Summary
Este artículo describe el uso de una proteína de fusión luciferasa de luciérnaga-GFP para investigar
Abstract
Proteostasis, definida como los procesos combinados de plegamiento de proteínas / biogénesis, replegado / reparación, y la degradación, es un delicado equilibrio celular que se debe mantener para evitar consecuencias perjudiciales 1. Factores externos o internos que perturban este equilibrio puede conducir a la agregación de la proteína, la toxicidad y la muerte celular. En los seres humanos esto es un factor importante que contribuye a los síntomas asociados con los trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Huntington, Parkinson, y las enfermedades de Alzheimer 10. Por lo tanto, es esencial que las proteínas implicadas en el mantenimiento de proteostasis ser identificados con el fin de desarrollar los tratamientos para estas enfermedades debilitantes. Este artículo describe las técnicas para el seguimiento en el plegamiento de proteínas in vivo a una resolución de tiempo casi real utilizando el modelo de proteína luciferasa de luciérnaga fusionado a la proteína fluorescente verde (FFL-GFP). FFL-GFP es una proteína quimérica modelo único como resto de FFL es extremadamente sensible a la tensión inducida por misfolding y la agregación, que inactiva la enzima 12. La actividad de luciferasa se controló usando un ensayo enzimático, y el resto de GFP proporciona un método de visualización de FFL soluble o agregada mediante microscopía automatizada. Estos métodos acoplados incorporan dos enfoques paralelos y técnicamente independiente para analizar tanto replegamiento y la reactivación funcional de una enzima después de estrés. Recuperación de la actividad se puede correlacionar directamente con la cinética de desagregación y de re-solubilización para comprender mejor cómo los factores de control de calidad de proteínas, tales como chaperones de la proteína colaboran para llevar a cabo estas funciones. Además, las supresiones de genes o mutaciones se pueden usar para probar las contribuciones de proteínas específicas o subunidades de proteínas a este proceso. En este artículo se reflexiona sobre las aportaciones de la proteína disaggregase Hsp104 13, conocido por colaborar con el factor de cambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 replegado, con el replegamiento de proteínas para validar este enfoque.
Introduction
En los seres humanos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, y las enfermedades de Huntington se han relacionado con el mal plegamiento y la agregación de la proteína 10. Las células emplean chaperones moleculares para prevenir atrapamiento cinética de las proteínas celulares en las estructuras inactivas mal plegadas 6. Los acompañantes que participen en redes de interacción complejas dentro de la célula, pero no se conocen con exactitud cómo la suma de estas interacciones contribuye a proteostasis organismo. Uno de los principales chaperonas responsables de la mayoría de plegamiento de la proteína citosólica es la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de la familia 19. Se ha demostrado que en la pérdida de la levadura de Hsp70 disminuye la capacidad de doblar naciente de FFL heteróloga expresada y para replegar la proteína endógena, ornitina transcarbamilasa, in vivo 18, 7. La capacidad de analizar plegable con resolución de tiempo casi real, facilitará la comprensión de cómo los factores celulares cont adicionalribute a este proceso de Hsp70-dependiente. Además, plegado / replegamiento reacciones no puede ser completamente dependiente de estas proteínas que contribuyen, por lo que los ensayos deben ser lo suficientemente sensible como para detectar tanto los cambios grandes y pequeños en la cinética y la eficiencia.
El disaggregase célula de levadura, Hsp104, juega un papel vital en la reparación de las proteínas mal plegadas agregados. Aunque Hsp104 homólogos han sido identificados en hongos y plantas, esta familia parece estar ausente en metazoos. Se ha propuesto que otras chaperonas tales como los de la familia Hsp110 realizan algunos de los conocidos Hsp104 actividades en mamíferos 16. Hsp104 es un +, complejo de proteínas hexameric AAA que funciona en la levadura de proteínas remodelación de agregados, que contribuyen a replegado y reparación 13. Hsp104, junto con la levadura Hsp70, ssa1, y la levadura Hsp40, Ydj1, se requiere para la recuperación de FLE desnaturalizado en células de levadura 5, 8. La pequeña proteína de choque térmico, Hsp26, también se ha demostrado que es Requirojo para la desagregación Hsp104 mediada OFF 2.
FFL, es una proteína de dos dominios que se une el sustrato luciferina en el sitio activo y después de un cambio conformacional que requiere ATP y el oxígeno, descarboxila el sustrato liberando oxiluciferina, dióxido de carbono (CO 2), monofosfato de adenosina (AMP), y la luz 11, 9, 3. El sustrato disponible comercialmente FFL, D-luciferina, resulta en la emisión de luz entre 550-570 nm que pueden ser detectados usando un luminómetro 15. FLE es exquisitamente sensible a la desnaturalización de los tratamientos químicos o calor y agregados rápidamente al despliegue. Cuando se expone a temperaturas entre 39-45 ° C OFF se desarrolló reversible e inactivadas 12. Por el contrario, GFP y sus derivados son altamente resistentes a desplegamiento de la proteína tensiones 14. Por lo tanto, la fusión de estas dos proteínas permite OFF para funcionar como un resto experimentalmente lábil capaz de dirigirse funcional TFP a intracelular de depósitos que se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia a la población y de los niveles de células individuales. Aplicación del ensayo enzimático en un lector de placas multimodo semi-automatizado junto con microscopía automatizada permite la evaluación simultánea sin precedentes de la cinética y el rendimiento de replegamiento reacciones. Además, la genética molecular fáciles del modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto la manipulación precisa de la red de control de calidad de la proteína y la oportunidad para que los enfoques basados en descubrimientos para identificar nuevos jugadores que contribuyen a la respuesta al estrés celular y proteostasis.
En este estudio, las cepas de tipo salvaje (WT) y HSP104 eliminación expresan FFL-GFP están sujetos a la desnaturalización de proteínas de choque térmico. FFL-GFP replegamiento se controla a través tanto de un ensayo enzimático y microscopía como una lectura de proxy para la reparación del proteoma expresado sobre un curso de tiempo de recuperación. En comparación con las células WT, mostramos ªsupresión cepa e Hsp104 es de ~ 60% menos eficientes en el replegamiento FFL-GFP, el apoyo a los hallazgos previos establecen un rol para Hsp104 en la reactivación de desnaturalizado OFF 2.
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Protocol
1. Construcción de las cepas que contienen FFL-GFP plásmido
Para este estudio, Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741 (MAT una, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) se utiliza junto con una supresión cepa HSP104 de la colección nocaut levadura (Open Biosystems / Thermo Scientific). La deleción se confirmó utilizando un anticuerpo Hsp104-específico para el análisis de Western blot.
FFL-GFP se expresa a partir de p426MET25-FFL-GFP, construido a partir de una fuente LEU2 plásmido basado obtenido por el laboratorio Glover en la Universidad de Toronto 17 y obtenible a petición de los autores. Expresión de la proteína de fusión plásmido FFL-GFP es controlado por el promotor MET25 metionina-reprimible. El plásmido se transformó en cada cepa usando un protocolo fue adaptado de Gietz et. al, 1995:
- Centrifugar 25 ml o f células en fase de registro en un tubo cónico de 50 ml a 4.400 rpm durante 2 min, se lavan con 500 l de doble destilada H 2 0 (ddH 2 O), y descartar sobrenadante.
- Resuspender las células en 250 l de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, acetato de litio 0,1 M). Incubar a 30 ° C sin mezclar durante 20 min.
- Transferir 50 l de células competentes a un nuevo tubo junto con 5 ml (50 g) de ADN portador y 5 l (0,1-5 g) de ADN plásmido. Añadir 300 l de PEG / TE / LiAc (igual que el% de polietilenglicol TE / LiAc más 40) a esta mezcla, y las células se incuban a 30 ° C durante otros 30 min.
- Añadir 1/10 volumen (v / v) de DMSO (36 l) a esta mezcla y choque térmico a 42 ° C durante 6 min.
- Se centrifuga la mezcla a 6.000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante. Resuspender las células en 100 l de ddH 2 0 y células de la placa estériles en medios completos sintéticos que carecen de uracilo (SC-URA).
2. La inducción de la FFL-GFP
nt "> FFL-GFP es inducida una vez que las células están en la fase de registro por lo que la mayoría de la proteína antes de choque térmico se hace para evitar recién proteínas que se han agregado terminalmente con el tiempo debido a las insuficiencias celulares relacionadas con el envejecimiento.- Día 1: Se incuban las células en 5 ml de SC-ura a 30 ° C giratoria O / N.
- Día 2: Medida OD 600 y cultivos frescos inocular en 5 ml de SC-URA OD 600 ~ 0,2.
- Incubar los cultivos con rotación a 30 º C hasta que alcanzan la fase de registro OD 600 ~ 0,8-1,0.
- Centrifugar las células en tubos cónicos de 15 ml a 4400 rpm durante 3 min, decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 500 l de ddH 2 0; solución de transferencia a un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar a 6000 rpm y descartar sobrenadante.
- Resuspender las células en 5 ml de SC-URA-MET. Las células deben ser incubadas rotación en este medio durante 1 hora a 30 ° C.
- Centrifugar las células y de lavado se repiten en ddH 2 0 y descartar sobrenadante.
- Resuspend células en 5 medios SC-URA ml conteniendo 100 mg / ml de cicloheximida para inhibir la expresión de la proteína, y proceder de inmediato al paso 3.
3. Ensayo enzimático Recuperación FFL-GFP
Este ensayo es un enfoque cuantitativo para determinar los niveles de enzima activa en una población.
- Preparación para este ensayo:
- Mida OD 600 para cada muestra.
- Prepare la cantidad necesaria de D-luciferina necesaria basada en el número de muestras y el número de repeticiones más aproximadamente 1200 l para el tubo deseado. La concentración final de D-luciferina es ~ 23 g por 100 l de células. Inicialmente se disuelve en agua a una concentración de solución madre de 7,5 mg / ml y se diluyó hasta 455 g / ml en SC antes del experimento. En la Figura 2, tres repeticiones para cada muestra fueron analizados resultando en un total de 2,4 ml de D-luciferina que se utiliza.
- Lector de placas Programa para el flash lumiensayo nescence (adaptado de BioTek Gen5 "luminiscencia flash ensayo con inyección", para otros instrumentos sigan las instrucciones del fabricante)
- Ajustar la temperatura a 30 ° C
- Establecer lector de placas para añadir D-luciferina, agitar y leer cada pozo individual.
- Leer luminiscencia (lectura de punto final, 5 segundos de tiempo de integración, 180 niveles de sensibilidad)
- Para el ensayo de recuperación entre cada movimiento de la lectura durante 5 min, 20 min retrasar, y agitar un adicional de 5 min.
- Dispensar 50 l de D-luciferina de un inyector.
- Luminiscencia Precaliente-shock se mide inmediatamente después las células se añaden a los medios de comunicación que contienen cicloheximida para detener la síntesis de proteínas.
- Transferir 100 l de células para cada muestra con el número deseado de repeticiones en un blanco placa de 96 pocillos sólida.
- Los controles deberán incluir un blanco de agua y las células que contienen un vector vacío.
- Inicie la lectura con el SPEcificaciones mencionados anteriormente.
- Para desnaturalizar el resto de FFL de FFL-GFP, se incuba el cultivo de 5 ml en un tubo de cultivo de vidrio a 42 ° C con agitación durante 25 min.
- Lecturas de luminiscencia de ensayo de recuperación comienzan inmediatamente después de las células se retiran de la incubadora, que es punto de tiempo cero. Medida luminiscencia mismo como se describe anteriormente para el primer punto de tiempo y cada 30 min durante 90 min.
- Normalizar las muestras a los valores de luminiscencia de choque de precalentamiento que se han ajustado en base a la OD 600 (dividir los valores de precalentamiento de choque por OD 600).
4. Microscopía de fluorescencia
Este ensayo es un método semi-cuantitativo para determinar la solubilización de los agregados con el tiempo en una población de células.
- La inducción es la misma como se describe en la Sección 2, Etapas 1-8 de protocolos.
- Los mismos puntos de tiempo se toman como se ha descrito anteriormente (Sección 3, Paso 4), pero para micrófonoroscopy recoger 1 ml de células en precalentar-choque y cada punto de tiempo de recuperación, y las muestras se incuban que giran a 30 ° C en tubo de cultivo.
- Visualización:
- Centrifugar 1 ml de células a 6000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular en 2 l de ddH 2 O.
- Mezcle 2 l de células más 2 l de 2% de agarosa de baja fusión en la diapositiva y agregue una hoja de cubierta. Con el fin de obtener un solo plano de células presione ligeramente el dedo en el centro de la hoja de la cubierta y gire hasta que la hoja de la cubierta es difícil de mover.
- Las células se visualizaron utilizando aceite objetivo de 100X microscopio de fluorescencia, el uso de DIC para visualizar las células y el filtro FITC para visualizar la fluorescencia de GFP.
- Tome varias imágenes para cada cepa en cada punto de tiempo para la cuantificación. Los campos para los cuadros deben contener ~ 15 a 30 células para el análisis post-experimental cuantitativa.
- Para calcular el porcentaje de células que contienen agregados de la talla 50Células -100 suman y dividen el número de células que contienen agregados.
5. Soltero Microscopía Celular
Este método se utiliza para seguir la solubilización de los agregados individuales en una sola celda con el tiempo.
- Inducir la expresión FFL-GFP como se describe en la Sección 2, los pasos 1-8.
- Después de choque térmico, las células de centrifugación en tubo cónico de 15 ml a 4400 rpm durante 2 min.
- Lavar las células con 500 l de agua y volver a suspender en 20 l de ddH 2 O.
- Para cada cepa, cortar una sección de 5x5 mm de una placa de agar SC-URA y el uso de la superficie que estaba en contacto con una placa de Petri, pipeta de 4 l de células y se extendió alrededor de la superficie de agar con la punta de la pipeta. Deje reposar durante aproximadamente 1 min.
- Use pinzas para colocar la sección del cubo agar boca abajo en un ~ 55 mm con fondo de cristal plato n º 0 y presione ligeramente hacia abajo.
- Visualización:
- Ver i-iii en la Secciónion 4.
- Set coordina por 2-4 puntos focales para cada cepa en función de la densidad de la cultura.
- Ajuste la cámara al tomar fotografías con una Z-stack con el rango adecuado (- / + 15 m con un grosor de 0,5 a 1,0 micras slice) cada 5 minutos durante un período de 90 min.
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Representative Results
La levadura es dependiente de la disaggregase, Hsp104 se repliegue de manera eficiente las proteínas desnaturalizadas por el calor. La actividad de FFL-GFP se controló después de un choque 25 min calor, utilizando un ensayo de luminiscencia flash de la Figura 1. Los resultados de este ensayo automatizado se muestra en la Figura 2 revelaron un aumento gradual en la actividad de más de 90 min que finalmente condujo a una recuperación> 80% en las células WT. La cepa hsp104Δ recuperó el 19% de la actividad original durante el mismo período de tiempo. Por otra parte, el grado de inactivación inicial fue mucho mayor en la cepa mutante chaperona (26% de actividad en WT y 11% en hsp104Δ) lo que sugiere que puede ser Hsp104 cumple una función protectora de pre-tensión, o rápidamente asociados con desnaturalización FFL-GFP durante la etapa de inactivación térmica para reducir la pérdida de la actividad enzimática.
Microscopía Población corroboró el ensayo de actividad enzimática. Casi todas las células del mutante hsp104D stramantenido en al menos un agregado de FFL-GFP en comparación con el número de agregados en la cepa WT, que disminuyó en un 62% dentro de 90 minutos después de choque térmico (Figura 3). Mientras que un número sustancial de los agregados se formó inmediatamente después de choque térmico en ambas cepas, el número de células WT que contienen agregados disminuyó rápidamente mientras que las células hsp104Δ fallaron para borrar los puntos lagrimales observable. Estos datos corroboran el ensayo de actividad, que mostró una recuperación de 52% de la actividad en WT frente a una recuperación mínima 8% en la cepa hsp104Δ.
Sola célula microscopía automatizada reveló que en las células WT frente a la cepa hsp104Δ, FFL-GFP se solubiliza en una tasa más alta (imágenes fijas representativas se muestran en la Figura 4; ver películas suplementarios para la serie de lapso de tiempo de FFL-GFP de re-solubilización). Además, la dinámica de los agregados de proteínas eran muy diferentes; en las células WT agregados tienden a ser fusionar antes de ser solubilizado, y esto no se observó en la cepa hsp104Δ. Este ensayo no sólo es compatible con los resultados de los otros dos métodos, pero también revela una idea de un posible mecanismo de cómo se solubiliza la proteína agregada y volvió a doblar.
Figura 1. Esquema del ensayo de recuperación de choque térmico FFL-GFP. FFL-GFP expresión se induce en fase de registro en las células que han sido incubadas en SC-URA. Para inducir a las células se incuban en SC-URA-MET durante 1 hora. Centrifugar las células y resuspender en SC-URA que contiene 100 mg / ml de cicloheximida (CHX). Con fines de choque térmico, se incuban las células a 42 º C durante 25 min. Permitir que las células se recuperen mediante la incubación a 30 ° C. Recoger muestras para un curso de 90 min. Para los ensayos enzimáticos D-luciferina se añade antes de cada lectura.ref = target "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" = "_blank"> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 2. FFL-GFP muestras enzimáticas replegamiento / ensayo de recuperación. De células hsp104Δ (100 l) WT y se recogieron antes de choque térmico e inmediatamente después de choque térmico para cada punto de tiempo (0, 30, 60, y 90 min). Tres réplicas de cada muestra fueron en alícuotas en pocillos de una placa de 96 pocillos blanco para cada punto de tiempo. Para las lecturas, el lector de placas fue ajustado para medir la luminiscencia cada 30 min durante 90 min a 30 ° C.
<br /> Figura 3. FFL-GFP replegamiento microscopía. Se recogieron 1 ml de células en cada punto de tiempo (pre-HS, 0, 30, 60, y 90 min) y se centrifugó. Sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 2 l de agua. Las células se prepararon mediante la mezcla con 2 l de agarosa de baja fusión. Las células se visualizaron con el objetivo de aceite de 100X. Imágenes representativas de cada punto de tiempo se muestran. La cuantificación se llevó a cabo contando las células en campos 4-5 y calculando el porcentaje de células que contienen los agregados (n ~ 100).
Figura 4. Sola célula replegamiento curso de tiempo microscopía de FFL-GFP. Se recogieron post-descarga de calor 5 ml de células, se centrifugó y se resuspendió en 20 l de ddH 2 O. 4 l de células se colocaron en un 5 mm 2
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Discussion
En este artículo la proteína modelo FFL-GFP se utilizó para demostrar que el disaggregase levadura, Hsp104 contribuye a la proteína re-solubilización y reparación. Los ensayos enzimáticos y microscopía interrogados diferencialmente el estado de la misma proteína sustrato para determinar la eficiencia y el rendimiento de replegamiento. Resultados de los ensayos de recuperación enzimáticos sugieren que no sólo es la recuperación máxima en la cepa mutante hsp104D ineficiente, pero la magnitud inicial de la tensión despliegue fue mayor en la cepa mutante (Figura 2). El análisis también muestra que mientras que las células hsp104D parecían estar intentando reparación, no fueron capaces de replegar la proteína tan rápidamente como las células WT. Este método permite el análisis sensible y cuantitativo de la actividad FFL-GFP revelar el papel esencial de Hsp104 en la reparación de esta proteína.
Microscopía resultados sugieren que la razón de la reparación ineficaz de la enzima de FFL desnaturalizado se debe to proteína atrapando dentro de los agregados. El análisis de la población mostró que en las células que carecen Hsp104, no hay células podrían eliminar por completo todos los agregados en 90 min (Figura 3). Además, los análisis de células individuales revelaron que los agregados de fusibles con el tiempo, lo que sugiere que la consolidación de los agregados más pequeños en estructuras más grandes pueden ayudar al proceso de reparación y replegamiento (Figura 4). Si bien este resultado no es obvio a partir de las imágenes fijas, películas a intervalos permiten a uno seguir el comportamiento dinámico de los agregados independientes. Observación de los agregados en el transcurso tiempo descubrieron disminución de fusión agregada en la cepa hsp104Δ, lo que indica que estas células no forman las estructuras más grandes como de manera eficiente y Hsp104 lo que sugiere que se requiere para esta faceta de control de calidad de la proteína. Una especulación adicional es que las células pueden solubilizar proteínas más rápidamente de estos agregados de mayor tamaño, que puede contener además la desagregación y la reparación machinery. Microscopía de celda única también se puede utilizar para determinar si otros chaperones y co-chaperonas están presentes en los agregados más grandes frente a más pequeño, y si este patrón de residencia varía con el tiempo.
En conjunto, estos métodos permiten el análisis biológica, tanto bioquímica y celular de replegamiento de proteínas y reparación en las células vivas. La integración de los resultados de los tres métodos descritos proporciona una visión multidimensional en la cinética y la eficiencia de la recuperación celular después de proteotoxic de choque térmico. La automatización de todos o algunos de los pasos en el protocolo también permite mayores tamaños de muestra y biológicos se replica en un experimento dado, el aumento de la robustez y la máxima confianza en el resultado. Además, estos métodos teóricamente se pueden ampliar para utilizar en células humanas y no sólo para los análisis genéticos, sino también para investigar productos químicos que alteran proteostasis.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (NIGMS-074696) a KAM y la Sociedad Americana de Microbiología Robert D. Watkins de Becas de Postgrado Investigación Estudiantil de JLA También agradecemos a John Glover en la Universidad de Toronto para la prestación del FLE -GFP fuente de plásmido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
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