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Biology

में निगरानी प्रोटीन refolding के लिए युग्मित Assays Published: July 9, 2013 doi: 10.3791/50432
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas Medical School

Summary

इस लेख की जांच के लिए एक जुगनू luciferase-GFP संलयन प्रोटीन के उपयोग का वर्णन

Abstract

प्रोटीन तह / जीवजनन के संयुक्त प्रक्रियाओं के रूप में परिभाषित Proteostasis, refolding / मरम्मत, और गिरावट, हानिकारक परिणाम 1 से बचने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए कि एक नाजुक सेलुलर संतुलन है. इस संतुलन को बाधित कि बाहरी या आंतरिक कारकों प्रोटीन एकत्रीकरण, विषाक्तता और कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. मनुष्यों में इस तरह के हटिंगटन है, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग के रूप में 10 neurodegenerative विकारों के साथ जुड़े लक्षण के लिए एक प्रमुख योगदान कारक है. यह Proteostasis के रखरखाव में शामिल प्रोटीन इन गंभीर बीमारियों के लिए उपचार विकसित करने के लिए पहचान की जानी है कि इसलिए जरूरी है. यह लेख हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FFL GFP) के लिए जुड़े हुए मॉडल प्रोटीन जुगनू luciferase का उपयोग कर लगभग वास्तविक समय प्रस्ताव पर विवो प्रोटीन तह में निगरानी के लिए तकनीक का वर्णन करता है. FFL के आधा भाग तनाव प्रेरित मीटर के प्रति बेहद संवेदनशील है के रूप में FFL-GFP का एक अनूठा मॉडल कैमेरिक प्रोटीन हैएंजाइम 12 inactivates जो isfolding और एकत्रीकरण,. Luciferase गतिविधि एक enzymatic परख उपयोग पर नजर रखी, और GFP आधा भाग स्वचालित माइक्रोस्कोपी का उपयोग घुलनशील या एकत्रित FFL दृश्यमान करने का एक तरीका प्रदान करता है. मिलकर इन तरीकों refolding और तनाव के बाद एक एंजाइम की कार्यात्मक पुनर्सक्रियन दोनों का विश्लेषण करने के लिए दो समानांतर और तकनीकी रूप से स्वतंत्र दृष्टिकोण को शामिल. गतिविधि वसूली सीधे बेहतर ऐसे प्रोटीन संरक्षक के रूप में प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण कारकों इन कार्यों को करने के लिए सहयोग समझने के लिए कैसे disaggregation और फिर solubilization के कैनेटीक्स के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. इसके अलावा, जीन विलोपन या परिवर्तन इस प्रक्रिया के लिए विशिष्ट प्रोटीन या प्रोटीन के योगदान का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस लेख में हम इस दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए प्रोटीन refolding करने, प्रणाली 5 refolding Hsp40/70/nucleotide विनिमय कारक (एनईएफ) के साथ भागीदार के लिए जाना जाता प्रोटीन disaggregase Hsp104 13 के योगदान की जांच.

Introduction

मनुष्यों में अल्जाइमर, पार्किंसंस और Huntington रोग सहित neurodegenerative विकारों प्रोटीन misfolding और एकत्रीकरण 10 से जोड़ा गया है. कोशिकाओं misfolded निष्क्रिय संरचनाओं 6 में सेलुलर प्रोटीन की गतिज फँसाने को रोकने के लिए आणविक संरक्षिकाओं रोजगार. संरक्षिकाओं कोशिका के भीतर जटिल बातचीत नेटवर्क में भाग लेते हैं, लेकिन यह पूरी तरह से इन संबंधों का योग जीवधारी Proteostasis का योगदान करने के लिए कैसे समझ नहीं है. साइटोसोलिक प्रोटीन तह के बहुमत के लिए जिम्मेदार मुख्य संरक्षक से एक 70 केडी गर्मी झटका प्रोटीन (Hsp70) परिवार के 19 है. यह दिखाया गया है कि Hsp70 घटने के खमीर नुकसान नवजात heterologously व्यक्त FFL गुना करने के लिए और इन विवो 18, 7 में अंतर्जात प्रोटीन, ओर्निथिन transcarbamoylase, refold करने की क्षमता में. लगभग वास्तविक समय संकल्प के साथ तह विश्लेषण करने की क्षमता को समझने की सुविधा होगी कैसे अतिरिक्त सेलुलर कारकों ऑनइस Hsp70 पर निर्भर प्रक्रिया को ribute. इसके अलावा, तह / प्रतिक्रियाओं refolding इन योगदान प्रोटीन पर पूरी तरह से निर्भर नहीं हो सकता, इसलिए assays के कैनेटीक्स और दक्षता में बड़े और छोटे परिवर्तन दोनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील होना चाहिए.

खमीर सेल disaggregase, Hsp104, एकत्रित misfolded प्रोटीन की मरम्मत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. Hsp104 homologs फफूंद और पौधों में पहचान की गई है, इस परिवार मेटाजोअन में अनुपस्थित होना प्रतीत होता है. यह ऐसी Hsp110 परिवार के उन लोगों के रूप में अन्य संरक्षिकाओं स्तनधारियों 16 में ज्ञात Hsp104 गतिविधियों के कुछ है कि प्रदर्शन को प्रस्तावित किया गया है. Hsp104 एक एएए +, hexameric प्रोटीन जटिल है कि फिर से तैयार प्रोटीन समुच्चय के लिए खमीर में काम करता है, refolding और मरम्मत के 13 में योगदान दे. Hsp70 खमीर, Ssa1, और खमीर Hsp40, Ydj1 साथ Hsp104, खमीर कोशिकाओं 5, 8 में विकृत FFL की वसूली के लिए आवश्यक है. छोटे गर्मी झटका प्रोटीन, Hsp26, भी requi होना दिखाया गया हैFFL 2 की Hsp104 की मध्यस्थता disaggregation के लिए लाल.

FFL सब्सट्रेट सक्रिय साइट में luciferin और एटीपी और ऑक्सीजन, decarboxylates की आवश्यकता है कि एक गठनात्मक परिवर्तन के बाद कि बांध एक दो डोमेन प्रोटीन है oxyluciferin, कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2), adenosine monophosphate (एएमपी), और प्रकाश 11, रिहा सब्सट्रेट 9, 3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FFL सब्सट्रेट, डी luciferin, एक luminometer 15 का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है कि 550-570 एनएम के बीच प्रकाश उत्सर्जन में परिणाम है. FFL खुलासा होने पर रासायनिक या गर्मी उपचार और तेजी से समुच्चय से विकृतीकरण को exquisitely संवेदनशील है. 39-45 के बीच तापमान के संपर्क में डिग्री सेल्सियस FFL reversibly सामने आया और निष्क्रिय 12 है. इसके विपरीत, GFP और उसके डेरिवेटिव तनावों 14 खुलासा प्रोटीन के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. इसलिए इन दो प्रोटीनों के विलय कार्यात्मक जी को निशाना बनाने में सक्षम एक प्रयोगात्मक अस्थिर आधा भाग के रूप में कार्य करने के लिए FFL के लिए अनुमति देता हैएफपी आबादी और एकल कक्ष दोनों स्तरों पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि जमा intracellular लिए. स्वचालित माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर एक अर्द्ध स्वचालित बहुपद्वति प्लेट रीडर में एंजाइमी परख के आवेदन कैनेटीक्स और प्रतिक्रियाओं refolding की उपज की अभूतपूर्व एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है. इसके अलावा, मॉडल यूकेरियोट Saccharomyces cerevisiae की सतही आणविक आनुवंशिकी सटीक प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क के हेरफेर और सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया और Proteostasis के लिए योगदान दे उपन्यास खिलाड़ियों की पहचान के लिए खोज आधारित दृष्टिकोण के लिए अवसर दोनों की अनुमति देता है.

इस अध्ययन में, FFL-GFP व्यक्त जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और HSP104 विलोपन उपभेदों प्रोटीन denaturing गर्मी सदमे के अधीन हैं. FFL-GFP refolding एक वसूली समय के पाठ्यक्रम पर व्यक्त proteome के मरम्मत के लिए एक प्रॉक्सी readout के रूप में एक enzymatic परख और माइक्रोस्कोपी दोनों के माध्यम से नजर रखी है. WT कोशिकाओं की तुलना में, हम वें दिखानेई Hsp104 विलोपन तनाव विकृत FFL 2 के पुनर्सक्रियन में Hsp104 के लिए एक भूमिका की स्थापना पिछले निष्कर्ष का समर्थन, FFL-GFP refolding पर ~ 60% कम कुशल है.

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Protocol

1. प्लाज्मिड FFL-GFP युक्त खींच का निर्माण

इस अध्ययन के लिए, Saccharomyces cerevisiae तनाव BY4741 (मेट एक, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) खमीर पीटकर संग्रह (ओपन Biosystems / थर्मो वैज्ञानिक) से एक HSP104 विलोपन तनाव के साथ इस्तेमाल किया गया था. विलोपन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक Hsp104 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पुष्टि की गई.

FFL-GFP के लेखकों के अनुरोध पर टोरंटो में 17 विश्वविद्यालय और प्राप्य पर ग्लोवर प्रयोगशाला से प्राप्त प्लाज्मिड एक leu2 आधारित स्रोत से निर्माण, p426MET25-FFL-GFP से व्यक्त की गई थी. FFL-GFP प्लाज्मिड संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति MET25 मेथिओनिन-repressible प्रमोटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है. प्लाज्मिड GIETZ एट से लिया गया था एक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए प्रत्येक तनाव में तब्दील हो गया था. अल, 1995:

  1. 25 मिलीलीटर ओ अपकेंद्रित्र 2 मिनट के लिए 4400 rpm पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में च लॉग चरण कोशिकाओं, दोहरा आसुत एच 2 0 (DDH 2 हे) के 500 μl के साथ धो लो, और supernate त्यागें.
  2. ते / LiAc (Tris-एचसीएल 10 मिमी, = पीएच 7.5, 1 मिमी EDTA, 0.1 एम लिथियम एसीटेट) के 250 μl में Resuspend कोशिकाओं. 20 मिनट के लिए मिश्रण के बिना 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. वाहक डीएनए के 5 मिलीलीटर (50 ग्राम) और प्लास्मिड डीएनए के 5 μl (0.1-5 ग्राम) के साथ एक नया ट्यूब सक्षम कोशिकाओं के 50 μl स्थानांतरण. खूंटी / ते / LiAc (ते / LiAc प्लस 40% पॉलीथीन ग्लाइकोल के रूप में ही) इस मिश्रण करने के 300 μl जोड़ें, और डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए 30 में सेते कोशिकाओं.
  4. 6 मिनट के लिए 42 पर इस मिश्रण और गर्मी झटका डिग्री सेल्सियस के लिए 1/10 मात्रा (v / v) DMSO के (36 μl) जोड़ें.
  5. 30 सेकंड और हटायें supernate के लिए 6000 rpm पर मिश्रण अपकेंद्रित्र. Uracil (अनुसूचित जाति URA) की कमी सिंथेटिक पूरा मीडिया पर बाँझ DDH 2 0 और प्लेट कोशिकाओं के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend.

2. FFL-GFP की प्रेरण

पहले गर्मी झटका प्रोटीन का बहुमत नव टर्मिनली उम्र बढ़ने से जुड़े सेलुलर अपर्याप्तता के कारण समय पर एकत्रित किया है कि प्रोटीन से बचने के लिए किया जाता है ताकि कोशिकाओं लॉग चरण में हैं, एक बार NT के "> FFL-GFP प्रेरित है.

  1. दिन 1: 30 पर अनुसूचित जाति URA के 5 मिलीलीटर में सेते कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस घूर्णन हे / एन
  2. दिन 2: उपाय आयुध डिपो के 600 और अनुसूचित जाति URA आयुध डिपो 600 ~ 0.2 से 5 मिलीलीटर में टीका लगाना ताजा संस्कृतियों.
  3. वे लॉग चरण आयुध डिपो 600 ~ 0.8-1.0 तक पहुँचने डिग्री सेल्सियस तक 30 में रोटेशन के साथ संस्कृतियों सेते हैं.
  4. DDH 2 0 से 500 μl में 3 मिनट, छानना supernate और resuspend सेल गोली के लिए 4400 rpm पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण समाधान.
  5. 6000 rpm पर अपकेंद्रित्र और supernate त्यागें.
  6. अनुसूचित जाति URA-मिले के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend. कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इस मीडिया में घूर्णन incubated किया जाना चाहिए
  7. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और दोहराने DDH 2 0 में धोने और supernate त्यागें.
  8. Resuspe100 माइक्रोग्राम / प्रोटीन अभिव्यक्ति रोकना, और चरण 3 के लिए तुरंत आगे बढ़ने के लिए cycloheximide की मिलीलीटर युक्त 5 मिलीलीटर अनुसूचित जाति URA मीडिया में एन डी कोशिकाओं.

3. Enzymatic FFL-GFP वसूली परख

यह परख एक जनसंख्या में सक्रिय एंजाइम का स्तर निर्धारित करने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण है.

  1. इस परख के लिए तैयार:
    1. प्रत्येक नमूने के लिए 600 आयुध डिपो के उपाय.
    2. डी luciferin की आवश्यक मात्रा में तैयार नमूनों की संख्या के आधार पर और replicates की संख्या अधिक ट्यूबिंग के लिए लगभग 1,200 μl वांछित जरूरत है. डी luciferin के अंतिम एकाग्रता कोशिकाओं के 100 μl ~ प्रति 23 ग्राम है. शुरू में यह 7.5 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर समाधान एकाग्रता में पानी में भंग कर रहा है और पहले प्रयोग करने के लिए 455 माइक्रोग्राम / अनुसूचित जाति में मिलीलीटर के लिए पतला. प्रत्येक नमूना डी luciferin इस्तेमाल किया जा रहा है की 2.4 मिलीलीटर के कुल में जिसके परिणामस्वरूप विश्लेषण किया गया के लिए चित्रा 2 में, तीन replicates.
    3. फ्लैश lumi के लिए कार्यक्रम प्लेट रीडरnescence परख (बायोटेक Gen5 "इंजेक्शन के साथ Luminescence फ्लैश परख" से अनुकूलित, अन्य उपकरणों के निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए)
      1. 30 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट
      2. , डी luciferin जोड़ने हिला, और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अच्छी तरह से पढ़ने के लिए प्लेट पाठक सेट करें.
      3. Luminescence पढ़ें (समापन बिंदु पढ़ने, 5 सेकंड एकीकरण के समय, 180 संवेदनशीलता स्तर)
      4. 5 मिनट के लिए प्रत्येक पढ़ने हिला के बीच वसूली परख के लिए 20 मिनट देरी, और एक अतिरिक्त 5 मिनट हिला.
      5. एक इंजेक्टर से डी luciferin के 50 μl बग़ैर.
  2. कोशिकाओं प्रोटीन संश्लेषण को रोकने के लिए cycloheximide युक्त मीडिया को जोड़ रहे हैं के बाद पहले से गरम झटका luminescence के तुरंत मापा जाता है.
    1. एक ठोस सफेद 96 अच्छी तरह से थाली में replicates की वांछित संख्या के साथ प्रत्येक नमूने के लिए कोशिकाओं के 100 μl स्थानांतरण.
    2. नियंत्रण एक पानी खाली और एक खाली वेक्टर युक्त कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए.
    3. विशेष के साथ पढ़ने के लिए प्रारंभcifications ऊपर सूचीबद्ध.
  3. FFL-GFP की FFL के आधा भाग denature करने के लिए, 42 पर एक गिलास संस्कृति ट्यूब में 5 मिलीलीटर संस्कृति सेते ° सी 25 मिनट के लिए मिलाते हुए.
  4. कोशिकाओं समय बिंदु शून्य है जो इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं के बाद रिकवरी परख luminescence रीडिंग तुरंत शुरू करते हैं. पहली बार बिंदु और 90 मिनट के लिए हर 30 मिनट के लिए ऊपर वर्णित के रूप में एक ही उपाय luminescence.
  5. आयुध डिपो के 600 (600 आयुध डिपो द्वारा पहले से गरम झटका मूल्यों विभाजित) के आधार पर समायोजित कर दिया गया है कि पहले से गरम झटका luminescence के मूल्यों के नमूने मानक के अनुसार.

4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

यह परख कोशिकाओं की आबादी में समय के साथ समुच्चय के solubilization निर्धारित करने के लिए एक अर्द्ध मात्रात्मक विधि है.

  1. प्रेरण धारा 2 में वर्णित के रूप में एक ही है, प्रोटोकॉल के 1-8 कदम.
  2. एक ही समय अंक (धारा 3, 4) ऊपर वर्णित के रूप में लिया, लेकिन कर रहे हैं mic के लिएroscopy 1 पहले से गरम सदमे में कोशिकाओं की मिलीलीटर और प्रत्येक वसूली समय बिंदु, और डिग्री सेल्सियस संस्कृति ट्यूब में 30 में घूर्णन सेते नमूने इकट्ठा.
  3. दृश्य:
    1. 30 सेकंड और हटायें supernate के लिए 6000 rpm पर कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र.
    2. DDH 2 ओ के 2 μl में resuspend सेल गोली
    3. कोशिकाओं के साथ साथ स्लाइड पर 2% कम पिघल agarose के 2 μl के 2 μl मिक्स और एक कवर पर्ची जोड़ें. कोशिकाओं का एक ही विमान प्राप्त करने के लिए हल्के से कवर पर्ची के केंद्र में उंगली नीचे प्रेस और कवर पर्ची ले जाने के लिए मुश्किल है जब तक बारी बारी से.
    4. कोशिकाओं फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर 100X तेल उद्देश्य का उपयोग कल्पना कर रहे हैं; GFP प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए कोशिकाओं और FITC फिल्टर कल्पना करने के लिए जिला उद्योग केंद्र का उपयोग करें.
    5. Quantitation के लिए हर समय बिंदु पर प्रत्येक तनाव के लिए कई तस्वीरें ले लो. चित्रों के लिए फील्ड्स मात्रात्मक बाद प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए ~ 15-30 कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए.
    6. समुच्चय युक्त कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करने के लिए, 50 गिनती-100 कोशिकाओं कुल और समुच्चय युक्त कोशिकाओं की संख्या में विभाजित है.

5. सिंगल सेल माइक्रोस्कोपी

इस विधि समय पर एक ही सेल में व्यक्तिगत समुच्चय के solubilization पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. धारा 2 में वर्णित के रूप में FFL-GFP अभिव्यक्ति प्रेरित, 1-8 कदम.
  2. बाद गर्मी झटका, 2 मिनट के लिए 4400 rpm पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं.
  3. DDH 2 ओ के 20 μl में पानी और resuspend के 500 μl के साथ कोशिकाओं को धो लें
  4. प्रत्येक तनाव के लिए, एक अनुसूचित जाति URA अगर प्लेट की एक 5x5 मिमी अनुभाग बाहर कटौती और पेट्री डिश, पिपेट टिप के साथ अगर की सतह के आसपास की कोशिकाओं और प्रसार के μl विंदुक 4 के साथ संपर्क में था कि सतह का उपयोग कर. ~ 1 मिनट के लिए खड़े हैं.
  5. एक ~ 55 मिमी गिलास नीचे पकवान सं 0 पर चेहरा नीचे अगर घन खंड जगह है और हल्के से नीचे प्रेस करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें.
  6. दृश्य:
    1. संप्रदाय में मैं-III देखेंआयन 4.
    2. सेट संस्कृति के घनत्व के आधार पर प्रत्येक तनाव के लिए 2-4 फोकल प्वाइंट के लिए निर्देशांक.
    3. (- एक 0.5-1.0 माइक्रोन टुकड़ा मोटाई के साथ + / 15 माइक्रोन) एक 90 मिनट की अवधि के लिए हर 5 मिनट उचित सीमा के साथ एक जेड के ढेर के साथ तस्वीरें लेने के लिए कैमरा सेट.

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Representative Results

खमीर disaggregase पर निर्भर है, Hsp104 कुशलतापूर्वक गर्मी विकृत प्रोटीन refold लिए. FFL-GFP की गतिविधि एक luminescence फ्लैश परख चित्रा 1 का उपयोग कर, एक 25 मिनट गर्मी के झटके के बाद नजर रखी थी. चित्रा 2 में दिखाया गया है तो यह स्वचालित परख के परिणाम अंततः WT कोशिकाओं में एक> 80% वसूली के लिए नेतृत्व किया है कि 90 मिनट से अधिक गतिविधि में एक stepwise वृद्धि का पता चला. hsp104Δ तनाव एक ही समय सीमा से अधिक मूल गतिविधि के 19% बरामद. इसके अलावा, प्रारंभिक निष्क्रियता की हद Hsp104 दौरान FFL-GFP denaturing साथ तेजी सहयोगियों एक सुरक्षात्मक भूमिका पूर्व तनाव की सेवा, या हो सकता है सुझाव है कि निगरानी उत्परिवर्ती तनाव (WT में 26% गतिविधि और hsp104Δ में 11%) में बहुत अधिक था थर्मल निष्क्रियता कदम एंजाइम गतिविधि के नुकसान को कम करने के लिए.

जनसंख्या माइक्रोस्कोपी enzymatic गतिविधि परख पुष्टि की. Hsp104D उत्परिवर्ती रणनीति में लगभग सभी कोशिकाओंअनुरक्षित में कम से कम एक FFL-GFP के कुल गर्मी झटका के बाद 90 मिनट (चित्रा 3) के भीतर 62% की कमी हुई है जो गुम्मट तनाव में समुच्चय की संख्या की तुलना में. समुच्चय के एक पर्याप्त संख्या में दोनों उपभेदों में गर्मी झटका के बाद तुरंत गठन जबकि hsp104Δ कोशिकाओं नमूदार puncta को खाली करने में विफल रहा है, जबकि समुच्चय युक्त गुम्मट कोशिकाओं की संख्या में तेजी से कमी आई है. इन आंकड़ों hsp104Δ तनाव में कम से कम 8% वसूली बनाम गुम्मट में गतिविधि का एक 52% वसूली से पता चला है जो गतिविधि परख, पुष्टि.

सिंगल सेल स्वचालित माइक्रोस्कोपी hsp104Δ तनाव बनाम WT कोशिकाओं में, FFL-GFP (; FFL-GFP के फिर से solubilization के समय चूक श्रृंखला के लिए पूरक फिल्में देखने के प्रतिनिधि अभी भी चित्र चित्रा 4 में दिखाया गया है) एक उच्च दर पर solubilized था कि पता चला. इसके अलावा, प्रोटीन समुच्चय की गतिशीलता बहुत अलग थे, गुम्मट कोशिकाओं में समुच्चय हो फ्यूज करने की प्रवृत्ति सामने solubilized किया जा रहा है, और इस hsp104Δ तनाव में नहीं देखा गया. यह परख अन्य दो तरीकों से परिणाम का समर्थन करता है, लेकिन यह भी एकत्रित प्रोटीन solubilized और refolded है के लिए एक संभव तंत्र में अंतर्दृष्टि का पता चलता है न ही.

चित्रा 1
चित्रा 1. FFL-GFP गर्मी झटका वसूली परख के योजनाबद्ध. FFL-GFP अभिव्यक्ति अनुसूचित जाति URA में incubated किया गया है कि कोशिकाओं में लॉग चरण में प्रेरित किया है. में सेते कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुसूचित जाति URA-मिले 1 घंटे के लिए. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और अनुसूचित जाति URA 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide (CHX) युक्त में resuspend. गर्मी झटका के लिए, 25 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं. कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा ठीक करने की अनुमति दें एक 90 मिनट के समय के पाठ्यक्रम के लिए नमूने ले लीजिए. एंजाइमी assays के लिए डी luciferin प्रत्येक पढ़ने से पहले जोड़ा जाता है.रेफरी = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. WT और hsp104Δ कोशिकाओं (100 μl) की FFL-GFP एंजाइमी refolding / वसूली परख. नमूने गर्मी सदमे से पहले एकत्र और तुरंत हर समय बिंदु (0, 30, 60, और 90 मिनट) के लिए गर्मी झटका के बाद किया गया. तीन प्रत्येक नमूने की replicates हर समय बिंदु के लिए एक 96 अच्छी तरह से सफेद प्लेट के कुओं में aliquoted थे. रीडिंग के लिए, प्लेट रीडर luminescence के 30 में 90 मिनट के लिए हर 30 मिनट डिग्री सेल्सियस को मापने के लिए स्थापित किया गया था

चित्रा 3 <br /> चित्रा 3. FFL-GFP refolding माइक्रोस्कोपी. हर समय बिंदु (पूर्व एच एस, 0, 30, 60, और 90 मिनट) पर कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर एकत्र और centrifuged थे. Supernate aspirated था और कोशिकाओं पानी के 2 μl में resuspended थे. कोशिकाओं को कम पिघल agarose के 2 μl के साथ मिश्रण से तैयार किया गया. कोशिकाओं 100X तेल उद्देश्य का उपयोग कल्पना कर रहे थे. हर समय बिंदु के प्रतिनिधि छवियाँ दिखाई जाती हैं. Quantitation 4-5 क्षेत्रों में कोशिकाओं की गिनती और कोशिकाओं से युक्त समुच्चय के प्रतिशत (एन ~ 100) की गणना के द्वारा किया गया था.

चित्रा 4
चित्रा 4. एकल कोशिका FFL-GFP के माइक्रोस्कोपी समय पाठ्यक्रम refolding. कोशिकाओं की पोस्ट गर्मी झटका 5 मिलीलीटर, एकत्र centrifuged, और DDH 2 ओ के 20 μl में resuspended थे कोशिकाओं के 4 μl एक 5 मिमी 2 पर रखा गया

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Discussion

इस अनुच्छेद में मॉडल प्रोटीन FFL-GFP के खमीर disaggregase, Hsp104 प्रोटीन पुनः solubilization और मरम्मत के लिए योगदान देता है कि दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एंजाइमी assays और माइक्रोस्कोपी विभिन्न refolding दक्षता और उपज का निर्धारण करने के लिए एक ही सब्सट्रेट प्रोटीन का दर्जा पूछताछ की. एंजाइमी वसूली assays के परिणाम अक्षम hsp104D उत्परिवर्ती तनाव में अधिक से अधिक वसूली की है कि न केवल सुझाव है, लेकिन खुलासा तनाव की प्रारंभिक परिमाण उत्परिवर्ती तनाव (चित्रा 2) में अधिक से अधिक था. विश्लेषण भी hsp104D कोशिकाओं की मरम्मत का प्रयास किया जा दिखाई दिया, जबकि वे के रूप में जल्दी गुम्मट कोशिकाओं के रूप में प्रोटीन refold करने में असमर्थ थे कि पता चलता है. इस विधि में इस प्रोटीन की मरम्मत में Hsp104 की अनिवार्य भूमिका खुलासा FFL-GFP गतिविधि के संवेदनशील और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति दी.

माइक्रोस्कोपी परिणाम विकृत FFL के एंजाइम की अक्षम मरम्मत के कारण टी कारण है कि सुझावओ प्रोटीन समुच्चय के भीतर फँसाने. जनसंख्या विश्लेषण Hsp104 कमी कोशिकाओं में, कोई कोशिकाओं को पूरी तरह से 90 मिनट (चित्रा 3) में सभी समुच्चय साफ हो सकता है कि पता चला है. इसके अलावा, एकल कोशिका विश्लेषण व्यापक ढांचे में छोटे समुच्चय की कि समेकन सुझाव समुच्चय समय के साथ फ्यूज, (चित्रा 4) की मरम्मत और refolding प्रक्रिया में सहायता कर सकते हैं कि पता चला. इस परिणाम अभी भी चित्र से स्पष्ट नहीं है, समय चूक फिल्मों एक स्वतंत्र समुच्चय के गतिशील व्यवहार का पालन करने की अनुमति देते हैं. समय के पाठ्यक्रम पर समुच्चय के अवलोकन से इन कोशिकाओं के रूप में कुशलता से बड़ा संरचनाओं फार्म नहीं है कि यह दर्शाता है और Hsp104 प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण के इस पहलू के लिए आवश्यक है, सुझाव है कि hsp104Δ तनाव में कुल संलयन कमी आई खुला. एक और अटकलें कोशिकाओं अतिरिक्त disaggregation और मरम्मत मीटर शामिल कर सकते हैं, जो इन बड़े समुच्चय से अधिक तेजी से प्रोटीन solubilize सकता हैachinery. एकल कक्ष माइक्रोस्कोपी भी अन्य संरक्षिकाओं और सह संरक्षक बड़े बनाम छोटे समुच्चय में मौजूद हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और इस मुक़ाम पैटर्न समय के साथ बदलता है तो किया जा सकता है.

एक साथ इन तरीकों जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन refolding और मरम्मत के जैव रासायनिक और सेल दोनों जैविक विश्लेषण की अनुमति. वर्णित तीन तरीकों से परिणाम की एकता गर्मी झटका proteotoxic के बाद सेलुलर वसूली के कैनेटीक्स और दक्षता में बहु - आयामी अंतर्दृष्टि देता है. बड़ा नमूना आकार और जैविक मजबूती और परिणाम में परम आत्मविश्वास में वृद्धि, एक भी प्रयोग में replicates के लिए प्रोटोकॉल में कदम से कुछ या सभी का ऑटोमेशन भी अनुमति देता है. इसके अलावा, इन तरीकों में सैद्धांतिक रूप से मानव कोशिकाओं में और आनुवंशिक विश्लेषण के लिए न केवल उपयोग करने के लिए, लेकिन यह भी Proteostasis बदल कि रसायनों की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम KAM और हम भी FFL प्रदान करने के लिए टोरंटो विश्वविद्यालय में जॉन ग्लोवर धन्यवाद JLA को माइक्रोबायोलॉजी रॉबर्ट डी. वाटकिंस ग्रेजुएट छात्र रिसर्च फैलोशिप के एक अमेरिकी सोसायटी के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIGMS-074696) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया -GFP के स्रोत प्लाज्मिड.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base Fisher BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate Sigma L6883
PEG (polyethelene glycol) Fisher BP233-1
EDTA Fisher BP120-1
DMSO Malinckrodt 4948
SC Sunrise 1300-030
SC-URA Sunrise 1306-030
cycloheximide Acros Organics 357420050
D-luciferin Sigma L9504
low melt agarose NuSieve 50082
immersion oil Cargille 16484

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References

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में निगरानी प्रोटीन refolding के लिए युग्मित Assays<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Abrams, J. L., Morano, K. A. Coupled … More

Abrams, J. L., Morano, K. A. Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (77), e50432, doi:10.3791/50432 (2013).

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