Summary
我々は、コンパクトでコスト効果の高い光流体添付ファイルを使用して携帯電話上の蛍光顕微鏡やイメージングフローサイトメトリーツールの統合、我々の最近の結果を確認します。これらの携帯電話基にしたマイクロ分析装置は、以下のようなリソースが限られた設定で、例えば、水試料のハイスループットスクリーニングのためだけでなく、様々な細胞計数タスクを実行するように、フローサイトメトリー分析のために有用かもしれません。
Abstract
蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーは、広く生物医学研究と臨床診断のツールを使用されています。しかし、これらのデバイスは、リソースが限られた設定で、それらはあまり効果的なもの、一般的には相対的にかさばるし、高価である。潜在的に、これらの制限に対処するために、我々は最近、小型·軽量、かつ費用対効果の高い光流体添付ファイルを使用して携帯電話で広視野の蛍光顕微鏡やイメージングフローサイトメトリーツールの統合を実証している。私たちのフローサイトメトリーの設計では、蛍光標識された細胞は、既存の携帯電話のカメラユニットの上方に位置しているマイクロ流体チャネルを介してフラッシュされます。電池式発光ダイオード（LED）が効果的に励起光を均一に蛍光ターゲットを励起するために導かれ、マルチモードのスラブ導波路として機能し、このマイクロ流体チップの側面に尻結合されています。携帯電話のカメラが流れる蛍光細胞のタイムラプスムービーを記録するこの映画のデジタルフレームが目的の標的ソリューション内で標識された細胞の数を数えるのに使われるマイクロ流体チャネル、。我々はこれらの蛍光標識された細胞は、 例えば、2つのスライドガラスの間に蛍光粒子を挟むと、 例えばの空間分解能を達成することができる携帯電話のカメラを使用してその蛍光画像をキャプチャすることにより、静的モードで画像も、同様の光流体設計をすることができます使用して〜 〜81 mm 2の非常に大きな視野以上10μmである。この携帯電話ベースの蛍光イメージングフローサイトメトリーや顕微鏡プラットフォームは、HIV陽性患者のモニタリングに向けたり、水を飲んで水を媒介とする寄生虫の検出のためのCD4 + T細胞の計数などのために、特にリソースが限られた設定で役に立つかもしれません。
Introduction
顕微鏡およびフローサイトメトリーは、広く生物医学および科学研究のテクニック1月12日だけでなく、様々な種類の細胞の計数および特性評価のための臨床診断に使用されます。しかし、従来の顕微鏡やフローサイトメトリー機器は、主に定評のある中央研究所にその使用を制限する、比較的複雑で高価である。最近、私たちは約束を示している携帯電話、13,14上に集積コンパクトかつ軽量蛍光イメージングサイトメトリーや顕微鏡装置を開発したコスト効率のための資源が限られた環境に蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーおよび関連ミクロ解析技術を翻訳世界的な健康に影響を与える様々な遠隔医療アプリケーション。
optofluidicフローサイトメトリーの設定では（ 例えば、 図1C及び1D参照）、カスタム設計のポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースのマイクロ流体チャネルはpositioneです携帯電話のカメラユニットの前面で、dは、どこで、発光ダイオード（LED）は、チャネルのエッジに突き合わせ結合されている。一緒に液体試料の入ったこのマイクロ流体チップは、励起光を均一にマイクロ流路内の蛍光標識された試料を圧送するように導かれるように光流体平面導波路を（例えば、PDMS液-PDMS用で構成）を形成する。これらの標識されたオブジェクトからの蛍光発光、EG細胞は、さらに携帯電話のカメラユニットの直後に配置された追加のレンズを通って撮像されると携帯電話相補型金属酸化膜 半導体（CMOS）イメージセンサ上にマッピングされます。蛍光発光は、励起光路に垂直に収集されているので、安価なプラスチック吸収フィルターは、散乱励起光を除去するのに十分であると蛍光イメージングに必要なまともな暗視野背景を提供することができます。我々は、画像のstatの蛍光オブジェクトも、同じようなオプト·流体設計をすることができます使用して蛍光粒子は二枚のガラスの間に挟まれているICモード（ 図1Aおよび1Bを参照）、マイクロ流体チャネルに流れるのではなく、スライドさせると、これらの蛍光粒子からの蛍光発光は、粒子計数のために携帯電話のCMOSイメージセンサによって捕捉され、特性評価。異なるアプリケーション要件、フローサイトメトリーや広視野蛍光顕微鏡に基づいて選択することができる。例えば、携帯電話のフローサイトメトリー装置は、希少な細胞や病原体の検出のための液体試料を大量に（数ml など ）をスクリーニングするために特に有用である可能性があります。
本稿では、コンパクトでコスト効果の高い光流体添付ファイルを使用して携帯電話上の蛍光顕微鏡やイメージングフローサイトメトリーツールの統合、我々の最近の結果のいくつかを確認します。これらの携帯電話ベースのマイクロ分析、イメージングサイトメトリーおよびセンシングプラットフォームは、様々な機会を提供することができます遠隔医療やポイントオブケア診断のために、特に世界のリソースが限られた地域では、世界の健康課題に対する我々の戦いに影響を与える。
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Protocol
このセクションでは、我々の携帯電話ベースの広視野蛍光顕微鏡13と光流体イメージングサイトメトリープラットフォーム14のための実験プロトコールを紹介します。我々は、これらのイメージングプラットフォームをテストするために蛍光ビーズおよび蛍光標識白血球を使用します。
広視野蛍光顕微鏡オプト流体イメージングフローサイトメーター基づき携帯電話のA.準備
カメラ付き携帯電話やコンパクトフォトカプラ流体アタッチメントアドオン：携帯電話ベースの広視野蛍光顕微鏡またはフローサイトメーターは、2つの主要な部分から構成されます。
1。カメラ付き携帯電話
紹介する手法は、ほぼすべてのカメラ付き携帯電話にも適用可能であるが、我々は、これらのデバイスのためのベースとしてソニーエリクソン相野を選択しました。この携帯電話は、それと〜4.65ミリメートルの焦点距離（f 1）を内蔵しており、レンズにインストール〜8メガピクセルのRGBのCMOSセンサーを持っています。 2。広視野蛍光顕微鏡用オプト流体アタッチメント
光学添付ファイルは、オートデスクが設計されており、ABSplus熱可塑性材料を使用してディメンション·エリートの3次元プリンタで印刷されます。この印刷プロセスでは、モデルとサポート材料がプリンタ内に押出ヘッドで加熱され、モデリングベース上の層ごとに堆積される。この手順が完了すると、支持材料は、所望のプロトタイプの堅牢な3Dモデルを残して、溶解させることができる我々の光学アタッチメントの設計では、LED（〜470nmの中心波長、Digikeyを）、プラスチックフィルター（＃NT54-46、エドムンドで構成されていますオプティクス）、サンプルトレイと、平凸レンズF 2 = 15ミリメートル（＃NT45-302、エドモンド·オプティクス）。すべてのLEDとプラスチックフィルターを簡単にフルオロフォアのスペクトルに基づいて変更することができます。このオプト流体アタッチメントを組み立てるための手順は次のとおりです。
- その具体的なレンズホルダ内の添付位置にレンズを配置します。
- フィルタトレイの上にプラスチック製のフィルターを置き、添付ファイルの中にスライドさせ、またはテープ携帯電話のカメラレンズの前にプラスチックフィルター。
- 添付ファイルに、LEDカセットを挿入します。
- サンプルトレイにサンプルスライドガラスに置きます。添付ファイルにサンプルトレイをスライドさせます。サンプルに向かってLEDが直面している。
- 余分なレンズが直接、携帯電話のカメラレンズに触れているような、携帯電話上に添付ファイルをクリップ。
- LEDをオンに添付ファイルでスイッチを使用します。
- 画像その "ナイトモード"を使用して携帯電話のカメラユニットとの利害のサンプル。
3。蛍光イメージングサイトメトリー用オプト流体アタッチメント
まれな事象の検出のための液体試料を大量に選別する必要があるとき、optofluidicフローサイトメトリー装置が好まれることがあります。私たちは、広視野の蛍光顕微鏡の設計を変更し、フローサイトメーター、ワットに変換することができますここに、PDMSベースのマイクロ流体チャネルは絶えず撮像ボリュームを通して液体試料を提供する目的で使用されています。光学アタッチメントもオートデスクによって設計され、ディメンション·エリートの3次元プリンタで印刷されます。また、LEDは（〜470nmの中心波長、Digikeyを）、プラスチックフィルター（＃NT54-46、エドモンド·オプティクス）、サンプルトレイ、非球面レンズ（f = 4.5ミリメートル）（製品＃C230TME -で構成されています。 Thorlab）。このオプト流体アタッチメントを組み立てるための手順は次のとおりです。
- 添付ファイルに非球面レンズを配置します。
- フィルタトレイの上にプラスチック製のフィルターを置き、添付ファイルの中にスライドさせ、またはテープ携帯電話のカメラのレンズの前にプラスチック製のフィルター。
- 同じ光流体アタッチメントにマイクロ流体チャネルをスライドさせます。
- 余分なレンズが直接、携帯電話のカメラレンズに触れているような携帯電話に添付ファイルをクリップ。
- LEDをオンに添付ファイルでスイッチを使用します。
- マイクロ流体を接続ICは、シリンジポンプへのチャネルと一定流量でマイクロ流体デバイスに液体試料を提供します。
- 携帯電話のカメラのビデオモードを使用して、マイクロ流体チャネルを流れる蛍光細胞/粒子のムービーをキャプチャします。
B.サンプルの調製
4。蛍光マイクロ粒子試料の調製
- 10μmの直径（：製品番号F8834励起/発光580nm/605nm、緑のビーズ：赤のビーズ製品番号F8836：励起/発光505nm/515nm）で蛍光ビーズは、Invitrogen（カールスバッド、カリフォルニア州）から購入する。
- 緑色蛍光ビーズ、DI水の40μlの赤色蛍光ビーズを10μl10μlを混合します。
- Place10マイクロピペットを用いてスライドガラス上でこのビーズ混合物μlとサンドイッチ構造を作るために、その上に別のスライドガラスを入れた。
- サンプルトレイにこのサンドイッチ構造を挿入して、携帯電話の添付ファイルの中にスライドさせます。
5。蛍光標識白血球の調製
- SYTO16核酸の蛍光標識キット（＃S7578、ライフテクノロジー）とリン酸を取る食塩水（PBS）は冷蔵庫からバッファリングされ、室温にそれらをもたらす。
- EDTA採血管から1.5 mlのポリスチレンチューブ（＃05-408-129、フィッシャー·サイエンティフィック）に200μlの全血検体を転送します。
- 200μlの全血検体に1ミリリットル赤血球溶菌バッファー（＃R7757、Sigma-Aldrich）を追加し、よく混合します。
- 5分後、溶解された血液試料を遠心分離し、上澄み液を除去します。
- 200μlのPBSバッファーに白血球細胞ペレットを再懸濁し、穏やかに混ぜる。
- 白血球細胞試料に5μlの1mMのSYTO16溶液を加える。 〜30分間、暗い環境でのアルミニウム箔とインキュベートしたサンプルを包む。
- 再度サンプルを遠心分離します。上清を除去し、標識された白血球細胞ペレットが再PBS緩衝液に懸濁した。
- カバースリップに白血球液体試料を標識した5から10μlを置き、試料の上に第2のカバースリップを置く。
- それは携帯電話蛍光顕微鏡を用いて挟まれたサンプルサンプルトレイにスライドして画像を挿入します。
代わりに
- また、ビデオモードで携帯電話のカメラを使って流れる細胞の蛍光顕微鏡映画を捉えながら、継続的に、自動化されたシリンジポンプを使用してマイクロ流体チャネルを介して蛍光標識された白血球をお届けします。我々はまた、携帯用の電池式シリンジポンプあるいは重力が微小流体チャネルを通る流れを駆動するために利用できることを強調すべきである。
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Representative Results
携帯電話のカメラが流れる細胞のタイムラプス蛍光顕微鏡映画を記録しながら、ポンピング光流/励起スキーム（ 図1Cおよび1D）で、蛍光標識された細胞は、連続して、シリンジポンプを用いて、マイクロ流体チャネルに配信することができます。これらの蛍光映画はその後急速に蛍光イメージングフローサイトメータの機能を考慮して、自動的に絶対数とマイクロ流体チャネルを流れる細胞の密度を決定するために輪郭検出と追跡アルゴリズム14,15を用いて分析することができる。我々は、することができ、上記のプラットフォーム（ 図1Cおよび1D）と試料調製プロトコルに基づいて、我々は標準的な血液分析装置に対して同等の結果を達成するため、ヒト血液試料中の総白血細胞（白血球）の正確なカウントを示した。あるいは14また画像蛍光細胞/粒子静的モードでは、このような任意の流体の流れがないこと13、 などの非常に大規模なサンプル視野を実現〜 例えば 、図2及び図3に示すように約10μmの空間分解能で81ミリメートル2。光学収差の発生源は、より複雑なレンズシステムを設計することによって減らすことができます。代わりに、それはまた、部分的に収差とその空間パターンの源を特徴付けることによって、デジタル画像処理により補正することができます。
図1（A）の模式図と、（B）携帯電話ベースの広視野蛍光顕微鏡の写真図13（C）の模式図および（D）携帯電話ベースのイメージングフローサイトメーターの絵14は、 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
580 nm/605 nm、緑色ビーズ励起：505 nm/515 nmの赤ビーズ励起/発光、 図2は私達の携帯電話ベースの蛍光顕微鏡13の性能は、イメージング蛍光ビーズ（直径10μmの緑と赤のビーズが特徴です）。まともな画質が〜81ミリメートル2の視野の上に実現され、（A、B、C）を参照してください。この中央の視野の端に向かって、常軌を逸した地域があります; 例えば （DE）を参照してください。
図3トップ画像：蛍光標識された白血球の携帯電話の画像13（A-1）：トップ画像から切り出した、蛍光標識された白血球のデジタルズーム携帯電話の画像。 （A-2）：圧縮復号は、（A-1）に示すように、携帯電話の画像のために18をもたらす。 （A-3）：従来の蛍光顕微鏡（10X対物レンズは、NA = 0.25）と同一視野の比較画像。
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Discussion
我々は、携帯電話のカメラに軽量かつコンパクトな光流体添付ファイルを使用して携帯電話ベースの広視野の蛍光顕微鏡と光流体イメージングフローサイトメトリーでの我々の最近の結果を発表しました。このプラットフォーム技術を用いて、我々は、微小粒子と全血サンプル中の標識された白血球を含む蛍光オブジェクトをイメージした。したがって、このコンパクトで費用対効果の高い携帯電話ベースの蛍光イメージングツールセットは、CD4のためにこのようなHIV陽性患者のモニタリングなど、様々な地球規模の健康問題を対処するための、特にリソースが限られた地域では、ポイント·オブ·ケア診断に有用かもしれない+ Tリンパ球数。
体液の分析に加えて、同一の携帯電話ベースのオプトメトリ流体プラットフォームはまた、他の検出に有用であることができるようなリソースが限られた設定で、水/食品品質の監視などのための蛍光免疫測定法の定量化として必要。この目的に向かって、我々は最近、デモがある同じ光流体携帯電話アタッチメント16を使用し 、水や牛乳試料におけるH7（大腸菌）：大腸菌O157の高感度、特異的かつ迅速な検出をnstrated。我々は、特異的に表面官能ガラスキャピラリーを利用し、敏感にEをキャプチャ各キャピラリーを流した液体試料中の大腸菌の粒子。これらのキャプチャされた大腸菌大腸菌の粒子は、さらに量子ドット（QD）標識二次抗体を用いて標識した。これらの官能毛細血管からの蛍光発光は、キャプチャされた大腸菌の濃度を推定するために使用されたキャピラリーの長さに沿って光流体携帯電話イメージングプラットフォームと統合された蛍光強度を用いて検出したターゲット溶液中の大腸菌粒子は、この光流体アプローチでは、水や牛乳サンプル16の両方で5〜10 CFU / mlの検出限界を示した。
最後に、我々はtに依存することに注意してください彼のアプリケーションニーズfは携帯電話のカメラレンズの焦点距離、f 2は外部レンズ（ 図1A）の焦点距離では、このプラットフォームの光学倍率と解像度は、F / F 2を変えることによって調整することができます。システム倍率に加えて、我々はまた、LEDトレイおよび関連するフィルタが簡単に特定のアプリケーションで使用されるかもしれない様々な蛍光色素分子あるいはイムノクロマトアッセイに対応するために、別の色に変更できることに注意する必要があります17
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Disclosures
博士OZCANは、計算イメージングと顕微鏡ツールの実用化を目指しているベンチャー企業の創設者でもある。
Acknowledgments
A. OZCANは感謝して科学者やエンジニアのための大統領早いキャリア賞（PECASE）の支援を認める陸軍研究局（ARO）若手研究者賞、全米科学財団（NSF）のキャリア賞、海軍研究局（ONR）若手研究者賞と米国立衛生研究所（NIH）所長、国立衛生研究所のオフィスからディレクターズ新イノベーター·アワードDP2OD006427。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
- Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
- Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
- Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
- Hell, S. W.
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
- Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
- Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
- Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
- Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
- Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
- Suzuki, S., Abe, K.
- Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
- Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
- Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).
