Summary
Nous passons en revue nos résultats récents sur l'intégration de la microscopie à fluorescence et des outils d'imagerie cytométrie en flux sur un téléphone portable à l'aide compacts et rentables opto-fluidiques pièces jointes. Ce téléphone portable sur la base de micro-analyse pourrait être utile pour l'analyse cytométrique, telles que l'exécution de tâches diverses cellules de comptage ainsi que pour criblage à haut débit d'échantillons d'eau, par exemple, dans les pays à ressources limitées.
Abstract
Microscopie à fluorescence et la cytométrie de flux sont largement utilisés dans les outils de recherche biomédicale et le diagnostic clinique. Cependant, ces dispositifs sont en général relativement encombrant et coûteux, ce qui les rend moins efficaces dans les pays à ressources limitées. Pour remédier à ces limitations potentiellement, nous avons récemment démontré l'intégration de grand champ microscopie à fluorescence et des outils d'imagerie cytométrie en flux sur des téléphones cellulaires à l'aide compact, léger et rentables opto-fluidiques pièces jointes. Dans notre conception de la cytométrie en flux, les cellules marquées par fluorescence sont vidées à travers un canal microfluidique qui est positionné au-dessus de l'unité caméra de téléphone cellulaire existant. Alimentée par batterie de diodes électroluminescentes (DEL) sont bout à bout couplé au côté de la puce microfluidique, qui agit effectivement comme un guide d'onde multimode dalle, où la lumière d'excitation est guidé à exciter de manière uniforme les cibles fluorescentes. L'appareil photo du téléphone portable enregistre un film laps de temps des cellules fluorescentes traversantle canal microfluidique, où les trames numériques de ce film sont traitées pour compter le nombre de cellules marquées dans la solution cible d'intérêt. L'utilisation d'un analogue opto-fluidique conception, nous pouvons également l'image de ces cellules marquées par fluorescence en mode statique par exemple en sandwich les particules fluorescentes entre deux lames de verre et de capturer leurs images fluorescentes utilisant l'appareil photo du téléphone portable, qui peut atteindre une résolution spatiale de ~ par exemple, 10 um sur une très large champ de vision de ~ 81 mm 2. Ce téléphone portable basé fluorescente cytométrie en flux et l'imagerie plateforme de microscopie peut être utile en particulier dans les pays à ressources limitées, par exemple pour le comptage des cellules T CD4 + vers le suivi des patients VIH + ou pour la détection des parasites transmis par l'eau dans l'eau potable.
Introduction
Microscopie et cytométrie de flux sont largement utilisées techniques 1-12 dans la recherche biomédicale et scientifique ainsi que le diagnostic clinique pour le comptage et la caractérisation des différents types cellulaires. Toutefois, les microscopes conventionnels et instruments de cytométrie en flux sont relativement complexes et coûteux, ce qui limite leur utilisation à bien établies principalement des laboratoires centraux. Récemment, nous avons développé une cytométrie en imagerie fluorescente compacte et légère et un dispositif de microscopie intégrée sur un téléphone portable, ce qui montre 13,14 promesse de rapport coût-efficacité traduire microscopie à fluorescence, cytométrie de flux liés à micro-techniques d'analyse pour les environnements à ressources limitées pour diverses applications de la télémédecine impact sur la santé mondiale.
Dans le optofluidic cytométrie de flux de configuration (voir par exemple la figure 1C et 1D), une mesure conçus polydiméthylsiloxane (PDMS) canal microfluidique est basée positioned en avant de la cellule-téléphone appareil photo-unité, où la lumière d'émission des diodes électroluminescentes (DEL) sont bout à bout couplés aux bords du canal. Cette puce microfluidique, avec l'échantillon liquide à l'intérieur, forme un guide d'onde plan opto-fluidique (par exemple composé de PDMS-liquide-PDMS) de telle sorte que la lumière d'excitation est guidé à pomper de manière uniforme les échantillons marqués par fluorescence à l'intérieur du canal de micro-. L'émission de fluorescence de ces objets étiquetés, par exemple des cellules, est de plus imagées par une lentille supplémentaire placée juste après la cellule-téléphone-appareil photo-unité et est mappé sur le téléphone portable Complementary Metal-Oxide-Semiconductor capteur d'image (CMOS). Depuis l'émission de fluorescence est collectée perpendiculaire à la trajectoire de la lumière d'excitation, un filtre d'absorption est peu coûteux en matière plastique suffisante pour éliminer la lumière d'excitation diffusée et peut fournir une bonne zone sombre fond requis pour l'imagerie de fluorescence. L'utilisation d'un analogue opto-fluidique conception, nous pouvons aussi l'image des objets fluorescents dans statIC mode (voir Figure 1A et 1B), dans lequel les particules fluorescentes sont pris en sandwich entre deux lames de verre au lieu de s'écouler à travers un canal microfluidique et l'émission de fluorescence à partir de ces particules fluorescentes sont capturées par le capteur de téléphone portable d'image CMOS pour le comptage de particules et caractérisation. En fonction des besoins des différentes applications, cytométrie en flux ou à grand champ de microscopie fluorescente peut être choisi. Par exemple, téléphone cellulaire dispositif de cytométrie en flux pourrait être particulièrement utile pour le criblage de grands volumes d'échantillons liquides (par exemple, quelques ml) pour la détection de cellules rares ou d'agents pathogènes.
Dans ce manuscrit, nous examinons certains de nos résultats récents sur l'intégration de la microscopie à fluorescence et des outils d'imagerie cytométrie en flux sur un téléphone portable à l'aide compacts et rentables opto-fluidiques pièces jointes. Ce téléphone portable à base de micro-analyse, la cytométrie en imagerie et plates-formes spatiales pourraient offrir des possibilités différentespour le diagnostic de la télémédecine et le point-of-care, surtout des répercussions sur notre lutte contre les défis mondiaux pour la santé dans les régions ressources limitées de la planète.
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Protocol
Dans cette section, nous présentons les protocoles expérimentaux pour notre téléphone portable basée à grand champ microscopie à fluorescence 13 et opto-fluidique plate-forme de cytométrie en imagerie 14. Nous allons utiliser des billes fluorescentes marquées par fluorescence et les globules blancs pour tester ces plates-formes d'imagerie.
A. Préparation de Cell-phone Basé à grand champ microscope à fluorescence et opto-fluidique cytomètre de flux d'imagerie
Le téléphone portable basée à grand champ microscope à fluorescence ou cytométrie en flux est constitué de deux parties principales: un téléphone appareil photo et un compact opto-fluidique add-on accessoire.
1. La Camera Phone
Alors que les techniques présentées sont applicables à presque n'importe quel téléphone-appareil photo, nous avons choisi Sony Erickson Aino comme base pour ces appareils. Ce téléphone portable dispose d'un ~ 8 mégapixels CMOS RVB capteur installé sur elle et une lentille intégrée qui a une distance focale (f 1) de ~ 4,65 mm. 2. Opto-fluidique de fixation pour grand champ microscopie fluorescente
L'attachement optique est créé par Autodesk et est imprimé par une dimension Elite imprimante 3-D en utilisant ABSplus matériau thermoplastique. Dans ce processus d'impression, des matériaux modèles et de support sont chauffés dans une tête d'extrusion à l'intérieur de l'imprimante et sont déposés par couches sur une base de modélisation. Lorsque cette étape est terminée, le matériau de support peut être dissoute, laissant un modèle robuste 3D du prototype désiré Notre conception de l'attachement optique est constitué de LED (longueur d'onde centrale à ~ 470 nm, Digikey), un filtre en plastique (# NT54-46, Edmund optique), un plateau d'échantillon, et une lentille plan-convexe f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Tous les voyants et les filtres en plastique peuvent être facilement modifiés en fonction des spectres des fluorophores. Les étapes de montage de cette pièce jointe opto-fluidiques comprennent:
- Placer la lentille dans la fixation à l'intérieur de sa position de support de lentille spécifique.
- Placer le filtre en matière plastique sur le plateau de filtre et le faire glisser dans la fixation, ou le filtre de bande en matière plastique en face de l'objectif de l'appareil de téléphone cellulaire.
- Insérez le bac à LED dans la pièce jointe.
- Placer les lames de verre dans le bac d'échantillon de l'échantillon. Faites glisser le bac d'échantillon dans la pièce jointe. Relever les LEDs vers l'échantillon.
- Fixez le fixation sur le téléphone portable, de sorte que la lentille supplémentaire est directement en contact avec la lentille de la caméra du téléphone portable.
- Utilisez le commutateur sur la pièce jointe pour allumer les LED.
- L'image de l'échantillon d'intérêt avec la caméra du téléphone portable en utilisant son «mode nuit».
3. Opto-fluidique de fixation pour l'imagerie de fluorescence Cytométrie
Quand il ya une nécessité d'analyser de grands volumes d'échantillons liquides pour la détection d'événements rares, optofluidic appareil de cytométrie en flux peut être préféré. Nous pouvons modifier notre vaste domaine de la conception microscope à fluorescence et de le convertir en un cytomètre en flux, wici une chaîne à base de PDMS microfluidique est utilisé pour fournir continuellement de l'échantillon liquide à travers le volume d'imagerie. L'attachement optique est également conçu par Autodesk et imprimé par l'imprimante Dimension Elite 3-D. Il consiste également à LEDs (longueur d'onde centrale à ~ 470 nm, Digikey), un filtre en plastique (# NT54-46, Edmund Optics), un plateau d'échantillons, et une lentille asphérique (f = 4,5 mm) (produit # C230TME-A; Thorlab). Les étapes de montage de cette pièce jointe opto-fluidiques comprennent:
- Placez la lentille asphérique dans la pièce jointe.
- Placer le filtre en matière plastique sur le plateau de filtre et le faire glisser dans la fixation, ou le filtre de bande en matière plastique en face de l'objectif de l'appareil portable.
- Faites glisser le canal microfluidique dans le même opto-fluidique pièce jointe.
- Fixez le fixation sur le téléphone portable de sorte que la lentille supplémentaire est directement en contact avec la lentille de la caméra du téléphone portable.
- Utilisez le commutateur sur la pièce jointe pour allumer les LED.
- Branchez le microfluidiqueIC canal de la pompe à seringue et fournir l'échantillon de liquide dans le dispositif microfluidique à un débit constant.
- Capturer un film des cellules fluorescentes / particules circulant dans le canal microfluidique en utilisant le mode vidéo de l'appareil photo du téléphone portable.
Préparation de l'échantillon B.
4. Préparation de particules fluorescentes micro-échantillons
- Billes fluorescentes avec un diamètre de 10 um (perles rouges: # Produit F8834 excitation / émission 580nm/605nm; perles vertes: # Produit: F8836 excitation / émission 505nm/515nm) sont achetés chez Invitrogen (Carlsbad, CA).
- Mélanger 10 ul de billes fluorescentes vertes, 10 ul de billes fluorescentes rouges avec 40 ul d'eau DI.
- Place10 ul de ce mélange de billes sur une lame de verre à l'aide d'une micropipette et mettre une autre lame de verre sur le dessus de celui-ci pour réaliser une structure en sandwich.
- Insérer cette structure en sandwich dans le bac de l'échantillon et faites-le glisser dans la fixation du téléphone portable.
5. Préparation du marquées par fluorescence White Blood Cells
- Prenez SYTO16 acide nucléique marquage fluorescent kit (# S7578, Life Technology) et du tampon phosphate salin (PBS) à partir du réfrigérateur et de les amener à température ambiante.
- Transférer 200 ul d'échantillon de sang entier du tube de collecte de sang EDTA à 1,5 ml tube en polystyrène (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Ajouter 1 ml de tampon de lyse des globules rouges (# R7757, Sigma-Aldrich) à l'échantillon de 200 ul de sang entier et bien mélanger.
- Après 5 min, centrifuger l'échantillon de sang lysé et retirer la solution surnageante.
- Remettre en suspension le culot de globules blancs dans 200 pi de tampon PBS et les mélanger délicatement.
- Ajouter 5 pl 1 mM SYTO16 solution de l'échantillon de globules blancs. Envelopper l'échantillon de papier d'aluminium et laisser incuber dans un environnement sombre pour ~ 30 min.
- Centrifuger l'échantillon à nouveau. Surnageant est éliminé et le étiquetés de globules blancs culot est reEn suspension dans le tampon PBS.
- Placer pl 5-10 marqué échantillon liquide blanc sang cellule à une lamelle couvre-objet, et placer une lamelle couvre-objet sur la seconde surface de l'échantillon.
- Insérez la diapositive échantillon pris en sandwich dans le bac d'échantillon et l'image à l'aide du microscope téléphone portable fluorescent.
Sinon
- Offrir continuellement les cellules marquées par fluorescence globules blancs à travers un canal microfluidique en utilisant une pompe à seringue automatisée, tout en capturant un film fluorescent microscopique des cellules qui coule avec l'appareil photo du téléphone portable en mode vidéo. Il faut aussi souligner que d'une pompe seringue batterie portable alimenté ou même la force de gravité peut être utilisé pour entraîner l'écoulement dans le canal microfluidique.
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Representative Results
Avec notre opto-fluidique de pompage / d'excitation régime (figures 1C et 1D), les cellules marquées par fluorescence peut être délivré en continu dans le canal microfluidique en utilisant une pompe à seringue lorsque l'appareil photo du téléphone portable enregistre un time-lapse film fluorescent microscopique des cellules qui coule. Ces films fluorescents peuvent ensuite être rapidement analysées à l'aide du contour de détection et de poursuite des algorithmes 14,15 pour déterminer automatiquement le nombre absolu et la densité des cellules s'écoulant à travers les canaux microfluidiques, la fonction de prise d'une image fluorescente d'écoulement cytomètre. Basé sur la plate-forme décrite ci-dessus (figures 1C et 1D) et des protocoles de préparation des échantillons, nous avons démontré un comptage précis du total des blancs-sang-cellules (globules blancs) dans des échantillons de sang humain, atteindre des résultats comparables contre un analyseur d'hématologie norme 14. Alternativement, nous pouvons aussi l'image des cellules fluorescentes / particulesen mode statique, 13 de sorte que sans écoulement fluidique, la réalisation d'un très grand échantillon champ de vision de 81 mm par exemple ~ 2 avec une résolution spatiale de ~ 10 um, comme illustré dans les figures 2 et 3 par exemple. Les sources d'aberration optique peut être réduit par la conception d'un système de lentilles plus complexe. En variante, il peut également être partiellement corrigé par traitement d'image numérique en caractérisant la source de l'aberration et de leurs structures spatiales.
Figure 1. Représentation schématique (A) et (B) illustration photo d'un téléphone portable à base large champ microscope à fluorescence 13. Schéma (C) et (D)photo d'un téléphone portable cytomètre de flux d'imagerie basée sur 14. Cliquez ici pour agrandir la figure .
. Figure 2 La performance de notre téléphone portable microscope à fluorescence basé sur 13 est caractérisé par des perles d'imagerie fluorescente (10 pm de diamètre des perles vertes et rouges, rouge d'excitation billes / émission: 580 nm nm/605, vert perle d'excitation: 505 nm nm/515 ). Une qualité d'image décente est réalisée sur un champ de vision d'environ 81 mm 2, voir (A, B, C). Vers les bords de cette centrale champ de vue, il ya des régions aberration; voir par exemple (DE).
Figure 3 Image du haut:. Téléphone cellulaire images marquées par fluorescence de globules blancs 13 (A-1):. Zoom numérique téléphone portable image de marquage fluorescent globules blancs cultivés à partir de l'image du haut. (A-2): la compression de résultats de décodage pour l'image 18 du téléphone portable représenté en (A-1). (A-3): Conventionnel microscope à fluorescence (objectif 10X, NA = 0,25) image de comparaison du même champ de vision.
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Discussion
Nous avons présenté nos résultats récents sur téléphone portable basée à grand champ microscopie à fluorescence et opto-fluidique cytométrie en flux en utilisant l'imagerie léger et compact opto-fluidiques des pièces jointes à des téléphones cellulaires caméras. L'utilisation de cette plate-forme technologique, nous imagée objets fluorescents y compris les micro-particules et étiquetés de globules blancs dans les échantillons de sang total. Par conséquent, cette compacte et rentable téléphone portable boîte à outils basée sur l'imagerie de fluorescence peut être utile pour le point-of-care diagnostic, en particulier dans les régions ressources limitées pour lutter contre divers problèmes de santé mondiaux, tels que le suivi des patients VIH + pour leurs lymphocytes T CD4 + compte .
Outre l'analyse de fluides corporels, le même téléphone portable basé sur la plate-forme de cytométrie opto-fluidique peut également être utile pour les besoins de détection tels que la quantification des dosages immunologiques par fluorescence pour la surveillance par exemple de l'eau / nourriture de qualité à ressources limitées. À cette fin, nous avons récemment démonstrated sensible, spécifique et rapide de détection de Escherichia coli O157: H7 (E. coli) dans des échantillons d'eau et de lait en utilisant le même opto-fluidique téléphone portable fixation 16. Nous avons utilisé la surface fonctionnalisée capillaires en verre pour capturer spécifiquement et sensible E. particules coli dans des échantillons liquides qui ont été parcourus par chaque capillaire. Ces capturé E. particules coli ont été plus marqués avec points quantiques (QD) anticorps secondaires conjugués. L'émission fluorescente à partir de ces capillaires fonctionnalisé est ensuite détecté à l'aide de la plate-forme opto-fluidique imagerie téléphone portable et l'intensité intégrée de fluorescence le long de la longueur du capillaire a été utilisé pour estimer la densité de la capture E. coli particules dans la solution cible. Grâce à cette approche opto-fluidique, nous avons démontré une limite de détection de ~ UFC 5-10 / ml dans de l'eau et des échantillons de lait 16.
Enfin, il faut noter que selon le til besoins de l'application, le grossissement optique et de la résolution de cette plate-forme peut être ajustée en changeant f / f 2, où f est la distance focale de la lentille de la caméra de téléphone cellulaire et f 2 est la distance focale de la lentille externe (figure 1A) . En plus de grossissement du système, nous devrions également noter que le plateau de LED et le filtre associé peut facilement être modifié pour des couleurs différentes pour s'adapter aux différents fluorophores ou des tests immunochromatographiques même qui pourraient être utilisés dans des applications spécifiques 17.
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Disclosures
Dr Ozcan est le fondateur d'une start-up qui vise à commercialiser l'imagerie informatique et des outils de microscopie.
Acknowledgments
A. Ozcan est reconnaissant du soutien du prix en début de carrière présidentielle pour scientifiques et ingénieurs (PECASE), Army Research Office (ARO) Prix du jeune chercheur de la National Science Foundation (NSF) Prix CARRIÈRE, Office of Naval Research (ONR) Prix du jeune chercheur et les National Institutes of Health (NIH) Prix du directeur du New Innovator DP2OD006427 du Bureau du Directeur, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
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