Summary
Cet article décrit l'utilisation d'une protéine de fusion GFP-luciférase Firefly pour enquêter
Abstract
Proteostasis, défini comme l'association de processus de repliement des protéines / biogenèse, le repliement / réparation, et la dégradation, est un équilibre cellulaire délicate qui doit être maintenu pour éviter des conséquences néfastes 1. Les facteurs externes ou internes qui perturbent cet équilibre peut conduire à l'agrégation des protéines, la toxicité et la mort cellulaire. Chez les humains, cela est un facteur majeur contribuant à des symptômes associés à des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer 10. Il est donc essentiel que les protéines impliquées dans le maintien de proteostasis être identifiés afin de développer des traitements pour ces maladies débilitantes. Cet article décrit les techniques de surveillance dans le repliement des protéines in vivo avec une résolution en temps quasi-réel en utilisant le modèle de la protéine luciférase de luciole fusionnée à la protéine fluorescente verte (FFL-GFP). FFL-GFP est une protéine chimérique de modèle unique que le groupement FLE est très sensible au stress induit par misfolding et l'agrégation, qui inactive l'enzyme 12. L'activité luciférase est contrôlée au moyen d'un dosage enzymatique, et la partie GFP propose une méthode de visualisation FFL soluble ou agrégées en utilisant la microscopie automatisée. Ces méthodes couplées intègrent deux approches parallèles et techniquement indépendant pour analyser à la fois le repliement et la réactivation de fonctionnement d'une enzyme après un stress. reprise d'activité peut être directement corrélée avec une cinétique de désagrégation et re-solubilisation de mieux comprendre comment les facteurs de contrôle de la qualité des protéines telles que des protéines chaperons collaborent pour remplir ces fonctions. En outre, la délétion de gènes ou des mutations peuvent être utilisés pour tester les contributions des protéines spécifiques ou des sous-unités protéiques à ce processus. Dans cet article, nous examinons les contributions de la protéine disaggregase Hsp104 13, connu sous le nom de s'associer avec le facteur d'échange Hsp40/70/nucleotide (NEF) système 5 repliement, de repliement des protéines pour valider cette approche.
Introduction
Chez les humains, les maladies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, de Parkinson, et la maladie de Huntington ont été liés à des mauvais repliement des protéines et de l'agrégation 10. Les cellules utilisent des chaperons moléculaires pour empêcher le piégeage cinétique des protéines cellulaires dans les structures inactives mal repliées 6. Chaperons participer à des réseaux d'interactions complexes au sein de la cellule, mais il n'est pas complètement compris comment la somme de ces interactions contribue à proteostasis organismal. L'un des principaux accompagnateurs responsables de la majorité du repliement des protéines cytosolique est le kD protéine de choc thermique 70 (Hsp70) de la famille 19. Il a été montré que la perte de la levure de Hsp70 diminue la capacité de plier naissante FFL exprimée de manière hétérologue et de replier la protéine endogène, ornithine transcarbamoylase, in vivo 18, 7. La capacité d'analyser pliant avec résolution en temps quasi réel facilitera la compréhension comment supplémentaire facteurs cellulaires contribute à ce processus Hsp70-dépendante. En outre, le pliage / repliage des réactions peut ne pas être totalement dépendant de ces protéines qui contribuent, de sorte que les essais doivent être suffisamment sensible pour détecter à la fois petits et grands changements dans la cinétique et l'efficacité.
Le disaggregase de cellules de levure, Hsp104, joue un rôle essentiel dans la réparation de protéines mal repliées agrégées. Bien Hsp104 homologues ont été identifiés dans des champignons et des plantes, cette famille semble être absent chez les métazoaires. Il a été proposé que d'autres chaperons comme ceux de la famille Hsp110 effectuer certaines des activités Hsp104 connus chez les mammifères 16. Hsp104 est un +, complexe protéique hexamérique AAA qui fonctionne dans la levure à des agrégats de protéines de remodeler, contribuant à repliement et la réparation 13. Hsp104, en même temps que la levure Hsp70, SSA1, et la levure Hsp40, Ydj1, est nécessaire pour la récupération du FFL dénaturé dans des cellules de levure 5, 8. La petite protéine de choc thermique, HSP26, a également été montré pour être exirouge pour désagrégation Hsp104 médiée par des FFL 2.
FLP est une protéine à deux domaines qui se lie au substrat luciférine dans le site actif et à la suite d'un changement de conformation qui nécessite l'ATP et de l'oxygène, décarboxyle le substrat libérant oxyluciférine, le dioxyde de carbone (CO 2), l'adénosine monophosphate (AMP), et la lumière 11, 9, 3. Le substrat disponible dans le commerce FFL, D-luciférine, se traduit par l'émission de lumière entre 550-570 nm qui peuvent être détectés à l'aide d'un luminomètre 15. FFL est extrêmement sensible à la dénaturation de traitements chimiques ou à la chaleur et agrégats rapidement au déploiement. Exposée à des températures entre 39-45 ° C FFL est réversible déplié et inactivé 12. En revanche, la GFP et ses dérivés sont très résistantes à la protéine déroulement contraintes 14. Par conséquent fusion de ces deux protéines permet FFL à fonctionner comme une entité expérimentale labile capable de cibler G fonctionnelFP intracellulaire dépôts qui peuvent être visualisées par microscopie de fluorescence à la fois la population et les niveaux de cellules individuelles. Application du dosage enzymatique dans un lecteur de plaque multimode semi-automatisé couplé à la microscopie automatisée permet une évaluation simultanée sans précédent de la cinétique et le rendement de repliement réactions. En outre, la génétique moléculaire faciles du modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae permet à la fois une manipulation précise du réseau de contrôle de la qualité des protéines et de la possibilité d'adopter des approches basées sur la découverte d'identifier de nouveaux acteurs qui contribuent à la réponse au stress cellulaire et proteostasis.
Dans cette étude, les souches de type sauvage (WT) et HSP104 suppression exprimant FFL-GFP sont soumis à un choc thermique dénaturation des protéines. FFL-GFP repliement est contrôlé à la fois par un dosage enzymatique et la microscopie en lecture proxy pour la réparation du protéome exprimé sur un parcours de temps de récupération. Par rapport aux cellules WT, nous montrons ee souche de suppression Hsp104 est environ 60% moins efficace au repliement FFL-GFP, en soutenant les conclusions antérieures établissant un rôle à jouer dans la réactivation de Hsp104 dénaturé FFL 2.
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Protocol
1. Construction de souches contenant FFL-GFP plasmide
Pour cette étude, la souche Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) a été utilisé avec une souche de suppression HSP104 de la collection de finale de levure (Open Biosystems / Thermo Scientific). La suppression a été confirmée en utilisant un anticorps spécifique pour Hsp104 analyse Western blot.
FFL-GFP a été exprimée à partir p426MET25-FFL-GFP, construit à partir d'une source LEU2 basée plasmide obtenu par le laboratoire Glover à l'Université de Toronto 17 et obtenue sur simple demande aux auteurs. L'expression de la protéine de fusion GFP-FLP plasmide est contrôlé par le promoteur répressible par la méthionine MET25. Le plasmide a été transformé dans chaque souche en utilisant un protocole a été adapté à partir de Gietz et. al, 1995,
- Centrifuger 25 ml o f cellules en phase logarithmique dans un tube conique de 50 ml à 4400 tours par minute pendant 2 min, laver avec 500 pi de la double H 2 0 distillée (trou DDH 2 O) et jeter le surnageant.
- Remettre les cellules dans 250 pi de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, 0,1 M d'acétate de lithium). Incuber à 30 ° C sans mélanger pendant 20 min.
- Transférer 50 ul de cellules compétentes dans un nouveau tube avec 5 ml (50 pg) d'ADN porteuse et 5 pi (0,1-5 mg) d'ADN plasmidique. Ajouter 300 ul de PEG / TE / LiAc (comme TE / LiAc plus 40% de polyéthylène glycol) à ce mélange, et les cellules incuber à 30 ° C pendant 30 min.
- Ajouter 1/10 de volume (v / v) de DMSO (36 pi) à ce mélange et un choc thermique à 42 ° C pendant 6 min.
- Centrifugeuse mélange à 6000 rpm pendant 30 secondes et enlever le surnageant. Reprendre les cellules dans 100 ul de ddH 2 0 et les cellules stériles de la plaque sur un média synthétique complet sans uracile (SC-URA).
2. Induction de la FFL-GFP
nt "> FLP-GFP est induite lorsque les cellules sont en phase exponentielle de sorte que la majorité de la protéine avant le choc thermique a été récemment effectuée pour éviter les protéines qui ont terminale agrégées au fil du temps en raison de lacunes cellulaires associées au vieillissement.- Jour 1: Incuber les cellules dans 5 ml de SC-URA à 30 ° C en rotation O / N.
- Jour 2: Mesure OD 600 et cultures fraîches ensemencer 5 ml de SC-URA DO600 ~ 0,2.
- Incuber des cultures avec rotation à 30 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent la phase logarithmique OD 600 ~ 0.8-1.0.
- Centrifuger les cellules dans 15 ml tubes coniques à 4400 rpm pendant 3 min, décanter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de trou DDH 2 0; solution de transfert dans un tube à centrifuger.
- Centrifuger à 6000 rpm et jeter le surnageant.
- Reprendre les cellules dans 5 ml de SC-URA-MET. Les cellules doivent être incubées tournant dans ce milieu pendant 1 heure à 30 ° C.
- Centrifuger les cellules et lavage de répétition dans le trou DDH 2 0 et jeter le surnageant.
- Resuspecellules nd dans 5 ml médias SC-URA contenant 100 ug / ml de cycloheximide pour inhiber l'expression de la protéine, et procéder immédiatement à l'étape 3.
3. Enzymatique FFL-GFP Recovery Assay
Ce test est une approche quantitative pour déterminer les niveaux d'enzyme active dans la population.
- La préparation de ce test:
- Mesurer OD 600 pour chaque échantillon.
- Préparer la quantité nécessaire de D-luciférine requises en fonction du nombre d'échantillons et le nombre de répétitions, plus environ 1.200 pi pour le tube désiré. Concentration finale de D-luciférine est d'environ 23 mg par 100 pi de cellules. Initialement, il est dissous dans l'eau à une concentration de la solution mère de 7,5 mg / ml et dilué à 455 ug / ml dans SC avant d'expérimenter. Dans la figure 2, trois répétitions pour chaque échantillon ont été analysés pour un total de 2,4 ml de D-luciférine utilisé.
- lecteur de plaque Programme pour le flash Lumitest de nescence (adapté de BioTek Gen5 "Essai de Flash Luminescence avec injection", pour d'autres instruments suivent les instructions du fabricant)
- Réglez la température à 30 ° C
- Ensemble lecteur de plaque d'ajouter D-luciférine, agiter et lire chaque puits individuellement.
- Lire la luminescence (lecture de point final, 5 temps d'intégration sec, 180 niveaux de sensibilité)
- Pour le dosage de récupération entre chaque tremblement de lecture pendant 5 min, 20 min retarder, et secouer encore 5 min.
- Distribuer 50 l de D-luciférine d'un injecteur.
- Luminescence Préchauffer-choc est mesuré immédiatement après que les cellules sont ajoutés à un milieu contenant du cycloheximide pour stopper la synthèse des protéines.
- Transférer 100 ul de cellules pour chaque échantillon avec nombre désiré de répétitions en blanc plaque de 96 puits solide.
- Les contrôles doivent inclure une ébauche de l'eau et des cellules contenant un vecteur vide.
- Lancer la lecture avec la SPEcifications énumérés ci-dessus.
- Pour dénaturer le groupement FLE de FFL-GFP, incuber la culture 5 ml dans un tube de culture en verre à 42 ° C en agitant pendant 25 min.
- Récupération de lectures de luminescence de dosage commence immédiatement après que les cellules sont retirées de l'incubateur, qui est le temps zéro. Mesure de la luminescence mêmes que celles décrites plus haut pour le premier point temporel et toutes les 30 minutes pendant 90 minutes.
- Normaliser échantillons de valeurs de luminescence-choc préchauffage qui ont été ajustés en fonction de la DO 600 (diviser les valeurs de préchauffage-choc par OD 600).
4. Fluorescence Microscopy
Ce test est une méthode semi-quantitative pour déterminer la solubilisation des agrégats au fil du temps dans une population de cellules.
- L'induction est le même que celui décrit dans la section 2, les étapes 1-8 de protocoles.
- Les mêmes points de temps sont considérés comme décrit ci-dessus (section 3, étape 4), mais pour microroscopie recueillir 1 ml de cellules à préchauffer-choc et chaque point de temps de récupération, et les échantillons incuber rotation à 30 ° C dans un tube de culture.
- Visualisation:
- Centrifugeuse 1 ml de cellules à 6000 rpm pendant 30 secondes et supprimer surnageant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 pi de trou DDH 2 O.
- Mélanger 2 pl de cellules plus 2 pi de 2% d'agarose bas point de fusion de la diapositive et ajouter une lamelle. Afin d'obtenir un seul plan de cellules appuyez légèrement doigt vers le bas au centre de la lamelle et tourner jusqu'à ce que la lamelle est difficile de se déplacer.
- Les cellules sont visualisés à l'aide objective de l'huile sur le 100X microscope à fluorescence; utiliser DIC pour visualiser les cellules et le filtre FITC pour visualiser fluorescence de la GFP.
- Prenez plusieurs photos pour chaque souche à chaque point de temps pour la quantification. Les champs pour les photos doivent contenir des cellules ~ 15-30 pour l'analyse quantitative post-expérimentale.
- Pour calculer le pourcentage de cellules contenant des agrégats, comptez 50Cellules -100 totale et divisez le nombre de cellules contenant des agrégats.
5. Simple microscopie cellulaire
Ce procédé est utilisé pour suivre la solubilisation des agrégats individuels dans une seule cellule au cours du temps.
- Induire l'expression FFL-GFP comme décrit dans la section 2, les étapes 1-8.
- Après un choc thermique, les cellules de centrifugeuses dans 15 ml tube conique à 4400 rpm pendant 2 min.
- Laver les cellules avec 500 pi d'eau et remettre en suspension dans 20 pl de trou DDH 2 O.
- Pour chaque souche, découper une section 5x5 mm d'une plaque de gélose SC-URA et l'utilisation de la surface qui est en contact avec une boîte de Pétri, pipette 4 pi de cellules et se répandre surface de l'agar avec embout de pipette. Laisser reposer pendant ~ 1 min.
- Utilisez des pinces pour placer section cube de gélose face vers le bas sur une ~ 55 mm à fond de verre plat n ° 0 et appuyez légèrement.
- Visualisation:
- Voir i-iii dans Section 4.
- Définir les coordonnées 2-4 points focaux pour chaque souche en fonction de la densité de la culture.
- Ensemble appareil photo pour prendre des photos avec un Z-stack avec une gamme appropriée (- / + 15 um d'épaisseur de la tranche 0,5-1,0 pm) toutes les 5 minutes pendant une période de 90 min.
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Representative Results
La levure est dépendante de la disaggregase, Hsp104 se replier efficacement des protéines dénaturées par la chaleur. L'activité des FFL-GFP a été contrôlé après un choc thermique de 25 min, en utilisant un dosage flash luminescence Figure 1. Les résultats de ce test automatisé montre la figure 2 ont révélé une augmentation progressive de l'activité de plus de 90 min qui a finalement conduit à une récupération> 80% des cellules WT. La souche hsp104Δ récupéré 19% de l'activité initiale au cours de la même période. Par ailleurs, la mesure de l'inactivation initiale était beaucoup plus élevé dans la souche mutante de chaperon (26% d'activité en WT et 11% en hsp104Δ) suggérant que Hsp104 peut être purgeait un rôle protecteur pré-stress, ou rapidement associés à la dénaturation FFL-GFP au cours de la étape d'inactivation thermique pour réduire la perte de l'activité enzymatique.
microscopie de la population a corroboré l'analyse de l'activité enzymatique. Presque toutes les cellules du mutant hsp104D straà maintenir au moins un agrégat FFL-GFP par rapport au nombre d'agrégats dans la souche WT, qui a diminué de 62% en 90 min après choc thermique (Figure 3). Alors qu'un nombre important d'agrégats formés immédiatement après un choc thermique dans les deux souches, le nombre de cellules WT contenant des agrégats diminue rapidement alors que les cellules hsp104Δ n'ont pas réussi à effacer les points lacrymaux observable. Ces données corroborent l'analyse de l'activité, qui a montré une récupération de 52% de l'activité dans WT contre une reprise minimal de 8% dans la souche hsp104Δ.
Une seule cellule microscopie automatisée révélé que dans les cellules WT contre la souche hsp104Δ, FFL-GFP a été solubilisé à un taux supérieur (images fixes représentatives sont présentés dans la figure 4; voir des films supplémentaires pour la série time-lapse de FFL-GFP re-solubilisation). En outre, la dynamique des agrégats de protéines sont très différentes; dans les cellules WT agrégats ont tendance à fusionner être avant d'être solubilisé, et cela n'a pas été observée dans la souche hsp104Δ. Ce test ne soutient pas seulement les résultats des deux autres méthodes, mais révèle également de découvrir un mécanisme possible de la façon dont la protéine agrégée est solubilisée et repliée.
Figure 1. Schéma du test de récupération de choc thermique FFL-GFP. Expression FFL-GFP est induite dans la phase logarithmique dans les cellules qui ont été incubées dans SC-URA. Pour induire les cellules incuber dans SC-URA-MET pendant 1 heure. Centrifuger les cellules et remettre en suspension dans SC-URA contenant 100 ug / ml de cycloheximide (CHX). Pour de choc thermique, incuber les cellules à 42 ° C pendant 25 min. Permettent aux cellules de se remettre en incubant à 30 ° C. Prélever des échantillons pour un cours de temps de 90 min. Pour les dosages enzymatiques D-luciférine est ajouté avant chaque lecture.ref = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 2. FFL-GFP échantillons enzymatiques repliement / de test de récupération. Des cellules hsp104Δ (100 pi) WT et ont été recueillis avant le choc thermique et immédiatement après un choc thermique pour chaque point de temps (0, 30, 60 et 90 min). Trois répliques de chaque échantillon ont été distribué dans chaque puits d'une plaque blanche à 96 puits pour chaque point de temps. Pour les mesures, le lecteur de plaque a été réglé pour mesurer la luminescence toutes les 30 min pendant 90 min à 30 ° C.
<br /> Figure 3. Repliement microscopie FFL-GFP. 1 ml de cellules à chaque moment (pré-HS, 0, 30, 60 et 90 min) a été recueilli et centrifugé. Surnageant a été aspiré et les cellules sont remises en suspension dans 2 pl d'eau. Les cellules ont été préparées en mélangeant avec 2 pi de bas point de fusion d'agarose. Les cellules ont été visualisées en utilisant l'objectif de l'huile 100X. Des images représentatives de chaque point de temps sont affichés. La quantification a été réalisée par comptage des cellules dans 4-5 domaines et en calculant le pour cent de cellules contenant des granulats (n ~ 100).
Figure 4. Seule cellule repliement cours du temps de la microscopie de FFL-GFP. Poster un choc thermique 5 ml de cellules ont été recueillies, centrifugé et remis en suspension dans 20 pl de trou DDH 2 O. 4 pi de cellules ont été placés sur un 5 mm 2
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Discussion
Dans cet article, la protéine modèle FFL-GFP a été utilisé pour montrer que le disaggregase de levure, Hsp104 contribue à la protéine re-solubilisation et de réparation. Les dosages enzymatiques et la microscopie interrogés de façon différentielle l'état de la même protéine substrat pour déterminer l'efficacité et le rendement de repliement. Les résultats des tests de récupération enzymatiques suggèrent que non seulement la récupération maximale de la souche mutante hsp104D inefficace, mais l'ampleur initiale de la contrainte de déploiement était plus élevé dans la souche mutante (Figure 2). L'analyse montre également que tandis que les cellules hsp104D semblait vouloir réparation, ils ont été incapables de replier la protéine aussi rapidement que les cellules WT. Cette méthode a permis une analyse sensible et quantitative de l'activité FFL-GFP révélant le rôle essentiel de Hsp104 dans la réparation de cette protéine.
résultats de microscopie suggèrent que la raison pour la réparation inefficace des FFL enzyme dénaturée est due to protéines piégeage dans les agrégats. L'analyse de la population a montré que dans des cellules dépourvues de Hsp104, aucun cellules pourraient complètement effacer tous les agrégats en 90 min (Figure 3). En outre, les analyses de cellules isolées ont révélé que les agrégats fusible au fil du temps, ce qui suggère que la consolidation des agrégats plus petits dans des structures plus importantes peuvent faciliter le processus de réparation et de repliement (figure 4). Bien que ce résultat n'est pas évident d'après les images fixes, vidéos accélérées permettent de suivre le comportement dynamique des agrégats indépendants. Observation des agrégats au cours du temps découvert diminué fusion totale dans la souche hsp104Δ, indiquant que ces cellules ne forment pas les grandes structures aussi efficacement et en suggérant que Hsp104 est requis pour cette facette du contrôle de la qualité des protéines. Une autre spéculation est que les cellules peuvent solubiliser la protéine plus rapidement à partir de ces agrégats plus grands, qui peuvent contenir en outre la désagrégation et la réparation machines. Microscopie à cellule unique peut également être utilisé pour déterminer si d'autres chaperons et co-accompagnateurs sont présents dans les agrégats plus grands par rapport à petit, et si cette tendance résidence varie au fil du temps.
Ensemble, ces méthodes permettent une analyse biologique à la fois biochimiques et cellulaires de repliement de protéines et de réparation dans les cellules vivantes. L'intégration des résultats des trois méthodes décrites offre un aperçu multidimensionnel dans la cinétique et l'efficacité de la récupération cellulaire après protéotoxique choc thermique. L'automatisation de certaines ou de toutes les étapes du protocole permet également de grandes tailles d'échantillons biologiques et se réplique dans une expérience donnée, l'augmentation de la robustesse et de la confiance dans le résultat final. En outre, ces méthodes peuvent théoriquement être étendus à utiliser dans les cellules humaines, et pas seulement pour des analyses génétiques, mais aussi d'enquêter sur des substances chimiques qui altèrent proteostasis.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health (NIGMS-074696) pour KAM et un American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Fellowship de recherche des étudiants à JLA Nous remercions aussi John Glover à l'Université de Toronto pour fournir la FFL -GFP source de plasmide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
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