Summary
Pluripotente stamceller, enten embryonale eller indusert pluripotente stamceller (iPS) celler, utgjør en verdifull kilde til menneskelige differensierte celler, inkludert cardiomyocytes. Her vil vi fokusere på hjertestans induksjon av iPS-celler, som viser hvordan du bruker dem til å oppnå funksjonelle menneskelige cardiomyocytes gjennom en embryoid organer-basert protokoll.
Abstract
For å undersøke hendelsene kjøring hjerte utvikling og for å bestemme de molekylære mekanismene som fører til hjerteinfarkt sykdommer hos mennesker, er det viktig først å generere funksjonelle menneskelige cardiomyocytes (CMS). Bruken av disse celler i medisiner og toksikologiske studier ville også være meget gunstig, slik at nye farmakologiske molekyler for behandling av hjertesykdommer som skal valideres pre-klinisk på celler av human opprinnelse. Av de mulige kilder til CMS, pluripotent spindelen (IPS) celler er blant de mest lovende, da de kan utledes direkte fra lett tilgjengelige pasientens vev og har en iboende evne til å gi opphav til alle celletyper i kroppen 1.. Flere metoder har blitt foreslått for å differensiere iPS celler inn i CMS, som spenner fra de klassiske embryoid organer (EBS) aggregering tilnærming til kjemisk definerte protokoller 2,3. I denne artikkelen foreslår vi en EBS-basert protokoll og vise hvordan dette method kan brukes til å effektivt generere funksjonelle CM-lignende celler fra mater-frie iPS celler.
Introduction
Historisk har etterforskningen av de genetiske og molekylære mekanismer som driver menneskelig utvikling og sykdom vært basert på produksjon av genmodifiserte dyremodeller. Imidlertid tallrike humane fenotyper ikke klarer å være vellykket replikeres i mus, hovedsakelig på grunn av de biologiske forskjeller som eksisterer mellom de to artene. På den annen side, tilgang på humant vev kan være begrenset og ofte ikke tillate nok materiale til å bli oppnådd for inngående eksperimentelle studier. Feltet av kardiovaskulære biologi lider av begge disse begrensninger: fysiologien av det menneskelige hjerte er vesentlig forskjellig fra den i mus, og en betydelig mengde av hjertevev er tilgjengelig bare obduksjon eller under hjertekirurgi. Finne en optimal kilde for differensiering av funksjonelle menneskelig CMS har derfor blitt et sentralt tema i kardiovaskulær biologi, og mye arbeid er gjort for å løse dette problemet. Forskjellige typer celler er blitt foreslått, including skjelettlidelser myoblasts, lokale kardiale stamceller, benmarg mononukleære celler, endotelceller forfedre og stamceller. Imidlertid oppnådde data ved hjelp av disse celler ikke har vært konsekvent 4..
Avledning av humane embryonale stamceller (ESC) første 5 og banebrytende oppdagelse av induserte pluripotente stamceller (iPS) celler ved Yamanaka og Thomson 6,7 senere syntes å tilby løsninger: Disse cellene har evnen til å vokse på ubestemt tid og potensial til å gi stige til alle celle derivater av de tre bakterie lag, herunder det CMS. Bruken av iPS celler gir ytterligere fordeler: å være avledet fra autologe voksne celler, bærer de samme genom som den enkelte pasient eller fra hvilket de er avledet. De har derfor tillate utviklingen av in vitro modeller som letter etterforskningen av menneskelige genetiske sykdommer og mekanismer for utvikling. I kraft av denne karakteristiske, kan iPS celler også overcome problemer knyttet til immunforsvaret avvisning og etiske problemstillinger åtte. For disse grunner, selv om ESCs fortsatt representerer gullstandarden innen stamcelleforskningen biologi, er forskere over hele verden nå beveger seg mer mot iPS celle teknologi.
iPS celler blir nå ansatt for å modellere menneskelige sykdommer in vitro for ulike forhold, inkludert medfødte kardiovaskulære lidelser 9,10. Nylig har anvendelsen av iPS celle sykdom modellering utført for monogene hjertesykdommer (dvs. lang QT syndromer, catecholaminergic polymorf ventrikulær takykardi) og sykdomstrekk der kardiale defekter er en del av en kompleks fenotype (dvs. Leopard og Timothy syndromer, dilatert kardiomyopati). Disse rapportene bekreftet at pasient-spesifikke iPS celler som skiller seg inn i CMS vise lignende fenotypiske og funksjonelle egenskaper som sykdommen in vivo.
Men deter fortsatt mange utfordringer for å forbedre effekten av å indusere iPS celler i hjertets avstamning. Spontan generasjon av CMS fra menneskelige ESCs via aggregatdannelse kalt embryoid organer (EBS) har vist seg vellykket 17. Siden denne oppdagelsen, har mange andre metoder blitt foreslått. Mange grupper har kraftig forbedret effektiviteten av differensiering protokollen og har beveget seg mot kjemisk definerte og animalske biprodukt-fri kultur reagenser (se Mummery, C., et al., Circulation Forskning (2012) for en omfattende gjennomgang av alle eksisterende metoder 3 ).
Ikke desto mindre representerer den klassiske metoden basert på EB aggregering fremdeles den mest vanligvis anvendt for å utføre funksjonelle studier og undersøke sykdom mekanismer. Vår foreslåtte protokoll er basert på aggregering av celler inn i iPS EBS og kultur i nærvær av serum og askorbinsyre, som har vist seg å øke den kardiale differensi og til positively påvirke modningen av disse cellene 18,19. I denne artikkelen vil vi gå gjennom denne metodikken i detalj og vil vise hvordan du bruker mater-frie iPS cellelinjer for generering av pasient-spesifikke iPS-avledet CMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Feeder-free Vedlikehold og passaging of Human iPS cellelinjer
- Forbered Matrigel-belagte retter. Tine ett hetteglass av menneskelig ESC-kvalifisert Matrix på is i en time og spe den i 25 ml DMEM-F12 medium. Tilsett 1 ml til hver 35 mm plate (eller tilsvarende beløp per areal hvis andre retter er brukt), holder alt på is og sikre at alle plater og rør er pre-avkjølt. Dekke platene med aluminiumsfolie.
Merk: matrigel lager konsentrasjonene varierer fra batch. Fortynning instruksjonene er angitt på databladet.
- Hold plater på is over natten og fjerne fra isen neste dag. Platene kan holdes i kjøleskapet opp til en uke før bruk.
- Klargjør mTESR1 komplett medium (eller tine en ampulle med Nutristem middels) og H-ESM (human ESC medium) i henhold til tabellen nedenfor.
H-ESM FINAL CONC FOR 500 ml Knockout Serum Replacement (KSR) 20% 100 ml Glutamax 100X 2 mM 5 ml MEM ikke-essensielle aminosyrer 0,1 mM 5 ml Penicillin-streptomycin 100 U / ml - 0,1 mg / ml 5 ml 2-merkaptoetanol 0,1 mM 900 ul B27 Supplement - uten Vitamina 1% 10 ml N2 Supplement 1% 5 ml Knockout DMEM - 370 ml
Lager medium kan lagres ved 4 ° C i ikke mer enn 2 uker. For å fremstille komplett vekstmedium, har den grunnleggende FGF tilsatt like before foring ved en endelig konsentrasjon på 20 ng / ml.
Merk: Fullstendig H-ESM under forutsetning av mus embryonale fibroblaster kan brukes i stedet for mTESR1 eller Nutristem for iPS celler.
- Plasser belagte plater i en inkubator ved 37 ° C i 30 min til 2 t før passering.
- Cellene skal passaged omtrent hvert 5 dager, selv om de ikke har nådd samløpet. Kolonier bør ikke berøre.
- Erstatt vekstmedium med 1 ml dispase (1 mg / ml, løses fra en 10 mg / ml lager i PBS).
- Fjern skille områder med trukket glass Pasteur pipetter. Områder som bør fjernes omfatte krater-lignende eller cystisk strukturer i sentrum av kolonier, og at områder hvor cellene har blitt separert fra koloniene og utflatet og synes å være migrerer utover.
- Inkuber ved 37 ° C under en kultur hette inntil koloni grenser blir lysere og begynne å løsne (vanligvis rundt 5-7 minutter). Discard dispase. Vask med 1 ml H-ESM og kast.
- I 1 ml H-ESM, bruk en celle løfteren (slikkepott-lignende skrape) å høste kolonier og samles i en 15 ml Eppendorf tube. Skyll med 1 ml H-ESM og legge til røret. Rotere ved 1000 RCF for 4 min og fjern supernatanten.
- Resuspender pellet i 1 ml forvarmet vekst medium (enten mTESR1 eller Nutristem). Unngå å bryte opp klumper for mye - pipetter opp og ned mindre enn 6-8x. Bestem hvor mange celler bør være belagt og fjerne unødvendige celler (vanligvis 1:04 eller 1:05 fortynning), f.eks for to plater på 1:05, fjerne 600 ul, deretter legge 1,6 ml friskt medium.
- Fjern Matrigel fra platene. Plasser cellene dråpe for dråpe, fordele jevnt på plate. Unngå å riste røret overdrevet, da dette vil føre cellene til å bevege seg mot sentrum.
- Vask rør med 1 ml medium og skillet mellom platene. Siste bindet i hver plate bør være 1,5 -2 ml.
- Skift medium hver dag, med unntak for dagen etter passering. Selv om det erideelt å endre medium hver dag, kan dette tidvis endret med en frekvens på en gang annenhver dag hvis ikke mer enn 2-3 dager har gått siden siste passering uten å påvirke pluripotency eller differensiering potensial.
- Hvis cellen linjen må være frosset, re-suspendere stedet i 1-2 ml mFreSR frysing medium med en 2 ml pipette og sted 1 ml / cryovial. Plasser hetteglassene i en cryobox ved -80 ° C og overføring til flytende nitrogen i 3-4 dager.
Merk: Manuell mikrodisseksjon av iPS celler må utføres under et stereomikroskop. En in vitro fertilisering (IVF) arbeidsstasjon (f.eks en IVF Workstation fra KSystem) integrert med et stereomikroskop tillater manipulering av celler i sterile forhold mens de holdt på en oppvarmet areal. Hvis dette ikke er tilgjengelig, kan en stereomikroskop flyttes under en vanlig laminær hette.
2. Embryoid Bodies Aggregering og Cardiac indukn
- Forbered EBM-20 medium i henhold til tabellen nedenfor.
EBM-20 FINAL CONC FOR 500 ml Fetal Bovine Serum (opprinnelse Sør-Amerika) 20% 100 ml MEM ikke-essensielle aminosyrer 0,1 mM 5 ml Penicillin - streptomycin 100U/ml - 0,1 mg / ml 5 ml Glutamax 100X 0,1 mM 5 ml 2-merkaptoetanol 50um 450 ul DMEM/F12 - 385 ml
Bruk av FBS av Sør-Amerika opprinnelse er avgjørende for fastsettelse av differensiering effektivitet: ansettelse av andre typer sera kan påvirkedifferensiering prosessen. For å fremstille komplette EBM-20, tilsetter askorbinsyre (AA) til en endelig konsentrasjon på 50 ug / ml. Komplett vekstmedium kan lagres ved 4 ° C i ikke mer enn en uke. - Harvest iPS kolonier som beskrevet ovenfor (trinn 1.6 til 1.9).
- Resuspender forsiktig i 1 ml EBM-20 med en 2 ml pipette. Unngå å bryte opp klumper for mye - pipetter opp og ned ikke mer enn 2-3x, sjekke størrelsen på kolonier under stereomikroskop. Plate på ultra-lave festeplatene i 1:1-forhold (for eksempel for et 35 mm tallerken, bruk en brønn i en 6-brønn plate). Skyll slangen med 1 ml EBM-20 og legge til plate.
Merk: Størrelsen av koloniene påvirke differensiering prosessen, kontrollere effektivitet og timing av hjertestans induksjon. Aggregering av homogent størrelse EBS har vist seg å redusere variabiliteten observert under differensiering.
- På dag 3, endre EBM-20 en gang ved hjelp av et mikroskop for å unngå refjerning av EBS. Hold pipetten nær kanten av tallerkenen, og fjern medium.
- Den 7. dag, bryter EBS til plater belagt med 0,1% gelatin og tidligere plassert ved 37 ° C i 30 min. Om nødvendig, kan gelatin fjernes og platene igjen under en cellekultur hette O / N. Legg 35-40 EBS per 35 mm parabolen.
- Sjekk EBS for å slå områder og endring EBM-20 to ganger per uke. Merk av hvor juling områdene ligger på toppen av fatet dekselet, for å lette de lokalisering under stereomikroskop. Kontraherende områder skal vises etter ca 10-20 dager.
- Når områder med spontan sammentrekning vises, bytter medium til EBM-2 (forberede så EBM-20, med 2% FBS i stedet) og isolere dem som beskrevet nedenfor i punkt 3..
- Fortsett å sjekke andre områder for å slå og endre medium to ganger per uke inntil juling områdene er nødvendig for videre eksperimenter.
Merk: Effektivitet av differensiering prosessen er svært avhengigflere faktorer, den mest kritiske av disse er de spesifikke cellelinjer og batchen av serum som brukes for å indusere differensiering hjertefunksjon. For å oppnå høyest mulig effektivitet, test cellelinjer for cardiomyogenic potensial og ulike grupper av serum.
3. Slo Områder Isolasjon og kultur
- Coat 12-brønners plater (4 cm 2 areal) eller plater av interesse med 5 mikrogram / cm 2, fibronektin fortynnet i PBS for å få nok volum til å dekke hele overflaten fullstendig (300 mL totalt per brønn i 12-brønn plater). Hold avdekket i cellekultur hette og la tørke. Platene kan være pakket og oppbevart ved 4 ° CO / N.
- Fjern slo området ved hjelp av et glass trakk Pasteur pipette og skalpell, etter behov. Overføring til fibronectin-belagte plater med en 1 ml pipette.
- Tilsett 1 ml EBM-2.
- Kryss av platen for å indikere de områder hvor cellene ble fjernet og endre mediet. Platene kan oppbevares i opptil en måned, som andre områder kan starte bspise senere.
Merk: Hvis mindre juling klumper er nødvendig, pipetter eksplantert området opp og ned flere ganger under stereomikroskop, før den bryter i mindre biter. Dette vil resultere i klynger av noen få juling celler (se film 3).
- Endre medium to ganger i uken til alt er klart for analysene.
Merk: Cardiomyocytes oppnådd fra denne protokoll har fetal-lignende morfologiske og funksjonelle egenskaper, modenhet for en voksen-liknende fenotype kan oppnås ved å øke den tid i kultur for ytterligere å differensiere disse cellene.
4. Enkelt Slo Cells Isolasjon og analyse
- Coat 2-kammers objektglass (4 cm 2 areal), eller andre egnede støtter med 5 mikrogram / cm 2 fibronektin fortynnet i PBS tilstrekkelig til å dekke hele overflaten kulturen. Hvis en glass-støtte er brukt, belegge med laminin og fibronektin (5 mikrogram / cm 'sup> 2 hver).
- Fjern slo med en Pasteur pipette / skalpell fra platene fra avsnitt 3.
- Ved hjelp av en 1 ml pipette, overføre celler til et 15 ml rør inneholdende 500 pl kollagenase II (480 U / ml i PBS med Mg og Ca) og inkuberes 15 minutter ved 37 ° C og ristet i røret gang i løpet av inkuberingen.
- Pipette opp og ned med en 200 mL pipette. Hvis noen klumper igjen, overføre til frisk collagenase II og gjentar trinn 4.3.
- Gjenta trinn 4.4 til ingen store klumper som er igjen.
- Inaktivere collagenase med 3 ml EBM-2 (ingen AA). Røret kan deretter bli stående under panseret i en oppvarmet stativ til andre rør er klar. Sentrifuger ved 1000 RCF for 4 min.
- Resuspender pellet i 1 ml 0,25% trypsin / EDTA (fortynnet fra en 0,5% lager i 1X PBS) og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Kombiner fraksjoner av digestions fra samme innledende prøven.
- Inaktivere trypsin med 4 ml EBM-2 (ingen AA). Passere cellene gjennom en 18G nål på en 2,5 ml sprøyte ikke mer tHan 7x. Sentrifuger ved 1000 RCF for 4 min.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml EBM-2 per brønn og plate. Celler kan brukes til funksjonelle og morfologiske analyser 2-3 dager etter plating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I våre studier genererte vi CMS fra flere iPS cellelinjer. Disse linjene ble opprinnelig generert på en MEF mater lag, men ble umiddelbart plassert på Matrigel ved hjelp av en definert medium (enten mTESR1 eller Nutristem). Forskjellige analyser ble brukt for å verifisere vedlikehold av de morfologiske egenskaper er uttrykk for markører som er typiske for pluripotente celler (OKT-4, SSEA4 og TRA1-60) og deres genom stabilitet (figur 1).
Induksjon i hjertets avstamning ble utløst av aggregering av iPS celler i EBS og kultur i nærvær av en bestemt type serum og AA (Tall 2A og 2B). Kontraherende områder representerte 20-35% av det totale, avhengig av den cellelinjen som benyttes (figur 2C og Film 1). Kontrahering CMS isolert fra disse regionene ved enzymatisk fordøyelse (Movie 2) uttrykte typiske cardiomyocyte strukturelle proteiner (cardiac troponin, og alpha;-sarcomeric aktin, myosin tunge kjeder α og β), gap junction proteiner (connexin-43), og de store ionekanaler (Tall 2D-2F). Elektrofysiologiske analyse av disse cellene viste en heterogen populasjon som omfatter celler med nodal, atrial og ventrikulære profiler (data ikke vist, Priori, SG, et al. J. Clin. Invest., I trykk, 14,15,20).
Figur 1. Feeder-free iPS celler vedlikehold påvirker ikke pluripotency. AB) iPS kolonier dyrket på Matrigel beholde sin menneskelige ESC-lignende morfologi, med fase-lyse kanter og fremtredende nucleoli. CD) immunfluorescens analyser som viser iPS celler korrekt uttrykker transkripsjonsfaktor OKT-4 (C)og TRA1-60 overflate-antigen (skala barer: 50 pm). (D) (E) Cytofluorimetric-analyse bekreftet at ekspresjon av typiske overflate pluripotency antigener (SSEA-4 og TRA1-60). Den gating strategien er vist ved den venstre scatter. (F) Representant karyotype analyse av iPS celler dyrket på Matrigel. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Differensiering av funksjonelle iPS-avledet CMS. A) Skjematisk fremstilling av differensiering protokollen. B) embryoid organer aggregeres fra iPS celler. C) Representasjon av et område av kontraksjon. D) RT-PCR showeting uttrykk for noen hjerte-spesifikke ionekanaler av de iPS-avledet slo klumper (CACNA1A - kalsium kanal, spenning avhengige, alfa 1A underenhet; SCN5A - natriumkanalen, spenning gated, type V, alfa subenhet; KCNQ1 - kalium spenning gated kanal, KQT som underfamilie, medlem 1) og begge former for myosin tung kjede (MHC-en og MHC-b). Ingen ekspresjon ble observert hos iPS celler, mens cDNA fra føtale hjerte cellene ble brukt som en positiv kontroll. HGPRT ble brukt som husholdningsgenet. EF) Immunfluorescens farging som viser enkelt IPS-avledet CMS uttrykke det strukturelle proteinet α-sarcomeric aktin, kardial troponin (TNNI), og den kardiale-spesifikke kryss connexin 43 (CNX-43). Scale barer: 50 mikrometer. Bilder ble anskaffet ved hjelp av en AxioVision Zeiss fluorescens invertert mikroskop og analysert med ImageJ. Klikk her for å se større figur .
<strong> Movie en. Kontrahering området avledet fra iPS celler. Klikk her for å se filmen.
Movie 2. Enkelt kontrahering iPS-avledet CMS, hentet fra enzymatisk nedbrytning av et entreprenørselskap området. Klikk her for å se filmen.
Movie 3. Lite kontrahering klynge, fremstilt ved delvis mekanisk disseksjon. Klikk her for å se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pluripotente stamceller har potensial til å differensiere spontant inn i CMS, riktignok med lav effektivitet og høy variasjon blant linjene. Utvikling av nye metoder for igangsetting har derfor fokusert på effektivisering av prosessen og beveger seg mot mer definerte protokoller. Men de fleste av disse nye differensieringsmetodane er ganske komplisert, krever forseggjorte dyrkningsbetingelser, finkontroll av timing og konsentrasjon av reagenser, og behandling med dyre cytokiner og vekstfaktorer. Også, forskjeller i de endogene nivåer av cytokin signalering forskjellige iPS cellelinjer gjør det vanskelig å standardisere Cytokinkonsentrasjoner, som ofte må justeres til et passende nivå for hver cellelinje.
Modning av innhentet iPS-avledet CMS representerer også et viktig aspekt å vurdere når du prøver hjertestans differensiering av iPS celler for sykdom modellering og drug discovery programmer. Den differentiation av menneskelige ESCs og iPS celler vanligvis gir opphav til CMS med en fosterets fenotype dvs. uten en helt moden struktur. Dette er spesielt sant når monolags tilnærminger brukes, og som et resultat er disse mer egnet for å bringe, amplifisering, og isolering av spesifikke populasjoner kardiale progenitor 2,3.
I dette scenariet, synes den "klassiske" EBS aggregering metoden, som er fortsatt mye brukt for sykdom modellering formål, for bedre å passe de eksperimentelle behov. Denne metoden er enkel, økonomisk, lett praktisk, og passer for alle linjer. Det er ikke behov for ytterligere vekstfaktorer eller cytokiner, eller for encellede fordøyelsen, som ofte ikke er godt tolerert av iPS-celler, også, de krever flere behandlinger med ROCK hemmere 21. Videre ligner aggregering til EBS den naturlige utviklingsprosess av en pluripotent celle, med EBS som gir et 3-dimensjonalt miljø og paracrine signaler som er mer lik fysiologiske forhold. Videre har tillegg av AA vist seg konsekvent å forbedre hjertestans differensiering av iPS-celler, og også for å bedre deres strukturelle og funksjonelle modning 18,19. Velge iPS cellelinjer basert på deres kardiogent potensial, sammen med utvalg av de mest aktuelle batch av serum, kan ytterligere forbedre effektiviteten av CM generasjon.
Endelig har metoden foreslått her også fordelen av å ikke krever mus mater celler, noe som eliminerer muligheten for forurensning med musen celler og også ytterligere forenkler de tekniske prosedyrer for iPS celle passaging og EBS formasjon. Denne metoden confers rekke fordeler og utgjør en vesentlig forbedring i forhold til tidligere teknikker, derved åpnet veien for fremtidige kardiovaskulære regenerativ medisin anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen økonomiske interesser å avsløre.
Acknowledgments
BS ble støttet av University of Milan-Bicocca Summer Student Forskning Training Program, forskning ble støttet av midler fra det italienske Ministry of Health and Italian Ministry of Education, University og Forskning og Fondazione Humanitas til GC, vi takker Michael VG Latronico for kritisk lesing manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
| Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
| F–tal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
| PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercapt–thanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
| Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
| Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | ||
References
- Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
- Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
- Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
- Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
