bildeintensiteten fra en look-up-table og gir bedre dybdesyn når strukturer lapper. Et eksempel på en pseudo-farget 3D-bilde av blodkar i en 6 dpf sebrafisk er gitt i figur 4.. Kan Fluorescens avbildning av levende embryoer brukes til å studere fysiologiske egenskaper som omfatter øyet og kroppsbevegelse, og hjerteaktivitet. Figurene 3 og 4 viser representative resultater oppnådd med disse fremgangsmåter, ved hjelp av den transgene linje sebrafisk beskrevet. Oppløsning Imaging avhenger mikroskop egenskaper, men lysstyrken på EGFP signal er tilstrekkelig for god bildekvalitet med de fleste kommersielle systemer. Rekonstruksjon og gjengivelse av 3D-fremstillinger er konsekvent og alternativer innenfor denne open-source programvare gir gjennomgående gode resultater.

Figur 1. Eye fjerning. A) Et fast 3 dpf embryo med en wolfram behov plassert ved siden av øyet. Tissue er kuttet rundt øyet fra denne posisjonen. B) Øyet er faller ut og de ​​underliggende øyemuskler og synsnerven er kuttet. Den tomme øyehulen er indikert med stiplet sirkel. C) Det samme embryoet er snudd og montert med metyl-cellulose, med intakte øyet vendt opp. hres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Step-by-step 3D rekonstruksjon av en confocal bildestakk. A) Åpne fil (4104.1.ids) lastet innen Fiji hjelp Plugins> Loci> Bioformat å velge. B) Etter å ha funnet en skive med regionen av interesse, er terskelen justering valgt som vist. C) Terskel er justert til 214 ved hjelp toppen slider og bruke er valgt. D) 3D-visningen kalles som vist. E) 3D rekonstruksjon er vist av en sebrafisk med øyet intakt, for orientering. F) Bildet er zoomet og roteres. G) En 360 graders rotasjon film gjøres som vist. res.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Perspektiver fra 3D rekonstruksjon. A) Medial perspektiv av 6 dpf embryo avbildes med 10x objektiv, er munnen til høyre, ikke gjeller inni munnen. B) Lateral av samme embryo, er oppmerksom finne en sløyfe i midten. C) Samme embryo avbildes med 20x objektiv, medial perspektiv, note gill oppløsning. D) Lateral perspektiv på 20x objektiv avbildning. Finnen er på høyre kanten av panelet. E) Antero-medial visning av 20x objektiv bildebehandling, notat gjellene inni munnen. F) Magen av samme embryoet avbildes med et 20x objektiv, leder det til høyre. Merk blodkar på plommesekken nederst til høyre.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 4. Intensity forskjeller i 6 dpf embryo. Bilde av en 6 dpf rekonstruksjon ved hjelp av en Pseudo look-up-table for signalintensiteten. Munn, hjerne, gjeller og plommesekken er merket for orientering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Movie av rekonstruert karsystemet i en 4 dpf sebrafisk. Fisken ble fotografert på 2,5 mikrometer. Bildene varfra bildebehandling ene halvdelen av embryo. Sammenligne karstrukturer med strukturer i en GSI-behandlet sebrafisk gitt i Figur 6. Merke til lavere tetthet av blodkar i hodet og større gjeller. (Se "Zfish_spin.avi" supplerende filen under Downloads)

Figur 6. 3D film av karsystemet i en GSI-behandlet embryo på 4 dpf. Fisken ble fotografert på 2,5 mikrometer gjennom fra lateralt for midtlinjen. Sammenlign vaskulære strukturer med kontroll 4 dpf fisk vist i figur 5.. Den buede rygg og mindre størrelse er typisk i embryoer behandlet med metanol. (Se "GSI-treated_4dpf_fish.avi" supplerende filen under Downloads)

Discussion

Metodene som beskrives her gi et grunnlag for visuelle undersøkelser av karsystemet i å utvikle sebrafisk. Pågående prøver kan brukes for å vurdere fysiologiske parametre, som hjerte-og hjertefrekvensen slagvolum, mens faste prøver kan brukes for høy oppløsning konfokal avbildning. Drosophila og C. elegans tillate for hele kroppen bildebehandling, men sebrafisk er virveldyr og gi en nyttig modell for virveldyr vev, inkludert en endotelceller-lined karsystemet. Disse studiene kan innlemme betydelige transgene linjer og genomisk ressurser fra sebrafisk forskningsmiljøet. 3D rekonstruksjon og gjengivelse av confocal bilder fra embryonisk sebrafisk, slik det er beskrevet her, gir mulighet for en systembiologisk metode til vaskulær forgrening og blodkartettheten som ikke er mulig med større dyremodeller slik som rotter og mus. Videre, som amniotes sebrafisk utvikle seg i en modifiserbar miljø (E3 buffer), hvor man kan enkelt legge til chemicals som hemmer spesifikke enzymer eller andre prosesser som påvirker vaskulær utvikling. Konsentrasjonen og timing av kjemiske levering kan bli endret, slik at forskeren å finjustere behandlingsforhold.

En. Modifikasjoner og feilsøking

Modifikasjoner på dette systemet kan innlemme transgene linjer av sebrafisk som uttrykker EGFP eller andre fluorescerende proteiner i en rekke vev, organer eller region bestemte mønstre ^10. Videre har analyse av neovaskulære endringer i sebrafisk retina har nylig blitt publisert ^5. Problemer med pigmentering i eldre embryoer og voksne sebrafisk kan kompenseres ved å krysse med transgene linjer som ikke produserer skala pigmenter eller retinal pigment. Problemer med redusert fluorescens vanligvis et resultat av en festeforhold. Paraformaldehyd (4%) i 1 dag er optimal, men sterkere fiksativ, slik som glutaraldehyd, osmium-tetroksyd-eller alkohol, kanødelegge EGFP fluorescens. Etter fiksering, bør embryo holdes i PBS ved 4 ° C og alltid beskyttet mot direkte sollys.

2. Begrensninger av denne teknikken

Kvaliteten og oppløsningen på 3D-gjengivelser produsert med denne protokollen avhenger av kvaliteten på bildene som genereres. Svak penetrering gjennom disse embryoer er begrenset til det mid-sagittal plan ved hjelp av en standard konfokalmikroskop. Dette aspektet av bildebehandling begrenser dybden av bildebehandling i eldre embryoer og voksne, men mer avanserte multi-foton mikroskopi systemer gir mulighet for bildebehandling på større dyp.

Tre. Betydning i forhold til eksisterende metoder

Denne protokollen gir en tilnærming til analyse av blodkaret nettverk på et systemnivå som kan innlemme et helt dyr. Tidligere fremstillinger av slike data ofte stolt på serie med bilder lagt ut sammen, men 3D-rendering gir bedre oppløsning av den romlige forholdtionships involvert.

4. Fremtidige søknader

Nye utbygginger i bildebehandling og vev behandling vil gi mange nye søknader om disse metodene som kan inkludere å gjøre eldre embryoer eller voksne gjennomsiktig ^11-14. Forbedret åpenhet vil øke vev penetrasjon av confocal og multi-foton lasere. Videre, ettersom hastigheten til kameraene og fotomultiplikatorrør øke kan det snart være mulig å frem 3D-gjengivelser av fisk i sanntid, som gir en 4 ^th dimensjon av analysen.

5. Kritiske trinn

Et kritisk punkt i denne protokollen er forberedelse for bildebehandling, som inkluderer riktig fiksering. Imaging bør gjøres så snart som mulig etter fiksering med høy kvalitet mål som har de beste numeriske åpninger tilgjengelig. Oppløsning avhenger av avbildningssystem benyttes, så høy kvalitet systemer er generelt bedre. Genererer 3D-gjengivelser krever mye minneFor så nyere, high-end-maskiner med en stor mengde minne og gode grafikkprosessorer er anbefalt.

Den visuelle biologi systemet beskrevet her har blitt optimalisert for transgen sebrafisk som uttrykker EGFP i vaskulære endotelceller, selv om disse metodene kan tilpasses transgene embryoer som uttrykker GFP, eller andre fluorescerende proteiner, i populasjoner av nerveceller, muskler, kjertler eller en rekke andre celler. Den store fordelen i å jobbe med dette systemet er muligheten til å studere hva som skjer i hele embryo når som helst i løpet av denne utviklingsperioden, i faste og / eller levende dyr.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N – Phenylthiourea	Alfa Aesar, catalog #41972		0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C
E3 buffer	Sigma		5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Confocal microscope	Nikon		D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U
Glass bottom dishes	Mat-Tek
GSI IX/DAPT			N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences
24 well plates	Becton-Dickinson, cat# 351147		BD Falcon
Transfer pipettes	VWR, cat #414004-001		VWR disposable transfer pipettes
Methyl-cellulose	Alfa Aesar, cat#43146		3% in E3 buffer
NRD 4/6 Fish food	Brine Shrimp Direct		Dried
Brine shrimp	Brine Shrimp Direct		Live
Tungsten wire	Small Parts # TW-016-60		0.016” OD
Tricaine	VWR # 101107-950		Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer