Summary
Denna artikel beskriver användningen av en eldflugeluciferas-GFP fusionsprotein för att undersöka
Abstract
Proteostasis, definieras som de kombinerade processerna protein folding / biogenes är omveckning / reparation, och förnedring, en delikat cellulär balans som måste upprätthållas för att undvika skadliga konsekvenser 1. Yttre eller inre faktorer som stör denna balans kan leda till proteinaggregation, toxicitet och celldöd. Hos människor är detta en stor bidragande faktor till de symptom i samband med neurodegenerativa sjukdomar såsom Huntingtons, Parkinsons och Alzheimers sjukdomar 10. Det är därför väsentligt att de proteiner som är involverade i upprätthållande av proteostasis identifieras för att utveckla behandlingar för dessa försvagande sjukdomar. I artikeln beskrivs tekniker för övervakning in vivo protein folding vid nära-realtid upplösning med hjälp av modellen protein eldflugeluciferas smält till grönt fluorescerande protein (FFL-GFP). FFL-GFP är en unik modell chimär protein som FFL delen är extremt känslig för stress-induced misfolding och aggregering, som inaktiverar enzymet 12. Luciferasaktivitet övervakas med användning av en enzymatisk analys, och GFP-delen tillhandahåller en metod för att visualisera lösliga eller aggregerade FFL använder automatiserad mikroskopering. Dessa kopplade metoder innehåller två parallella och tekniskt oberoende metoder för att analysera både tillbakaveckning och funktionell återaktivering av ett enzym efter stress. Aktivitet återhämtning kan direkt korrelerad med kinetik disaggregation och re-solubilisering att bättre förstå hur protein kvalitetskontroll faktorer såsom protein följeslagare samarbetar för att utföra dessa funktioner. Dessutom kan gendeletioner eller mutationer användas för att testa bidrag av specifika proteiner eller subenheter protein till denna process. I denna artikel kommer vi att granska inläggen av proteinet disaggregase Hsp104 13, känd för att samarbeta med den Hsp40/70/nucleotide utbyte faktor (NEF) omveckning systemet 5, till Proteinåterveckningssteg att validera denna metod.
Introduction
Hos människor neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar har kopplats till proteiners ansamling och aggregering 10. Celler använder molekylära följeslagare att förhindra kinetisk fångst av cellulära proteiner i felveckade inaktiva strukturer 6. Chaperoner deltar i intrikata samspel nätverk inom cellen, men det är inte helt klarlagt hur summan av dessa interaktioner bidrar till organismal proteostasis. En av de viktigaste följeslagare som ansvarar för majoriteten av cytosolproteinet vikning är 70 kD värmechockproteinet (Hsp70) familj 19. Det har visats att i jäst förlust av Hsp70 minskar förmågan att vika nascent heterologt uttryckt FFL och att återvecka det endogena proteinet, ornitin transcarbamoylase, in vivo 18, 7. Förmågan att analysera vikning med nära-realtid upplösning kommer att underlätta förståelsen hur ytterligare cellulära faktorer fortsribute till denna Hsp70-beroende process. Dessutom kan vika / återvikning reaktioner inte vara helt beroende av dessa bidragande proteiner, så analyser måste vara tillräckligt känsliga för att upptäcka både stora och små förändringar i kinetik och effektivitet.
Jästcellen disaggregase, Hsp104, spelar en viktig roll för att reparera aggregerade felveckade proteiner. Även Hsp104 homologer har identifierats i svampar och växter, verkar denna familj att vara frånvarande i metazoans. Det har föreslagits att andra följeslagare, såsom de i Hsp110 familjen utföra en del av de kända Hsp104 aktiviteter i däggdjur 16. Hsp104 är en AAA +, hexamert protein komplex som fungerar i jäst till aggregat omforma protein, som bidrar till omveckning och reparation 13. Hsp104, tillsammans med jästen Hsp70, Ssa1, och jästen Hsp40, Ydj1, krävs för återvinning av denaturerat FFL i jästceller 5, 8. Den lilla värmechockprotein, Hsp26, har också visat sig vara requirött för Hsp104-medierad indelning av FFL 2.
FFL är en två-domän protein som binder substratet luciferin i det aktiva sätet och efter en strukturförändring som kräver ATP och syre, dekarboxylerar substratet släppa oxyluciferin, koldioxid (CO 2), adenosinmonofosfat (AMP), och ljus 11, 9, 3. Den kommersiellt tillgängliga FFL substrat, D-luciferin, resulterar i ljusemission mellan 550-570 nm som kan detekteras med hjälp av en luminometer 15. FFL är extremt känsligt för denaturering från kemiska eller värmebehandlingar och aggregat snabbt vid utspelas. När de utsätts för temperaturer mellan 39-45 ° C FFL är reversibelt utfälld och inaktiverat 12. Däremot GFP och dess derivat är mycket motståndskraftiga mot protein utspelas påkänningar 14. Därför sammansmältning av dessa två proteiner tillåter FFL att fungera som en experimentellt labil del med förmåga att rikta funktionell GFP till intracellulära avlagringar som kan visualiseras med hjälp av fluorescens mikroskopi hos både befolkningen och enskilda nivåerna cell. Tillämpning av enzymatisk analys i en semi-automatiserad multimode plattläsare kombination med automatiserad mikroskopering ger oöverträffad samtidig bedömning av kinetik och avkastning av återveckning reaktioner. Dessutom tillåter den enkla molekylära genetiken av modellen eukaryoten Saccharomyces cerevisiae både exakt manipulering av proteinet kvalitetskontroll nätverk och möjlighet till upptäckt-baserade metoder för att identifiera nya spelare som bidrar till cellulär stress och proteostasis.
I denna studie, vildtyp (WT) och Hsp104 deletion stammar som uttrycker FFL-GFP är föremål för protein denaturering värmechock. FFL-GFP refolding följs upp genom både en enzymatisk analys och mikroskopi som en proxy avläsning för reparation av det uttryckta proteomet över en återhämtning tidsförlopp. Vid jämförelse med WT-celler, visar vi the Hsp104 radering stam är ~ 60% mindre effektiva på återveckning FFL-GFP, stöder tidigare fynd om inrättande av en roll för Hsp104 i reaktivering av denaturerat FFL 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Konstruktion av stammar innehållande FFL-GFP plasmid
För denna studie var Saccharomyces cerevisiae stam BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) används tillsammans med en Hsp104 deletion stam från jästen knockout samlingen (Open Biosystems / Thermo Scientific). Deletionen bekräftades med användning av en Hsp104-specifik antikropp för Western blot-analys.
FFL-GFP uttrycktes från p426MET25-FFL-GFP, tillverkad av ett LEU2-baserad källa plasmid erhållen från Glover laboratoriet vid universitetet i Toronto 17 och kan erhållas på begäran till författarna. Expression av FFL-GFP plasmid fusionsprotein styrs av MET25 metionin-undertryckbar promotor. Den plasmid transformerades in i varje stam med ett protokoll som var anpassad från Gietz et. al, 1995:
- Centrifugera 25 ml O f logfas celler i ett 50 ml koniskt rör vid 4400 rpm under 2 min, tvätta med 500 pl dubbelt destillerat H 2 0 (DDH 2 O), och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 250 | il TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M litiumacetat). Inkubera vid 30 ° C utan blandning under 20 min.
- Överför 50 pl av kompetenta celler till ett nytt rör tillsammans med 5 ml (50 ng) av bärar-DNA och 5 | il (0.1-5 pg) av plasmid-DNA. Tillsätt 300 pl av PEG / TE / LiAc (samma som TE / LiAc plus 40% polyetylenglykol) till denna blandning, och inkubera cellerna vid 30 ° C i ytterligare 30 min.
- Tillsätt 1/10 volym (vol / vol) DMSO (36 | il) till denna blandning och värmechock vid 42 ° C under 6 min.
- Centrifugera blandningen vid 6000 rpm under 30 sek och ta bort supernatanten. Resuspendera cellerna i 100 | il av sterila DDH 2 0 och platta celler på syntetiskt fullständigt medium som saknade uracil (SC-URA).
2. Induktion av FFL-GFP
nt "är> FFL-GFP inducerad gång cellerna är i log-fas så att majoriteten av proteinet före värmechock nyligen har gjorts för att undvika proteiner som terminalt har aggregerats över tid på grund av åldrande-associerade cellulära brister.- Dag 1: Inkubera cellerna i 5 ml SC-URA vid 30 ° C roterande O / N.
- Dag 2: Mät OD 600 och inokulera färska kulturer i 5 ml SC-URA OD 600 ~ 0,2.
- Inkubera kulturer med rotation vid 30 ° C tills de når OD logfas 600 ~ 0,8-1,0.
- Centrifugera cellerna i 15 ml koniska rör vid 4400 rpm under 3 min, dekantera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 500 | il av ddHaO 2 0, överföring lösning till ett mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 6000 rpm och kassera supernatanten.
- Resuspendera celler i 5 ml SC-URA-MET. Celler skall inkuberas roterar i detta medium under 1 timme vid 30 ° C.
- Centrifugera cellerna och upprepa tvätta i DDH 2 0 och kassera supernatanten.
- Resuspend celler i 5 ml SC-URA media innehållande 100 pg / ml cykloheximid att hämma protein expression, och omedelbart gå till steg 3.
Tre. Enzymatisk FFL-GFP Recovery-analys
Denna analys är en kvantitativ metod för att bestämma nivåerna av aktivt enzym i en population.
- Förberedelse för denna analys:
- Mät OD 600 för varje prov.
- Förbered nödvändiga mängden av D-luciferin behov baserat på antalet sampel och önskat antal replikat plus cirka 1200 | il för slangen. Slutlig koncentration av D-luciferin är ~ 23 pg per 100 | il av celler. Initialt det är upplöst i vatten vid en stamlösning koncentration av 7,5 mg / ml och späddes till 455 | ig / ml i SC före experimentet. I figur 2, tre replikat för varje prov analyserades vilket resulterade i totalt 2,4 ml D-luciferin som används.
- Program plattläsaren för flash luminescence assay (anpassad från BioTek Gen5 "Luminescence Flash-analys med Injection", för andra instrument följa tillverkarens anvisningar)
- Ställ temperaturen till 30 ° C
- Ställ plattläsaren att lägga D-luciferin, skaka, och läsa varje brunn individuellt.
- Läs luminiscens (endpoint läsning, 5 sek integration tid, 180 känsligheten)
- För återhämtning assay mellan varje avläsning skaka i 5 min, fördröja 20 min och skaka i ytterligare 5 min.
- Dispensera 50 pl av D-luciferin från en injektor.
- Värm-chock luminiscens mäts omedelbart efter celler läggs till media innehållande cykloheximid att stoppa proteinsyntesen.
- Överför 100 | il av celler för varje prov med önskat antal replikat till en fast vit platta med 96 brunnar.
- Kontrollerna bör omfatta en vatten tomt och celler som innehåller en tom vektor.
- Börja läs med specifications anges ovan.
- För att denaturera FFL delen hos FFL-GFP, inkubera 5 ml kultur i en glas odlingsrör vid 42 ° C skakning under 25 min.
- Recovery assay luminiscens avläsningar inledas omedelbart efter celler avlägsnas från inkubatorn, vilket är tidpunkten noll. Mät luminiscens samma som beskrivits ovan för den första tidpunkten och varje 30 min under 90 min.
- Normalisera prover att förvärma-chock luminiscens värden som har justerats utifrån OD 600 (dela förvärmning chock värden genom OD 600).
4. Fluorescensmikroskopi
Denna analys är en semikvantitativ metod för att bestämma solubilisering av aggregaten över tiden i en population av celler.
- Induktion är densamma som beskrivs i avsnitt 2, steg 1-8 av protokoll.
- Samma tidpunkter tas som beskrivits ovan (avsnitt 3, Steg 4), men för microscopy samla 1 ml av celler vid förvärmning-chock och varje återhämtning tidpunkt, och inkubera proverna roterar vid 30 ° C i kulturen röret.
- Visualisering:
- Centrifugera 1 ml av celler vid 6000 rpm i 30 sek och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 2 pl DDH 2 O.
- Blanda 2 pl celler plus 2 mikroliter av 2% låg smältpunkt agaros på bilden och lägg ett täckglas. För att erhålla ett enda plan av celler lätt trycka fingret nedåt i centrum av locket glida och rotera tills locket glida är svåra att flytta.
- Celler är visualiseras med 100X olja mål på fluorescerande mikroskop, använder DIC att visualisera celler och FITC-filter för att visualisera GFP fluorescens.
- Ta flera bilder för varje stam vid varje tidpunkt för kvantifiering. Fält för bilder bör innehålla ~ 15-30 celler för kvantitativ post-experimentell analys.
- För att beräkna andelen celler innehållande aggregat, räkna 50-100 Celler totalt och dela antalet celler som innehåller aggregat.
Fem. Single Cell Mikroskopi
Denna metod används för att följa solubiliseringen av enskilda aggregat i en enda cell med tiden.
- Framkalla FFL-GFP uttryck som beskrivs i avsnitt 2, steg 1-8.
- Efter värme-chock, centrifugera celler i 15 ml koniska rör vid 4400 rpm under 2 min.
- Tvätta cellerna med 500 | il vatten och återsuspendera i 20 | il ddHaO 2 O.
- För varje stam, skär ut en 5x5 mm sektion av en SC-URA agarplatta och använda ytan som var i kontakt med petriskål, pipett 4 il celler och sprids runt ytan av agar med pipett spets. Låt stå i ca 1 minut.
- Använd pincett för att placera avsnittet agar kub nedåt på en ~ 55 mm glas nedre skålen nr 0 och tryck ner lätt.
- Visualisering:
- Se I-III i Section 4.
- Set-koordinater för 2-4 kontaktpunkter för varje stam beroende på tätheten av kulturen.
- Ställ kameran för att ta bilder med en Z-stack med lämpliga intervall (- / + 15 um med en 0,5-1,0 um slice tjocklek) var 5 min under en 90 minuters period.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jäst är beroende av disaggregase, till Hsp104 återvecka effektivt värme-denaturerade proteiner. Aktiviteten av FFL-GFP övervakades efter en 25 min värmechock, med hjälp av en analys luminiscens flash Figur 1. Resultaten av denna automatiserat analysinstrument som visas i figur 2 avslöjade en stegvis ökning i aktivitet över 90 min som slutligen ledde till en> 80% återhämtning i WT-celler. Den hsp104Δ stammen återhämtade 19% av den ursprungliga aktiviteten under samma tidsram. Vidare var omfattningen av inledande inaktivering mycket högre i kaperonet mutant stam (26% aktivitet i WT och 11% i hsp104Δ) vilket antyder att Hsp104 kan betjäna en skyddande roll förspänning eller snabbt associerar med denaturerande FFL-GFP under termisk inaktivering steg för att minska förlust av enzymaktivitet.
Befolkning mikroskopi bekräftade den enzymatiska aktiviteten analysen. Nästan alla celler i hsp104D mutanten strai kvar åtminstone en FFL-GFP aggregat jämfört med antalet av aggregat i WT-stammen, som minskade med 62% inom 90 min efter värmechock (Figur 3). Medan ett stort antal aggregat bildas omedelbart efter värmechock i båda stammarna, minskade antalet WT-celler innehållande aggregat snabbt medan hsp104Δ celler misslyckades med att rensa den observerbara puncta. Dessa data bekräftar aktivitetsanalysen, som visade en 52% återhämtning av aktiviteten i WT kontra en minimal 8% återvinning i hsp104Δ stammen.
Single cell automatiserad mikroskopering avslöjade att i WT celler kontra hsp104Δ stammen, var FFL-GFP solubiliseras vid en högre hastighet (representativa stillbilder visas i figur 4, se kompletterande filmer för time-lapse serien FFL-GFP re-solubilisering). Dessutom var dynamiken i proteinaggregaten mycket olika, i WT-celler aggregat tenderade att smälta vara därför är upplöst, och det har inte observerats i hsp104Δ stammen. Denna analys inte bara stöder resultaten från de två andra metoderna, men avslöjar också inblick i en möjlig mekanism för hur den aggregerade proteinet solubiliseras och återveckas.
Figur 1. Schematisk av FFL-GFP värmechock återhämtning analysen. FFL-GFP-uttryck induceras i log-fas i celler som har inkuberats i SC-URA. Att inducera celler inkubera i SC-URA-MET i 1 timme. Centrifugera cellerna och återsuspendera i SC-URA innehållande 100 | ig / ml cykloheximid (CHX). För värme-chock, inkubera cellerna vid 42 ° C i 25 min. Låt cellerna att återhämta sig genom inkubation vid 30 ° C. Samla prover för en 90 min tidsförlopp. För enzymatiska analyser D-luciferin tillsätts före varje avläsning.ref = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. FFL-GFP enzymatiska återveckning / återvinning analys. Prover av WT och hsp104Δ celler (100 | il) uppsamlades före värmechock och omedelbart efter värmechock för varje tidpunkt (0, 30, 60, och 90 min). Tre replikat av varje prov alikvoterades i brunnar i en 96-brunnars vit platta för varje tidpunkt. För avläsningar var plattläsare inställd att mäta luminiscens var 30 min under 90 min vid 30 ° C.
<br /> Figur 3. FFL-GFP återveckning mikroskopi. Var 1 ml celler vid varje tidpunkt (pre-HS, 0, 30, 60, och 90 min) uppsamlades och centrifugerades. Supernatanten sögs av och cellerna återsuspenderades i 2 | il vatten. Celler bereddes genom blandning med 2 | il av lågsmältande agaros. Cellerna visualiserades med 100X olja mål. Representativa bilder av varje tidpunkt visas. Kvantifiering gjordes genom att räkna celler i 4-5 områden och beräkna procent av celler som innehåller aggregat (n ~ 100).
Figur 4. Enda cell återveckning kurs mikroskopi tid av FFL-GFP. Post värmechock 5 ml celler uppsamlades, centrifugerades och återsuspenderades i 20 | il ddHaO 2 O. 4 | il av celler placerades på en 5 mm 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln modellen protein FFL-GFP användes för att visa att jästen disaggregase, bidrar Hsp104 till protein re-upplösning och reparation. De enzymatiska analyser och mikroskopi utfrågas differentiellt status för samma substrat-proteinet för att bestämma återveckning effektivitet och utbyte. Resultat av de enzymatiska återhämtning analyserna tyder på att inte bara är den maximala återhämtningen i hsp104D mutantstammen ineffektiv, men den initiala storleken hos den pågående spänningen var större i den mutanta stammen (figur 2). Analysen visar också att medan hsp104D celler verkade vara att försöka reparera, kunde de inte återvecka proteinet så snabbt som WT celler. Denna metod tillät känslig och kvantitativ analys av FFL-GFP aktivitet avslöjar den viktiga roll Hsp104 i reparation av detta protein.
Mikroskopi resultat tyder på att orsaken till den ineffektiva reparation av denaturerat FFL enzym beror to protein svällning inom aggregat. Befolkningen Analysen visade att celler som saknar Hsp104, kunde inga celler helt klart alla aggregat i 90 minuter (Figur 3). Dessutom avslöjade de encelliga analyser som aggregat säkring över tiden, vilket tyder på att konsolideringen av mindre aggregat till större strukturer kan hjälpa reparation och återveckningen process (Figur 4). Även detta resultat är inte självklart från stillbilder, tidsförlopp filmer kan man följa det dynamiska beteendet av oberoende aggregat. Observation av aggregat över tidsförloppet avtäckt minskade sammanlagda fusion i hsp104Δ-stammen, vilket indikerar att dessa celler inte bildar de större strukturer så effektivt och tyder på att Hsp104 krävs för denna aspekt av protein kvalitetskontroll. En ytterligare spekulationer är att celler kan solubilisera protein snabbare från dessa större aggregat, som dessutom kan innehålla disaggregeringen och reparation machinery. Encelliga mikroskopi kan också användas för att bestämma om andra chaperoner och co-chaperones är närvarande i de större kontra mindre aggregat, och om detta residency mönstret varierar över tiden.
Tillsammans har dessa metoder tillåter både biokemiska och cellbiologiska analyser av Proteinåterveckningssteg och reparation i levande celler. Integrering av resultaten från de tre metoder som beskrivs ger flerdimensionell insikt i kinetik och effektivitet cellulär återhämtning efter proteotoxic värmechock. Automatisering av några eller alla steg i protokollet tillåter också större provstorlekar och biologiska replikerar i ett givet experiment, ökar robusthet och ultimat förtroende för resultatet. Dessutom teoretiskt dessa metoder kan utvidgas till användning i humana celler och inte bara för genetiska analyser, men också för att undersöka kemikalier som förändrar proteostasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (NIGMS-074.696) till KAM och en American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship till JLA Vi tackar också John Glover vid universitetet i Toronto för att tillhandahålla FFL -GFP källa plasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L.
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
