Summary
Analisamos nossos resultados recentes sobre a integração de microscopia de fluorescência e ferramentas de imagem de citometria de fluxo em um telefone celular usando compactos e de baixo custo opto-fluídicos anexos. Estes celular baseado micro-dispositivos de análise pode ser útil para a análise citométrica, como a realização de tarefas de contagem de células diferentes, bem como para rastreio de alto rendimento de amostras, por exemplo, água em ambientes com recursos limitados.
Abstract
Microscopia de fluorescência e citometria de fluxo são amplamente utilizadas ferramentas na pesquisa biomédica e diagnóstico clínico. No entanto, estes dispositivos são, em geral, relativamente volumosos e dispendiosos, tornando-as menos eficazes para os ambientes com recursos limitados. Para potencialmente resolver estas limitações, que recentemente demonstraram a integração do grande campo de microscopia de fluorescência e ferramentas de imagem de citometria de fluxo em telefones celulares usando compacto, leve, e de custo-benefício opto-fluídicos anexos. Na nossa concepção de citometria de fluxo, as células marcadas por fluorescência são lavadas por meio de um canal microfluídico que está posicionado por cima da unidade de câmara existente telemóvel. Alimentados por bateria diodos emissores de luz (LEDs) são butt-acoplada ao lado do chip de microfluidos, que actua efectivamente como um guia de ondas multi-modo de laje, onde a luz de excitação é guiada para excitar uniformemente os alvos fluorescentes. A câmera de celular grava um filme lapso de tempo de as células fluorescentes que fluem atravéso canal microfluídico, onde os quadros digital deste filme são processados para contar o número de células marcadas dentro de solução alvo de interesse. Usando um projeto opto-fluídico semelhante, também podemos imagem dessas células marcadas com fluorescência no modo estático, por exemplo, imprensando as partículas fluorescentes entre duas lâminas de vidro e capturar suas imagens fluorescentes usando a câmera de telefone celular, que podem atingir uma resolução espacial de ex ~ 10 m ao longo de um grande campo de visão de ~ 81 mm 2. Este celular baseado citometria de fluxo fluorescente imagem e plataforma de microscopia pode ser útil especialmente em ambientes com recursos limitados, por exemplo, para a contagem de células T CD4 + em direção acompanhamento de pacientes HIV + ou para a detecção de parasitas transmitidas pela água em água potável.
Introduction
Microscopia e citometria de fluxo são amplamente utilizadas técnicas de 1-12 em pesquisa biomédica e científica, bem como o diagnóstico clínico para a contagem e caracterização de vários tipos celulares. No entanto, os microscópios convencionais e de citometria de fluxo-instrumentos são relativamente complexos e caros, o que limita a sua utilização para principalmente bem estabelecidas laboratórios centrais. Recentemente, temos desenvolvido uma citometria de imagem compacto e leve fluorescente e dispositivo microscopia integrados em um telefone celular, que mostra 13,14 promessa de custo-benefício traduzir microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e análise relacionados com técnicas de micro-para ambientes de recursos limitados para várias aplicações de telemedicina que impactam a saúde global.
Na configuração de citometria de fluxo optofluidic (ver Figura 1C e 1D por exemplo), um design personalizado polydimethysiloxane (PDMS) canal baseado microfluídico é positioned em frente com o telemóvel da unidade de câmara, em que emitem luz-diodos (LEDs) são acoplados à extremidade das bordas do canal. Este chip de microfluidos, juntamente com a amostra de líquido no interior, forma um guia de ondas planar opto-fluídica (composto de, por exemplo PDMS-líquido-PDMS) de tal modo que a luz de excitação é guiada para bombear uniformemente os espécimes fluorescentes marcados no interior do micro-canal. A emissão de fluorescência de esses objetos marcados, por exemplo, células, é mais trabalhada através de uma lente adicional colocada logo após o telemóvel câmera de unidade e é mapeado para o telemóvel Complementar sensor de imagem Metal-Oxide Semiconductor (CMOS). Uma vez que a emissão fluorescente é recolhido perpendicular ao percurso de luz de excitação, um filtro de absorção de plástico barato é suficiente para eliminar a luz de excitação espalhada e pode proporcionar uma base de campo escuro decente necessárias para imagens de fluorescência. Usando um projeto opto-fluídico semelhante, podemos também a imagem dos objetos fluorescentes em estatísticaic modo (ver Figura 1A e 1B), em que as partículas fluorescentes são prensadas entre duas lâminas de vidro, em vez de fluir através de um canal microfluídico e a emissão fluorescente a partir destas partículas fluorescentes são captadas pelo sensor de imagem CMOS celular para contagem de partículas e caracterização. Com base nos requisitos de aplicação diferentes, citometria de fluxo ou de campo amplo de microscopia fluorescente podem ser escolhidos. Por exemplo, o dispositivo celular por citometria de fluxo pode ser especialmente útil para o rastreio de grandes volumes de amostras de líquidos (por exemplo, alguns mililitros) para a detecção de células raras ou agentes patogénicos.
Neste artigo, rever alguns dos nossos resultados recentes sobre a integração de microscopia de fluorescência e ferramentas de imagem de citometria de fluxo em um telefone celular usando compactos e de baixo custo opto-fluídicos anexos. Estas celular baseado micro-análise, citometria de imagens e plataformas de sensoriamento poderia fornecer várias oportunidadespara diagnóstico de telemedicina e de ponto-de-cuidado, especialmente impactando nossa luta contra os problemas globais de saúde em regiões com recursos limitados do mundo.
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Protocol
Nesta seção, apresentamos os protocolos experimentais para o nosso telefone celular baseado microscopia de fluorescência de campo largo 13 e opto-fluídico plataforma de citometria de imagem 14. Nós vamos usar partículas fluorescentes e fluorescente etiquetado células brancas do sangue para testar essas plataformas de imagem.
A. Preparação do telemóvel Baseado Largo-campo microscópio de fluorescência e Opto-fluídico citômetro de fluxo de imagem
O telemóvel baseado microscópio de campo amplo fluorescente ou citômetro de fluxo consiste de duas partes principais: um celular com câmera e um compacto opto-fluídico add-on acessório.
1. A câmera do telefone
Enquanto as técnicas apresentadas são aplicáveis a quase qualquer câmera de telefone, escolhemos Sony Erickson Aino como a base para estes dispositivos. Este celular tem um ~ 8 Megapixels RGB sensor CMOS instalado e uma lente interna que tem uma distância focal (f 1) de ~ 4,65 milímetros. 2. Opto-fluídico anexo para Wide-field Microscopia fluorescente
O acessório óptico é projetado pela Autodesk e é impresso por uma elite Dimensão 3-D impressora usando ABSplus material termoplástico. Neste processo de impressão, e materiais de suporte de modelo são aquecidas em uma cabeça de extrusão no interior da impressora e são depositados camada por camada sobre uma base de modelação. Quando este passo é completado, o material de suporte pode ser dissolvida, deixando um modelo robusto 3D do protótipo desejado nossa concepção acessório óptico é composto por LEDs (centro de comprimento de onda de 470 nm, ~, Digikey), um filtro de plástico (# NT54-46, Edmund Optics), um tabuleiro de amostras, e uma lente plano-convexa f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Todos os LEDs e filtros de plástico podem ser facilmente alterados com base em espectros de fluoróforos. Os passos para montar esse apego opto-fluídico incluem:
- Coloque a lente na sua posição de fixação no interior da lente específica titular.
- Coloque o filtro de plástico sobre a bandeja do filtro e deslize-o anexo; ou fita o filtro de plástico na frente da lente da câmera de telefone celular.
- Insira a bandeja de LED para o anexo.
- Coloque as lâminas de vidro de amostra na bandeja de amostra. Deslize a bandeja de amostra no anexo. Enfrentar os LEDs em direção à amostra.
- Clipe da penhora para o telemóvel, de modo que a lente extra está diretamente em contato com a lente da câmera de telefone celular.
- Use a chave no anexo para ligar os LEDs.
- Imagem da amostra de interesse com a unidade de câmera de telefone celular, usando o seu "modo noite".
3. Opto-fluídico Attachment para Citometria de imagem fluorescente
Quando existe a necessidade de filtrar grandes volumes de amostras líquidas para a detecção de eventos raros, o dispositivo de citometria de fluxo optofluidic podia ser preferido. Nós podemos modificar a nossa grande área de design de microscópio de fluorescência e convertê-lo em um citômetro de fluxo, waqui um PDMS canal microfluídico base é usado para continuamente fornecer a amostra de líquido através do volume de imagem. O acessório óptico também é projetado pela Autodesk e impresso pela Dimensão impressora 3-D Elite. Também é composto por LEDs (centro de comprimento de onda de 470 nm, ~, Digikey), um filtro de plástico (# NT54-46, Edmund Optics), um tabuleiro de amostras, e uma lente asférica (f mm = 4,5) (produto # C230TME-A; Thorlab). Os passos para montar esse apego opto-fluídico incluem:
- Coloque a lente asférica para o anexo.
- Coloque o filtro de plástico sobre a bandeja do filtro e deslize-o anexo; ou fita o filtro de plástico na frente da lente da câmera de celular.
- Deslize o canal microfluídicos para a fixação opto-fluídico mesmo.
- Clipe da penhora para o telemóvel de modo que a lente extra está diretamente em contato com a lente da câmera de telefone celular.
- Use a chave no anexo para ligar os LEDs.
- Conecte o microfluidic canal para a bomba de seringa e fornecer a amostra de líquido para dentro do dispositivo microfluidico a uma taxa de fluxo constante.
- Capturar um filme das células fluorescentes / partículas que fluem através do canal microfluídicos usando o modo de vídeo da câmera de telefone celular.
B. Preparação de Amostras
4. Preparação de Micro-partículas fluorescentes Amostras
- Esferas fluorescentes com 10 um de diâmetro (contas vermelhas: Produto # F8834 excitação / emissão 580nm/605nm; grânulos verdes: Produto # F8836: excitação / emissão 505nm/515nm) são adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA).
- Misturar 10 ul de contas fluorescentes verdes, 10 ul de contas fluorescentes vermelhas com 40 ul de água desionizada.
- Place10 ul desta mistura de pérolas sobre uma lâmina de vidro usando uma micropipeta e colocar uma outra lâmina de vidro sobre o topo do mesmo a fazer uma estrutura de sanduíche.
- Insira esta estrutura sanduíche na bandeja de amostra e deslize-o no acessório de celular.
5. Preparação de fluorescência leucócitos marcados
- Tome SYTO16 ácido nucleico rotulagem fluorescente kit (# S7578, Tecnologia Vida) e tampão fosfato salino (PBS) para fora do refrigerador e trazê-los à temperatura ambiente.
- Transferir 200 uL da amostra de sangue inteiro a partir de tubo de colheita de sangue EDTA a 1,5 ml tubo de polistireno (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Adicionar 1 ml de tampão de lise de células vermelhas do sangue (# R7757, Sigma-Aldrich) para a amostra de sangue total e 200 ul homogeneizar.
- Após 5 minutos, centrifugar a amostra de sangue lisada e remover a solução sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento de células brancas do sangue em 200 ul de tampão PBS e gentilmente misturá-los.
- Adicionam-se 5 ul de solução de 1 mM SYTO16 para a amostra de glóbulos brancos. Enrole a amostra com uma folha de alumínio e incuba-se em ambiente escuro, durante ~ 30 min.
- Centrifugar novamente a amostra. O sobrenadante é removido e as células brancas do sangue marcados pelota é re-Suspenso em tampão de PBS.
- Colocar 5-10 ul rotulado brancas do sangue amostra de líquido de célula para uma lamela de cobertura, e colocar uma lamela segundo sobre o topo da amostra.
- Inserir o slide amostra encaixados na bandeja de amostra e imagem-lo usando o microscópio de telefone celular fluorescente.
Alternativamente
- Continuamente entregar as fluorescente etiquetado células brancas do sangue através de um canal microfluídicos usando uma bomba de seringa automatizada, além de capturar um filme fluorescente microscópica das células que fluem com a câmara de telemóvel no modo de vídeo. Devemos também enfatizar que uma bateria portátil movido a bomba de seringa ou até mesmo força da gravidade pode ser utilizada para conduzir o fluxo através do canal de microfluídica.
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Representative Results
Com o nosso opto-fluídica bombagem / excitação esquema (Figuras 1C e 1D), as células marcadas com fluorescência pode ser continuamente fornecido para dentro do canal microfluídico utilizando uma bomba de seringa, enquanto a câmara celular grava um lapso de tempo de filme microscópico fluorescente das células de fluxo. Estes filmes fluorescentes pode depois ser rapidamente analisados usando detecção de contorno e de algoritmos de rastreamento 14,15 para determinar automaticamente o número absoluto e na densidade das células que fluem através dos canais microfluídicos, tendo a função de uma imagem fluorescente de citometria de fluxo. Com base na plataforma acima descritos (Figuras 1C e 1D), e os protocolos de preparação da amostra, foi demonstrada uma contagem precisa do total do sangue branco--células (leucócitos) em amostras de sangue humano, com resultados comparáveis contra um analisador de hematologia padrão 14. Alternativamente, podemos também a imagem de células fluorescentes / partículasno modo estático, em 13 de tal forma que, sem qualquer fluxo de fluido, obtendo uma grande amostra de campo de visão de, por exemplo ~ 81 mm 2, com uma resolução espacial de ~ 10 um como por exemplo ilustrado nas Figuras 2 e 3. Fontes de aberração óptica pode ser reduzida através da concepção de um sistema de lentes mais complexa. Alternativamente, pode também ser parcialmente corrigido por meio de processamento digital de imagem por caracterizar a origem da aberração e seus padrões espaciais.
Figura 1. (A) Ilustração esquemática e (B) fotografia de uma célula-celular baseada microscópio de campo amplo fluorescente 13. Ilustração esquemática (C) e (D)imagem de um citômetro de fluxo de telefone celular baseado em imagem. 14 Clique aqui para ver maior figura .
. Figura 2 O desempenho do nosso celular microscópio fluorescente base 13 é caracterizada por contas de imagens fluorescentes (10 contas de um de diâmetro verde e vermelho; excitação conta vermelha / emissão: 580 nm nm/605, excitação talão verde: 505 nm nm/515 ). Uma boa qualidade de imagem é obtida ao longo de um campo de visão de ~ 81 mm 2, ver (A, B, C). Em direção às bordas desse centro do campo de visão, existem regiões com aberração; ver, por exemplo (DE).
Figura 3 imagem superior:. Telefones celulares imagens de fluorescente etiquetado células brancas do sangue 13 (A-1):. Zoom digital de imagem de celular de fluorescente etiquetado células brancas do sangue colhidas a partir da imagem de cima. (A-2): descodificação de compressão resulta 18 para a imagem de telefonia celular mostrado em (A-1). (A-3): microscópio de fluorescência convencional (objectiva 10X, NA = 0,25) imagem de comparação do mesmo campo de visão.
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Discussion
Nós apresentamos nossos resultados recentes sobre celular baseado de campo amplo de microscopia fluorescente e opto-fluídico citometria de fluxo de imagens usando leve e compacto opto-fluídicos anexos para câmeras de telefones celulares. Utilizando esta tecnologia de plataforma que imaged objectos fluorescentes incluindo as micro-partículas e rotulados glóbulos brancos em amostras de sangue total. Portanto, este compacto e de baixo custo de telefone celular conjunto de ferramentas de imagem baseada fluorescente pode ser útil para o ponto-de-cuidado diagnóstico, especialmente em regiões com recursos limitados para combater vários problemas de saúde globais, como o monitoramento de pacientes HIV + para seus CD4 + contagem de linfócitos T .
Além da análise de fluidos corporais, o mesmo telemóvel plataforma baseada em citometria de opto-fluídico também pode ser útil para outras necessidades de detecção, tais como a quantificação de imunoensaios fluorescentes para o monitoramento por exemplo, de água / alimentos de qualidade em recursos limitados. Para este fim, temos recentemente demonstraçãonstrated detecção sensível e específica e rápida de Escherichia coli O157: H7 (E. coli) em amostras de água e leite, utilizando o mesmo opto-fluídica fixação celular 16. Utilizamos superfície funcionalizada capilares de vidro especificamente para capturar e sensível E. coli em amostras de partículas líquidas que foram percorridos por cada capilar. Estes E. capturado partículas coli foram ainda rotulada com quantum-dot (QD) anticorpos secundários conjugados. A emissão de fluorescência a partir destes capilares funcionalizado foi então detectada usando o opto-fluídica plataforma imagiologia celular e a intensidade de fluorescência integrada ao longo do comprimento capilar foi utilizado para estimar a densidade de E. capturado coli partículas na solução de destino. Com esta abordagem opto-fluídica, demonstramos um limite de detecção de ~ 5-10 CFU / ml em água e amostras de leite 16.
Finalmente, devemos notar que, dependendo de tele necessidades de aplicação, a ampliação óptica e resolução de esta plataforma pode ser ajustado alterando f / f 2, onde f é a distância focal da lente da câmera de telefone celular e f 2 é a distância focal da lente externa (Figura 1A) . Além de ampliação de sistema, também deve notar que a bandeja de LED e o filtro associado pode ser facilmente alterado para cores diferentes para acomodar diferentes fluoróforos ou ensaios imuno mesmo que possam ser utilizados em aplicações específicas 17.
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Disclosures
Dr. Ozcan é o fundador de uma empresa start-up que pretende comercializar imagem computacional e ferramentas de microscopia.
Acknowledgments
A. Ozcan agradece o apoio do Prémio Carreira presidencial antecipada para Cientistas e Engenheiros (PECASE), Army Research Office (ARO) Young Investigator Award, National Science Foundation (NSF) Prémio Carreira, o Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award e National Institutes of Health (NIH) Prêmio Diretor Innovator Nova DP2OD006427 do Escritório do Diretor, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
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