Summary
この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載
Abstract
タンパク質の折り畳み/生物発生、リフォールディング/修復、および劣化の複合プロセスとして定義さProteostasisは、有害な結果1を回避するために維持されなければならない微妙な携帯バランスです。このバランスを崩壊させる外部または内部の要因は、タンパク質凝集、毒性および細胞死につながる可能性がある。ヒトでは、このようなハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患10に関連した症状の主要な要因である。それはproteostasisの維持に関与するタンパク質は、これらの衰弱性疾患の治療法を開発するために識別されることが不可欠である。この記事は、緑色蛍光タンパク質（FFL-GFP）を融合したモデルタンパク質ホタルルシフェラーゼを用いた準リアルタイム分解能で生体内でタンパク質のフォールディングに監視するためのテクニックについて説明します。 FFL部分がストレス誘発mと非常に敏感であるようにFFL-GFPは、ユニークなモデルキメラタンパク質である酵素12を不活性化isfoldingと集約、。ルシフェラーゼ活性は、酵素アッセイを用いてモニターし、GFP部分は、自動顕微鏡を用いて可溶性または集約FFLを可視化する方法を提供する。これらの結合の方法は、リフォールディング、ストレス後の酵素の機能的再活性化の両方を分析するために二つの平行及び技術的に独立したアプローチを採用しています。活性回収を直接良好ようなシャペロンタンパク質などのタンパク質の品質管理因子がこれらの機能を実行するために協力する方法を理解するために分解し、再可溶化の動態と相関させることができる。また、遺伝子欠失又は突然変異がこのプロセスに特定のタンパク質またはタンパク質サブユニットの寄与をテストするために使用することができる。この記事では、このアプローチを検証するために、タンパク質リフォールディングに、システム5リフォールディングHsp40/70/nucleotide交換因子（NEF）と提携して知られているタンパク質disaggregase Hsp104の13の貢献を検討する。
Introduction
ヒトでは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングとアグリゲーション10にリンクされている。細胞は6ミスフォールド構造に不活性な細胞タンパク質の運動捕捉を防止する分子シャペロンを使用する。シャペロンは、細胞内の複雑な相互作用ネットワークに参加するが、それは完全にこれらの相互作用の合計は生物のproteostasisに寄与する方法を理解されていない。細胞質タンパク質フォールディングの大部分に関与する主要シャペロンの一つは、70 kDの熱ショックタンパク質（Hsp70の）ファミリ19である。なお、Hsp70は低下する酵母損失が初期の異種発現さFFLを折るし、 インビボ18、7内因性タンパク質、オルニチントランスカルバミラーゼを、リフォールディングしたりすることが示されている。ほぼリアルタイム分解能で折りたたみを分析する能力がCONT方法追加の細胞因子を理解することが容易になるこのHsp70の依存プロセスにribute。また、折り畳み/フォールディング反応はこれらの貢献のタンパク質に完全に依存しないかもしれないので、アッセイは、動態および効率の大小の変化の両方を検出するのに十分な感度でなければならない。
酵母細胞disaggregase、Hsp104のは、集約されたミスフォールドタンパク質の修復に重要な役割を果たしている。 Hsp104のホモログは、菌類や植物に同定されているが、この家族は後生動物に存在しないと表示されます。そのようなHsp110ファミリーのような他のシャペロンは、哺乳類16の既知のHsp104の一部のアクティビティを実行することが提案されている。 Hsp104のは、AAA +、六量タンパク質複合体である改造タンパク質凝集に酵母で機能する、リフォールディングと修復13に貢献。 Hsp70の酵母、SSA1、そして酵母HSP40、Ydj1とともにHsp104のは、酵母細胞5,8における変性FFLの回復のために必要とされる。小さな熱ショックタンパク質、HSP26も、requiであることが示されているFFL 2 Hsp104の媒介分解のための赤。
FFLは、脱炭酸、ルシフェリン、二酸化炭素（CO 2）、アデノシン一リン酸（AMP）と、光11を放出基板活性部位に基質ルシフェリンを結合し、ATPおよび酸素を必要とするコンフォメーション変化に続いて、二ドメインタンパク質である9,3。市販のFFL基板、D-ルシフェリン、照度計15を用いて検出することができる550から570 nmの光の発光をもたらす。 FFLは展開に応じ迅速に化学薬品や熱治療および集計から変性に絶妙に敏感です。 39-45との間の温度にさらされたとき°C FFLは、可逆的に不活化12折り畳まれる。対照的に、GFPおよびその誘導体は、応力14を展開タンパク質に対して非常に耐性がある。したがって、これら2つのタンパク質の融合は機能Gを標的とすることのできる実験的に不安定な部分として機能することができますFFL人口と単一細胞レベルの両方で、蛍光顕微鏡を用いて可視化することが可能な預金を細胞内FP。自動化された顕微鏡と相まって半自動マルチモードプレートリーダーにおける酵素アッセイのアプリケーションが動態と反応をフォールディングの収量前例のない同時評価を可能にします。また、モデル真核生物サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の容易な分子遺伝学は、正確なタンパク質の品質制御ネットワークの操作と細胞ストレス応答とproteostasisに貢献する新たな選手を識別するための発見ベースのアプローチのための機会の両方を可能にします。
本研究では、FFL-GFPを発現している野生型（WT）とHsp104の欠失株はタンパク質変性熱ショックを受けます。 FFL-GFPのリフォールディングは、回復時間にわたって表明プロテオームの修復のためのプロキシ読み出しとして酵素アッセイおよび顕微鏡の両方を通じて監視されています。 WT細胞と比較したとき、我々は番目を示す電子Hsp104の欠失株は変性FFL 2の再活性化にHsp104のための役割を確立する前の調査結果を支持し、FFL-GFPのリフォールディングで約60％の効率が悪くなります。
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Protocol
1。プラスミドFFL-GFPを含む菌株の構築
この研究では、 出芽酵母株 BY4741は（MAT、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0）酵母ノックアウトコレクション（オープンバイオシステムズ/サーモサイエンティフィック）からHsp104の欠失株と一緒に使用されました。欠失は、ウェスタンブロット分析のためにHsp104の特異的抗体を用いて確認した。
FFL-GFPは著者への要求に応じてトロント17の大学と得でグラバー実験から得られたプラスミドLEU2ベースのソースから構築、p426MET25-FFL-GFPから発現された。 FFL-GFPプラスミド融合タンパク質の発現は、MET25メチオニン抑制性プロモーターによって制御される。プラスミドをGietz らから適応されたプロトコルを使用して各菌株に形質転換した。ら 、1995：
- 25ミリリットルOを遠心 2分間4,400 rpmで50ミリリットルコニカルチューブのF対数期細胞は、蒸留H 2 0（のddH 2 O）を500μlで洗浄し、上清を捨てる。
- TE / LiAc（トリス塩酸の10mM、pH値= 7.5、1 mMのEDTA、0.1 Mの酢酸リチウム）を250μlで再懸濁した細胞。 20分間混合することなく、30℃でインキュベートする。
- キャリアーDNAとプラスミドDNA5μlの（0.1-5μgの）を5ml（50μgの）と一緒に新しいチューブにコンピテントセル50μlのを転送します。 PEG / TE / LiAc（TE / LiAcプラス40％のポリエチレングリコールと同じ）、この混合物に300μlのを追加し、℃でさらに30分間30℃でインキュベートした細胞。
- 6分間、42℃で、この混合物と熱ショック°C、1/10容量（v / v）のDMSOを（36μl）を入れる。
- 30秒、削除上澄み用6,000 rpmで混合物を遠心分離します。ウラシル（SC-URA）を欠いた合成完全なメディアに無菌のddH 2 0とプレート細胞100μlの細胞を再懸濁します。
2。 FFL-GFPの誘導
前のヒートショックへのタンパク質の大半は新たに末端老化に伴う細胞の不備に起因する時間をかけて集計しているタンパク質を回避するために作られるので、細胞が対数増殖期にある一度NTが "> FFL-GFPが誘導される。- 1日目：30時SC-URA 5ml中インキュベート細胞°C回転O / N
- 2日目：測定OD 600とSC-URA OD 600〜0.2 5ml中の接種新鮮な文化。
- 彼らは対数期OD 600〜0.8〜1.0に達するまで30℃で回転培養する。
- のddH 2 0500μlの中で3分、デカント上澄みと再懸細胞ペレットのために4,400 rpmで15ミリリットルコニカルチューブで細胞を遠心分離し、マイクロチューブへ転送ソリューション。
- 6,000 rpmで遠心し、上清を捨てる。
- SC-URA-MET 5mlに細胞を再懸濁します。細胞は、30℃で1時間℃のため、このメディアに回転培養されるべきである
- 遠心細胞とリピートのddH 2 0で洗浄と上清を捨てる。
- Resuspeタンパク質の発現を阻害し、ステップ3に直ちに進みシクロヘキシミド100μgの/ mlのを含む5ミリリットルSC-URAメディアにおけるNDセル。
3。酵素FFL-GFP回復アッセイ
このアッセイは、集団において活性酵素のレベルを決定するための定量的な手法である。
- このアッセイのための準備：
- 各サンプルのOD 600を測定します。
- サンプルおよび複製プラスチューブ用約1,200μlの、所望の数の数に基づいて、必要に応じて、D-ルシフェリンの必要な量を準備します。 D-ルシフェリンの最終濃度は、細胞を100μlにつき約23μgのです。当初はそれが7.5 mg / mlの原液の濃度で水に溶解し、実験前に455μgの/ SCにおけるmlに希釈した。 図2において、3つの各サンプルのreplicateが使用されているD-ルシフェリン2.4mlの総結果として分析した。
- フラッシュルミのプログラムプレートリーダーnescenceアッセイ（ "射出と発光フラッシュアッセイ"バイオテックGEN5から適応、他の楽器については、製造元の指示に従ってください）
- 30℃に温度を設定
- 、D-ルシフェリンを追加振る、と個別に各ウェルを読むためにプレートリーダーを設定します。
- 発光を読む（エンドポイントの読書、5秒の積分時間、180感度レベル）
- 5分間各読み取り手の間に回復アッセイのために、20分遅らせて、さらに5分を振る。
- インジェクターからD-ルシフェリン50μlを分注する。
- 細胞は、タンパク質合成を停止するシクロヘキシミドを含む培地に添加した後、予熱ショック発光を直ちに測定した。
- 白色96ウェルプレートに複製、所望の数と各サンプルの細胞を100μlを移す。
- コントロールは水ブランクと空のベクターを含む細胞を含める必要があります。
- SPEでの読み取りを開始しますcificationsは、上記の。
- FFL-GFPのFFL部分を変性させるために、42℃でガラス培養管の5 mlの培養液をインキュベート°Cで25分間振とう。
- 細胞は、時刻ゼロであるインキュベーターから除去された後に回復アッセイ発光測定値がすぐに開始する。第1の時点および90分毎に30分間、上記と同様のメジャールミネッセンス。
- OD 600（OD 600によって予熱衝撃値を分割する）に基づいて調整されている予熱ショック発光値にサンプルを正規化します。
4。蛍光顕微鏡検査法
このアッセイは、細胞集団における経時的に凝集体の可溶化を決定するために半定量的方法である。
- 誘導は、 第2節で説明したように、同じであるプロトコルの1-8ステップ 。
- 同じ時間点（ セクション3、ステップ4）上述したように撮影されていますが、マイク用roscopy 1予熱ショックで細胞mlの各リカバリ時点、と°C培養管で30で回転インキュベートサンプルを収集。
- 可視化：
- 30秒間6,000 rpmで細胞を1mlを遠心し上清を除去します。
- のddH 2 O 2μlの中で再懸細胞ペレット
- 細胞プラススライド上の2％低融点アガロース2μlの2μLを混合し、カバースリップを追加します。細胞の単一面を得るために軽くカバースリップの中央に指を押し、カバースリップを移動することが困難になるまで回転させる。
- 細胞を蛍光顕微鏡で100倍のオイル対物を用いて可視化され、GFP蛍光を可視化する細胞およびFITCフィルタを視覚化するために使用DIC。
- 定量のための各時点で各菌株に対して複数の写真を撮る。映像のためのフィールドは、定量的なポスト·実験的解析のために〜15-30細胞が含まれているはずです。
- 凝集体を含む細胞のパーセンテージを計算するために、50を数える-100細胞は、合計して凝集体を含む細胞の数を割る。
5。単一セル顕微鏡
この方法は、経時的な単一セル内の個々の凝集物の可溶化をフォローするために使用される。
- 第2節では、ステップ1-8で説明したようにFFL-GFPの発現を誘導する。
- ヒートショックの後、2分間4,400 rpmで15ミリリットルコニカルチューブで遠心細胞。
- のddH 2 O20μlに再懸濁し、水と500μlの細胞を洗浄
- 各株の場合は、SC-URA寒天プレートの5×5 mmのセクションを切り出し、ペトリ皿、ピペットチップと寒天の表面の周りの細胞と広がりμlのピペット4と接触していた面を使用。 〜1分間放置。
- 〜55ミリメートルのガラスボトムディッシュ番号0にフェイスダウン寒天キューブセクションを配置し、軽く下に押すようにピンセットを使用してください。
- 可視化：
- 節でI〜IIIを参照してくださいイオン4。
- 文化の密度に応じて、各株について2-4焦点の座標を設定します。
- （ - 0.5〜1.0μmのスライス厚で/ + 15μm）を90分の期間に5分ごとに適切な範囲を持つZ-スタックで写真を撮るためにカメラを設定します。
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Representative Results
酵母は、効率的リフォールディング熱変性タンパク質にHsp104のdisaggregaseに依存しています。 FFL-GFPの活性は、 図1の発光フラッシュアッセイを用いて、25分間の熱ショック後にモニターした。 図2に示すように、この自動化されたアッセイの結果は、最終的WT細胞における> 80％の回収率につながっ90分かけて段階的に活性の増加が明らかになった。 hsp104Δ株は、同じ時間枠の上にオリジナルの活動の19％を回復した。また、初期の不活化の程度はHsp104のは中FFL-GFPの変性と急速に仲間を保護の役割プレストレスを提供する、またはすることができることを示唆しているシャペロン変異株（WTは26％の活性とhsp104Δで11％）にはるかに高かった熱不活性化ステップは、酵素活性の損失を低減することができる。
人口顕微鏡酵素活性アッセイを裏付け。 hsp104D変異ストラのほぼすべてのセルで維持少なくとも一つFFL-GFPは、熱ショック（ 図3）の後に90分以内に62％減少したWT株における凝集体の数に比べて集計。凝集体のかなりの数は両系統における熱ショックの直後に形成されている間hsp104Δ細胞が観察涙点をクリアするために失敗しながら、凝集体を含むWT細胞の数は急速に減少した。これらのデータは、hsp104Δ株における最小限の8％回復対WTの活動の52％の回復を示した活性アッセイを裏付ける。
単一細胞自動顕微鏡hsp104Δ株に対してWT細胞で、FFL-GFPが（; FFL-GFPの再可溶化のタイムラプスシリーズに補足映画を見代表静止画像を図4に示されています）高いレートで可溶化したことを明らかにした。また、タンパク質凝集体の力学は非常に異なっていた。WT細胞において凝集が融合する傾向にある前方可溶化され、これはhsp104Δ株において観察されなかった。このアッセイは、他の2つの方法からの結果をサポートするだけでなく、凝集したタンパク質が可溶化およびリフォールディングする方法のための可能なメカニズムへの洞察を明らかにするだけでなく。
図1。 FFL-GFP熱ショック回復アッセイの概略図。FFL-GFPの発現はSC-URAでインキュベートされた細胞内のログ相に誘起される。 1時間SC-URA-METでインキュベート細胞を誘導する。遠心細胞とSC-URAは100μgの/ mlのシクロヘキシミド（CHX）を含むで再懸濁する。ヒートショックは、25分間42℃で細胞をインキュベート。細胞は30℃でインキュベートすることにより回復することを許可90分の時間経過のためのサンプルを収集します。酵素アッセイのためにD-ルシフェリンは各読み取りの前に追加されます。REF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg"ターゲット= "_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図2。 FFL-GFP酵素フォールディング/回復アッセイ。WTとhsp104Δ細胞（100μl）をのサンプルを各時点についての熱ショック（0、30、60、90分）後に先立って熱ショックに、すぐに回収した。スリー各試料の複製は、各時点のための96ウェル白色プレートのウェルに分注し。測定値については、プレートリーダー、発光を30℃で90分間毎に30分間℃で測定するように設定された
<BR /> 図3。 FFL-GFPのリフォールディング顕微鏡。各時点での細胞（プレ-HS、0、30、60、90分）1mlを採取し、遠心分離した。上清を吸引し、細胞を水2μlの中に再懸濁した。細胞を、低融点アガロースを2μlと混合することにより調製した。細胞は100Xオイル対物を用いて可視化した。各時点の代表的なイメージが示されている。定量は4-5分野で細胞を計数し、凝集体（n個〜100）を含む細胞の割合を算出することにより行った。
図4 FFL-GFPの単一細胞リフォールディング顕微鏡経時変化。ポスト熱ショック細胞5mlを集め、遠心分離し、蒸留H 2 O20μlに再懸濁し4μlの細胞を5mm 2上に置いた
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Discussion
この記事では、モデルタンパク質FFL-GFPは、Hsp104のは、タンパク質の再可溶化および修復に貢献する酵母disaggregaseことを示すために使用されていました。酵素アッセイおよび顕微鏡差動的にリフォールディング効率及び収率を決定するために同一の基質タンパク質のステータスを尋問。酵素回復アッセイの結果は、非効率的なhsp104D変異株で最大の回復ですが、展開のストレスの初期の大きさは変異株（ 図2）の方が大きかっただけでなく、ことを示唆している。分析はまたhsp104D細胞が修復を試みるように見えながら、彼らは早くWT細胞などタンパク質をリフォールディングすることができませんでしたことを示しています。このメソッドは、このタンパク質の修復にHsp104のの本質的な役割を明らかにFFL-GFP活性を高感度かつ定量的な分析を可能にした。
顕微鏡検査の結果、変性FFL酵素の非効率的な修理のための理由が原因tであることを示唆しているoがタンパク質の凝集体の中にトラップ。集団解析はHsp104のを欠く細胞において、細胞はまだ完全に90分（ 図3）内のすべての凝集をクリアできなかったことを示した。さらに、単一細胞分析は、より大きな構造に小さい凝集体のその連結を示唆凝集経時的ヒューズは、（ 図4）修復およびリフォールディング過程を助けることができることを明らかにした。この結果は、静止画像から明らかではないが、時間経過映画は1つが独立した集合体の動的挙動を追跡することができます。時間経過にわたって凝集体の観察は、これらの細胞が効率的に大きな構造を形成し、Hsp104の、タンパク質の品質管理のこのファセットに必要であることを示唆していないことを示す、hsp104Δ株において融合凝集体を減少させた発見した。さらに投機は、細胞がさらに分解や修理mを含んでいてもよい、これらの大きな凝集体からより迅速にタンパク質を可溶化することであるachinery。単一細胞顕微鏡検査は、他のシャペロンおよび共シャペロンを拡大対小さい凝集体に存在する場合、その居住パターンが経時的に変化するかどうかを決定するために使用することができる。
一緒にこれらの方法は、生きた細胞中のタンパク質フォールディングと修復の生化学的および細胞生物学的解析の両方を可能にする。説明した3つの方法からの結果の統合は、熱ショックproteotoxic後の細胞の回復の動態や効率に多次元の洞察力を与える。より大きなサンプルサイズと生物は堅牢性と結果の究極の信頼を高める、与えられた実験で複製するためのプロトコルの手順の一部またはすべてを自動化することもできます。さらに、これらの方法は理論的にはヒト細胞および遺伝子解析のためだけでなく、使用することなく、proteostasisを変える化学物質を調査するために拡張することができる。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
この作品は、KAM、我々はまた、FFLを提供するためにトロント大学のジョン·グローバーに感謝JLAに微生物ロバートD.ワトキンス大学院生研究フェローシップのアメリカの社会への国立衛生研究所（NIGMS-074696）からの助成金によってサポートされていましたプラスミド-GFPソース。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
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