Summary
В этой статье описывается использование люциферазы светляков-GFP слитого белка для расследования
Abstract
Proteostasis, определяемый как комбинированный процесс складывания белка / биогенезе, укладку / ремонта, и деградацию, это тонкий клеточный баланс, который должен быть сохранен, чтобы избежать вредных последствий 1. Внешних или внутренних факторов, которые разрушают этот баланс может привести к агрегации белка, токсичность и гибели клеток. У людей это является одним из основных факторов, способствующих симптомы, связанные с нейродегенеративных расстройств, таких как Гентингтона, Паркинсона и болезни Альцгеймера 10. Поэтому очень важно, что белки, участвующие в поддержании proteostasis быть идентифицированы с целью разработки методов лечения этих изнурительных болезней. Этой статье описываются методы для мониторинга в естественных условиях укладка белков в близком к реальному времени разрешение с помощью модели белка люциферазы светляков слит с зеленого флуоресцентного белка (GFP FFL-). FFL-GFP представляет собой уникальную модель химерных белков как FFL фрагмент чрезвычайно чувствительна к стресс-индуцированной мisfolding и агрегации, которая инактивирует фермент 12. Активность люциферазы контролируется с использованием ферментативного количественного анализа, а остаток GFP обеспечивает способ визуализации растворимый или агрегированные нулевой отметки с использованием автоматизированных микроскопии. Эти методы включают сочетание двух параллельных и технически независимых подхода для анализа и повторной укладки и функциональные реактивации фермента после стресса. Восстановление активности может быть непосредственно связано с кинетикой разукрупнения и повторного растворения, чтобы лучше понять, как белка контроль качества факторов, таких как белок шаперонами кооперируются для выполнения этих функций. Кроме того, ген делеции или мутации могут быть использованы для проверки вклады специфических белков или белковых субъединиц в этот процесс. В этой статье мы рассмотрим вклад белка disaggregase Hsp104 13, известного партнера с Hsp40/70/nucleotide фактором бирже (NEF) рефолдинга системы 5, с белком рефолдинга для проверки этого подхода.
Introduction
У людей нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона были связаны с неправильного сворачивания белка и агрегации 10. Клетки используют молекулярные шаперонами для предотвращения захвата кинетической клеточных белков в неактивной неправильно упакованных структур 6. Шаперонов участие в сложной сети взаимодействий в клетке, но это не совсем понял, как суммы этих взаимодействий способствует организменную proteostasis. Одним из основных шаперонов ответственны за большинство цитозольных складной белок 70 кДа белка теплового шока (Hsp70) семейство 19. Было показано, что в дрожжах потери Hsp70 уменьшается обеспечения возможности сгибать возникающий гетерологично выражены нулевой отметки и повторной укладки эндогенный протеин, орнитин transcarbamoylase, в 18 живом организме, 7. Умение анализировать складывающиеся с почти в реальном времени разрешение будет способствовать пониманию того, как дополнительные факторы сотовых продолжениеribute этому Hsp70-зависимый процесс. Кроме того, раскладной / рефолдинга реакции не может быть полностью зависимыми от этих белков способствует, поэтому анализы должны быть достаточно чувствительными, чтобы обнаруживать как крупные, так и небольшие изменения в кинетику и эффективность.
Disaggregase дрожжевой клетки, Hsp104, играет жизненно важную роль в ремонте агрегированных неправильно упакованных белков. Хотя Hsp104 гомологов были выявлены у грибов и растений, эта семья, кажется, отсутствуют в многоклеточные. Было высказано предположение, что другие шаперонов, такие как семейства Hsp110 выполнять некоторые из известных Hsp104 деятельности у млекопитающих 16. Hsp104 является AAA +, гексамерные белковый комплекс, который функционирует в дрожжах, чтобы реконструировать агрегаты белка, способствуя укладку и ремонт 13. Hsp104, вместе с дрожжами Hsp70, SSA1 и дрожжи Hsp40, Ydj1, необходимо для восстановления денатурированного нулевой отметки в дрожжевых клетках, 5, 8. Малый белок теплового шока, Hsp26, также было показано, что requiкрасный для Hsp104-опосредованной дезагрегацию FFL 2.
Лит состоит из двух доменов белок, который связывается субстрат люциферин в активном сайте и после конформационное изменение, которое требует АТФ и кислорода, декарбоксилирует подложки выпуска оксилюциферин, диоксида углерода (СО 2), аденозин монофосфат (АМФ) и 11 света, 9, 3. Коммерчески доступные нулевой отметки подложки, D-люциферин, приводит светового излучения между 550-570 нм, которые могут быть обнаружены с помощью фотометра 15. FFL исключительно чувствительна к денатурации химической или термической обработки и агрегатов на быстро разворачивается. Под воздействием температуры от 39-45 ° C FFL обратимо развернулась и инактивированные 12. В противоположность этому, GFP и его производные обладают высокой устойчивостью к разворачивания белка напряжений 14. Поэтому сплав этих двух белков позволяет нулевой отметки, чтобы функционировать в качестве экспериментального лабильный фрагмент, способный нацеливание функциональный GFP к внутриклеточным депозитов, которые могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии и население, и одного уровня ячейки. Применение ферментного анализа в полуавтоматическом многомодовых ридере в сочетании с автоматизированной микроскопии позволяет беспрецедентную одновременной оценки кинетики и выход рефолдинга реакций. Кроме того, легкий молекулярной генетики эукариот модели CEREVISIAE Saccharomyces позволяет и точное манипулирование сети управления качеством белка и возможность для открытия подходы к идентификации новых игроков способствует клеточной реакции стресса и proteostasis.
В этом исследовании дикого типа (WT) и Hsp104 удаления штаммы, экспрессирующие лит-GFP подлежат денатурации белка теплового шока. FFL-GFP рефолдинга контролируется через обе ферментного анализа и микроскопии в качестве прокси для считывания ремонт выразил протеомом за ходом времени восстановления. По сравнению с WT клетках, мы показываем йэлектронной Hsp104 удаления деформации ~ 60% менее эффективны при повторной укладки FFL-GFP, поддерживая предыдущие выводы создании Hsp104 роль в реактивации денатурированного FFL 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Строительство штаммов, содержащих FFL-GFP плазмиды
Для этого исследования штамма Saccharomyces CEREVISIAE BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) использовалась наряду с штаммом Hsp104 удаления из коллекции дрожжей нокаутом (Открытое биосистем / Thermo Scientific). Удаление была подтверждена с помощью Hsp104-специфических антител для Вестерн-блоттинга.
FFL-GFP было высказано от p426MET25-FFL-GFP, построенных из LEU2 основе источника плазмиды, полученной из лаборатории Гловер в Университете Торонто 17 и получить по запросу авторов. Экспрессия лит-GFP плазмиды слитого белка контролируется МЕТ25 метионин-репрессируемый промотора. Плазмиду трансформировали в каждой линии, используя протокол был адаптирован из Gietz и. др., 1995:
- Центрифуга 25 мл о F логарифмической фазе клеток в 50 мл коническую трубку при 4400 оборотах в минуту в течение 2 мин, промывают 500 мкл бидистиллированной H 2 0 (Ddh 2 O), и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 250 мкл TE / LiAc (Трис-HCl 10 мМ, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 М ацетата лития). Инкубируют при 30 ° С без перемешивания в течение 20 мин.
- Передача 50 мкл компетентных клеток в новую пробирку вместе с 5 мл (50 мкг) ДНК-носитель и 5 мкл (0,1-5 мкг) плазмидной ДНК. Добавить 300 мкл ПЭГ / TE / LiAc (то же, TE / LiAc плюс 40% полиэтиленгликоля) этой смеси, и клетки инкубируют при 30 ° С в течение еще 30 мин.
- Добавить 1/10 объема (объем / объем), ДМСО (36 мкл) к этой смеси и теплового шока при 42 ° С в течение 6 мин.
- Центрифуга смеси при 6000 оборотах в минуту в течение 30 сек и удалить супернатант. Ресуспендируют клеток в 100 мкл стерильной DDH 2 0 и пластины клеток на синтетической полной среде, не содержащей урацил (SC-URA).
2. Индукция FFL-GFP
нт "> лит-GFP индуцируется как только клетки в логарифмической фазе поэтому большинство белков до теплового шока заново, чтобы избежать белки, которые неизлечимо объединены с течением времени из-за возрастного сотовой недостатков.- День 1: инкубируют клетки в 5 мл SC-УПА при 30 ° С вращающейся O / N.
- День 2: Измерение OD 600 и прививку свежих культур в 5 мл SC-УРА OD 600 ~ 0,2.
- Выдержите культур с поворотом на 30 ° C, пока не достигнут логарифмической фазе OD 600 ~ 0,8-1,0.
- Центрифуга клеток в 15 мл конические пробирки при 4400 оборотах в минуту в течение 3 минут, надосадочную жидкость декантируют и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл DDH 2 0; передачу решения микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга при 6000 оборотов в минуту и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 5 мл SC-УРА-MET. Клетки должны быть инкубированы вращающихся в этой среды в течение 1 часа при 30 ° С.
- Центрифуга клетки и повторите промывку в Ddh 2 0 и отбросить супернатант.
- Resuspeй клетки в 5 мл SC-УРА средах, содержащих 100 мкг / мл циклогексимида ингибировать экспрессию белка, и немедленно приступить к шагу 3.
3. Ферментативный FFL-GFP Восстановление анализа
Этот анализ количественный подход для определения уровней активного фермента в популяции.
- Подготовка к этому анализ:
- Измерить OD 600 для каждого образца.
- Подготовьте необходимое количество D-люциферин нуждалась в зависимости от количества образцов и необходимое количество повторов плюс приблизительно 1200 мкл для труб. Конечная концентрация D-люциферин составляет ~ 23 мкг на 100 мкл клеток. Первоначально она растворяется в воде при концентрации исходного раствора 7,5 мг / мл и разбавляли до 455 мкг / мл в SC до эксперимента. На рисунке 2, трех повторов для каждого образца анализировали в результате чего в общей сложности 2,4 мл D-люциферин используется.
- Программа ридер для флеш-люлюминесценции анализа (адаптировано из BioTek Gen5 "вспышки люминесценции Проба с инъекций", для других инструментов следовать инструкциям производителя)
- Установка температуры до 30 ° C
- Установить ридер добавить D-люциферином, трясти, и читать каждую лунку индивидуально.
- Читайте люминесценции (конечная точка чтении, 5 секунд времени интегрирования, 180 уровня чувствительности)
- Для восстановления анализа между каждым чтением дрожания в течение 5 мин, задержка 20 мин, и встряхните еще 5 мин.
- Добавьте 50 мкл D-люциферин из инжектора.
- Предварительный нагрев шока люминесценции измеряется непосредственно после клеткам добавляют в средах, содержащих циклогексимид, чтобы остановить синтез белка.
- Передача 100 мкл клеток для каждого образца с желаемое количество повторов в твердый белый 96-луночный планшет.
- Контроль должен включать пустой воды и клеток, содержащих пустой вектор.
- Начните чтение с тем SPEcifications перечисленных выше.
- Для денатурации нулевой отметки фрагмент лит-GFP, инкубировать 5 мл культуры в пробирку с культурой стекла при 42 ° С встряхивания в течение 25 мин.
- Восстановление показаний анализа люминесценции начинается сразу после того как клетки извлекали из термостата, которая равна нулю момент времени. Измерение люминесценции же, как описано выше для первого момент времени, и каждые 30 мин в течение 90 мин.
- Нормализация образцы для подогрева-шок люминесценции значения, которые были скорректированы на основе OD 600 (поделите Разогреть шока значений OD 600).
4. Флуоресцентной микроскопии
Этот анализ полуколичественный метод определения растворимости агрегатов с течением времени в популяции клеток.
- Индукционные так же, как описано в разделе 2, стадии 1-8 протоколов.
- То же моменты времени принимаются как описано выше (Раздел 3, стадия 4), но для микрофонаroscopy собирают 1 мл клеток при подогрева шока и каждой точке времени восстановления, и инкубируют образцы вращающихся при 30 ° С в культуре трубки.
- Визуализация:
- Центрифуга 1 мл клеток при 6000 оборотах в минуту в течение 30 сек и удалить надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют осадок клеток в 2 мкл DDH 2 O.
- Смешайте 2 мкл клеток плюс 2 мкл 2% с низкой температурой плавления агарозы на слайде и добавить покровного стекла. Для того чтобы получить одну плоскость клеток слегка нажмите пальцем в центре крышки скольжения и поворота, пока покровное стекло не трудно двигаться.
- Клетки визуализированы с помощью 100X цель масла флуоресцентного микроскопа; DIC использовать для визуализации клеток и FITC фильтр для визуализации флуоресценции GFP.
- Возьмите несколько изображений для каждого штамма в каждый момент времени для количественного определения. Поля для картин должна содержать ~ 15-30 клеток для количественной пост-экспериментального анализа.
- Чтобы вычислить процент клеток, содержащих агрегаты, количество 50-100 Клетки полной и разделить количество клеток, содержащих агрегаты.
5. Одноместный микроскопии сотовых
Этот способ используется следовать солюбилизации отдельных агрегатов в одной ячейке с течением времени.
- Вызвать FFL-GFP выражение, как описано в разделе 2, стадии 1-8.
- После теплового шока, центрифуги клеток в 15 мл коническую трубку при 4400 оборотах в минуту в течение 2 минут.
- Мытье клеток с 500 мкл воды и ресуспендируют в 20 мкл DDH 2 O.
- Для каждого штамма, вырезать 5x5 разделе мм SC-URA агаром и используя поверхность, которая была в контакте с чашки Петри, пипетки 4 мкл клеток и распространение вокруг поверхности агара с кончиком пипетки. Дайте постоять в течение ~ 1 мин.
- Используйте пинцет, чтобы поместить раздел агар куб лицевой стороной вниз на ~ 55 мм 0 номер со стеклянным дном блюдо и слегка надавите.
- Визуализация:
- См. I-III в разделеионный 4.
- Задать координаты в течение 2-4 координационные центры для каждого штамма в зависимости от плотности культуры.
- Установите камеру делать снимки с Z-стек с соответствующего диапазона (- / + 15 мкм с толщиной среза 0,5-1,0 мкм) каждые 5 мин в течение 90 мин периода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дрожжи зависит от disaggregase, Hsp104 эффективно повторной укладки тепловой денатурации белков. Активность лит-GFP контролировали после теплового шока 25 мин, с использованием анализа люминесценции флэш рисунке 1. Результаты этого автоматизированного анализа показан на рисунке 2 показало ступенчатое увеличение активности в течение 90 мин, что в конечном итоге приводит к> 80% восстановление в WT клетках. Штамм hsp104Δ восстановить 19% от первоначальной деятельности за тот же период времени. Кроме того, степень начальной инактивации была значительно выше в шапероном мутантного штамма (26% активности в WT и 11% в hsp104Δ) предполагая, что может быть Hsp104 отбывает защитную роль предварительного напряжения, или быстро ассоциируется с денатурирующих FFL-GFP в течение стадию термической инактивации уменьшить потери ферментативной активности.
Население микроскопии подтвердили ферментативный анализ деятельности. Почти все клетки в hsp104D мутанта страВ поддерживаться по крайней мере один лит-GFP совокупность сравнению с количеством агрегатов в WT напряжение, которое уменьшилось на 62% в течение 90 мин после теплового шока (фиг. 3). Хотя значительное количество агрегатов, образованных сразу после теплового шока в обоих штаммов, количество WT клетки, содержащие агрегаты быстро снижалась при hsp104Δ клетки не очистить наблюдаемых Puncta. Эти данные подтверждают анализ активности, который показал 52% восстановление активности в сравнении с WT минимальную 8% восстановления в штамме hsp104Δ.
Single Cell автоматизированной микроскопии показали, что в сравнении с WT клетки штамма hsp104Δ, FFL-GFP солюбилизировалась по более высокой ставке (представительных неподвижные изображения показано на рисунке 4, см. дополнительное фильмы для покадровой серии FFL-GFP повторного растворения). Кроме того, динамика белковых агрегатов были очень разными; в WT клетках агрегатов как правило, будет плавиться Поэтому будучи солюбилизации, и это не наблюдалось в штамме hsp104Δ. Этот анализ не только поддерживает результаты двух других методов, но также показывает представление возможного механизма как агрегированный белок солюбилизируют и отогнутый.
Рисунок 1. Схема лит-GFP теплового шока восстановление анализа. Лит-GFP выражение индуцируется в логарифмической фазе роста в клетках, которые были инкубированы в SC-УПА. Для индукции клетки инкубировать в SC-УРА-MET в течение 1 часа. Центрифуга клетки и ресуспендируют в SC-УПА, содержащей 100 мкг / мл циклогексимида (СНХ). Для теплового шока, инкубировать клетки при 42 ° С в течение 25 мин. Разрешить клетки восстановить путем инкубации при 30 ° С. Сбор образцов для 90 учебного времени мин. Для ферментативного анализа D-люциферином добавляется перед каждым чтением.Ref = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 2. Лит-GFP ферментативной повторной укладки / восстановление анализа. Образцы WT и hsp104Δ клеток (100 мкл) собирали до теплового шока и сразу после теплового шока для каждой временной точки (0, 30, 60 и 90 мин). Три повтора каждого образца отбирали аликвоты в лунки 96-луночной белой пластины для каждой временной точке. Для чтения, планшет-ридере был установлен на измерение люминесценции каждые 30 мин в течение 90 мин при 30 ° С.
<BR /> Рисунок 3. Лит-GFP повторной укладки микроскопии. 1 мл клеток в каждый момент времени (предварительно HS, 0, 30, 60 и 90 мин), собирают и центрифугируют. Супернатант отсасывали и клетки ресуспендировали в 2 мкл воды. Клетки были получены путем смешивания с 2 мкл с низкой температурой плавления агарозы. Клетки визуализирована с помощью 100X цель масла. Типичные изображения каждой временной точки показаны. Количественное определение сделано путем подсчета клеток в 4-5 полей и расчета процента клеток, содержащих агрегаты (п-100).
Рисунок 4. Одной ячейки повторной укладки микроскопии временной ход лит-GFP. Сообщение теплового шока 5 мл Клетки собирали, центрифугировали и ресуспендировали в 20 мкл DDH 2 O. 4 мкл клеток помещали на 5 мм 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье модель белка FFL-GFP был использован, чтобы показать, что дрожжи disaggregase, Hsp104 способствует белка повторного растворения и ремонт. Ферментативный анализ и микроскопии дифференциально опрошенных состояния одного и того же белкового субстрата для определения повторной укладки эффективность и выход. Результаты анализов ферментативного восстановления предположить, что не только является максимальное восстановление в hsp104D мутантного штамма неэффективны, но начальная величина разворачивается стресса была больше в мутантного штамма (рис. 2). Анализ также показывает, что в то время hsp104D клетки, казалось, были попытки ремонта, они не смогли сложить белка так быстро, как WT клеток. Этот метод позволил чувствительный и количественный анализ FFL-GFP деятельности выявление важной роли Hsp104 в ремонт этого белка.
Микроскопии результаты позволяют предположить, что причиной неэффективного ремонта денатурированного FFL фермента обусловлена тO белка захвата в агрегаты. Население анализ показал, что в клетках, лишенных Hsp104, клетки не могут полностью очистить все агрегаты в течение 90 мин (рис. 3). Кроме того, клетки одного анализы показали, что агрегаты предохранитель с течением времени, предполагая, что консолидация небольших агрегатов в более крупные структуры может помочь ремонт и повторную укладку процесса (рис. 4). Хотя этот результат не является очевидным из неподвижных изображений, интервальной съемки позволяют следить за динамическим поведением независимых агрегатов. Наблюдение агрегатов за время курса обнаружили снизилась совокупность слияния в штамме hsp104Δ, указывая, что эти клетки не образуют более крупные структуры так же эффективно, и предполагая, что Hsp104 требуется для этого аспекта белок контроль качества. Дальнейшие спекуляции в том, что клетки могут растворения белков быстрее от этих больших агрегатов, которые могут дополнительно содержать разбивку и ремонт мachinery. Одноклеточные микроскопии также может быть использован для определения других шаперонов и ко-шаперонов присутствуют в больших по сравнению с меньшим агрегатов, а если эта картина проживание изменяется с течением времени.
Вместе эти методы позволяют как биохимические и клеточные биологический анализ повторную укладку белка и ремонта в живых клетках. Интеграция результатов трех методов, описанных дает многомерную представление о кинетике и эффективность клеточного восстановления после Протеотоксический теплового шока. Автоматизации всех или некоторых из этапов в протоколе также обеспечивает большую выборки и биологических повторяет в данном эксперименте, повышение надежности и конечной уверенности в конечном результате. Кроме того, эти методы теоретически может быть расширен для использования в клетках человека, а не только для генетического анализа, но и исследовать химические вещества, которые изменяют proteostasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (NIGMS-074696), чтобы КАМ и Американского общества микробиологии Роберт Д. Уоткинс аспирант исследовательский грант в Лигу Мы также благодарим Джон Гловер в Университете Торонто за предоставление нулевой отметки -GFP плазмиды источник.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L.
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
