Summary
Vi granskar våra senaste resultat på integrering av fluorescerande mikroskopi och imaging flöde verktyg cytometry på en mobiltelefon med kompakta och kostnadseffektiva opto-fluidic bilagor. Dessa mobiltelefon baserade mikro-analys enheter kan vara användbara för cytometrisk analys, till exempel att utföra olika cellräkning uppgifter samt för high-throughput screening av t.ex. vattenprover i Resurs begränsade inställningar.
Abstract
Fluorescensmikroskopi och flödescytometri används allmänt verktyg i biomedicinsk forskning och klinisk diagnos. Men dessa enheter är i allmänhet relativt skrymmande och dyra, vilket gör dem mindre effektiva i resursen begränsade inställningar. Att eventuellt ta itu med dessa begränsningar har vi nyligen visat att integrera breda fält fluorescerande mikroskopi och imaging flöde verktyg cytometry på mobiltelefoner med kompakta, lätta och kostnadseffektiva opto-fluidic bilagor. I vår flödescytometri konstruktion, är fluorescensmärkta celler spolas genom en mikroflödessystem kanal som är placerad ovanför befintliga mobiltelefon kameraenheten. Batteridrivna lysdioder (LED) är stum-kopplad till sidan av denna mikroflödessystem chip, som effektivt verkar som ett multimodalt plattvågledare, där excitationsljuset styrs till likformigt excitera de fluorescerande mål. Mobiltelefonen Kameran spelar en film tid förfaller de fluorescerande celler som flyter genommikroflödessystem kanalen, där de digitala ramarna för denna filmen behandlas för att räkna antalet av de märkta cellerna i mållösningen av intresse. Med hjälp av en liknande opto-fluid design, kan vi också bilden här fluorescensmärkta celler i statiskt läge genom att t.ex. sandwich de fluorescerande partiklar mellan två glasskivor och fånga deras fluorescerande bilder med mobiltelefon kamera, som kan uppnå en rumslig upplösning på t.ex. ~ 10 um över en mycket stor fält-av-vy av ~ 81 mm 2. Denna mobiltelefon baserad fluorescerande cytometri avbildning flöde och mikroskopi plattform kan vara användbart särskilt i resurser begränsade inställningar, t.ex. för räkning av CD4 + T-celler mot övervakning av HIV + patienter eller för detektion av vattenburna parasiter i dricksvattnet.
Introduction
Mikroskopi och flödescytometri används i stor utsträckning metoder 1-12 i biomedicinsk och vetenskaplig forskning samt klinisk diagnos för att räkna och karakterisering av olika celltyper. Emellertid, konventionella mikroskop och flödescytometri instrument är relativt komplexa och dyra, vilket begränsar deras användning till huvudsakligen väletablerade centrala laboratorier. Nyligen har vi utvecklat en kompakt och lätt fluorescerande avbildning cytometri och mikroskopi enhet som är integrerad i en mobiltelefon, 13,14 som visar löfte till kostnadseffektivt översätta fluorescensmikroskopi, flödescytometri och relaterade mikro-analysmetoder för att begränsade resurser miljöer för olika telemedicinska tillämpningar som påverkar den globala hälsan.
I optofluidic flödescytometri konfiguration (se t ex Figur 1C och 1D), är en specialdesignad polydimethysiloxane (PDMS) baserad mikroflödessystem kanal positionedi framför mobiltelefonen kamera-enhet, där ljus-emitterande-dioder (LED) är stum-kopplade till kanterna av kanalen. Denna mikroflödessystem chip, tillsammans med det flytande provet inuti, bildar en opto-fluider plan vågledare (bestående av till exempel PDMS-vätska-PDMS) så att exciteringsljus styrs till likformigt pumpa de fluorescerande märkta proverna inuti mikro-kanalen. Fluorescensemissionen från dessa märkta objekt, t.ex. celler, ytterligare avbildas genom en extra lins placeras direkt efter mobiltelefonen kamera-enheten och avbildas på mobiltelefonen Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) bildsensor. Eftersom den fluorescerande emissionen uppsamlas vinkelrätt excitationsljuset banan, är en billig plast absorptionsfilter tillräcklig för att avlägsna spritt excitationsljus och kan ge en ordentlig mörkfält bakgrund som krävs för fluorescerande avbildning. Med hjälp av en liknande opto-fluid design, kan vi också bilden de fluorescerande objekt i static (se figur 1A och 1B), i vilken de fluorescerande partiklar inklämt mellan två glas glider i stället för att strömma genom ett mikroflödessystem kanal och den fluorescerande emissionen från dessa fluorescerande partiklar fångas upp av mobiltelefonen CMOS-bildsensor för partikelräkning och karakterisering. Baserat på olika tillämpningsområden krav, flödescytometri eller brett fält fluorescerande mikroskopi kan väljas. Till exempel kan mobiltelefon flödescytometri anordningen vara speciellt användbar för screening av stora volymer av vätskeprover (t.ex. några få ml) för detektering av sällsynta celler eller patogener.
I detta manuskript vi igenom några av de senaste resultaten på integration av fluorescerande mikroskopi och imaging flöde verktyg cytometry på en mobiltelefon med kompakta och kostnadseffektiva opto-fluidic bilagor. Dessa mobiltelefon-baserade mikro-analys, bildbehandling cytometri och avkänning plattformar kan ge olika möjligheterför telemedicin och point-of-care diagnostik, speciellt påverkar vår kamp mot globala hälsoproblem i Resurs begränsade delar av världen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I detta avsnitt presenterar vi de experimentella protokoll för vår baserad mobiltelefon brett fält fluorescensmikroskopi 13 och opto-fluidiska avbildning cytometri plattform 14. Vi kommer att använda fluorescerande pärlor och fluorescensmärkta vita blodkroppar att testa dessa imaging plattformar.
A. Beredning av mobiltelefon Baserad Wide-field fluorescensmikroskop och Opto-fluidiska Imaging flödescytometer
Mobiltelefonen baserad brett fält fluorescerande mikroskop eller flödescytometer består av två huvuddelar: en kamera telefon och en kompakt opto-fluider add-on fastsättning.
1. Den kameratelefon
Medan de presenterade tekniker är tillämpliga på nästan alla kameratelefon har vi valt Sony Erickson Aino som bas för dessa enheter. Denna mobiltelefon har en ~ 8 megapixel RGB CMOS-sensor monterad på den och en inbyggd lins som har en brännvidd (f 1) av ~ 4,65 mm. 2. Opto-fluid Fäste för Wide-field fluorescensmikroskopi
Den optiska infästning är designad av Autodesk och skrivs ut av en dimension Elite 3-D skrivare med ABSplus termoplastiskt material. I denna tryckprocessen är modell och support material upphettas i en sprutmunstycke i skrivaren och deponeras skikt för skikt på en modell bas. När detta steg är slutfört, kan det stödjande materialet lösas, vilket ger en stabil 3D-modell av den önskade prototypen Vår optiska fastsättning konstruktion består av lysdioder (mittvåglängden vid ~ 470 nm, Digikey), en plast filter (# NT54-46, Edmund optik), en provbricka och en plankonvex lins f2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Alla lampor och plast filter kan enkelt ändras baserat på fluoroforerna "spektra. Stegen för montering denna opto-fluidic bilaga är:
- Placera linsen i fästet i dess specifika linshållaren läge.
- Placera plasten filtret på filtret facket och skjut in det i fästet eller tejpa plast filter framför mobiltelefonen kameralinsen.
- Sätt in LED-magasinet i bilagan.
- Placera glasen prov glas i provet facket. Skjut provbrickan i bilagan. Face lysdioderna mot provet.
- Fäst fästet på mobiltelefonen, så att den extra linsen är direkt kontakt med mobiltelefonen kameralinsen.
- Använd omkopplaren på den bifogade filen för att slå på lamporna.
- Bild provet av intresse med mobiltelefonen kameraenheten med dess "nattläge".
3. Opto-fluid Fäste för fluorescerande Imaging Cytometry
När det finns ett behov av att screena stora volymer av vätskeprover för detektering av sällsynta händelser, kan optofluidic flödescytometri anordning föredras. Vi kan ändra vårt breda fält fluorescerande mikroskop design och omvandla den till en flödescytometer, whär en PDMS baserad mikroflödessystem kanalen används för att kontinuerligt leverera vätskeprovet genom avbildningsvolymen. Den optiska fastsättning är också utformad av Autodesk och tryckt av Dimension Elite 3-D skrivare. Det består också av lysdioder (centrum våglängd ~ 470 nm, Digikey), en plast filter (# NT54-46, Edmund Optics), ett prov facket och en asfärisk lins (f = 4,5 mm) (produkt # C230TME-A; Thorlab). Stegen för montering denna opto-fluidic bilaga är:
- Placera den asfäriska linsen i bilagan.
- Placera plasten filtret på filtret facket och skjut in det i fästet eller tejpa plast filtret framför mobiltelefon kameralinsen.
- Skjut mikroflödessystem kanal i samma opto-fluidic fastsättning.
- Fäst fästet på mobiltelefonen så att den extra linsen är direkt kontakt med mobiltelefonen kameralinsen.
- Använd omkopplaren på den bifogade filen för att slå på lamporna.
- Anslut för mikrofluidbearbetningic kanal till sprutpumpen och leverera vätskeprovet in mikroflödessystem anordningen vid en konstant flödeshastighet.
- Fånga en film av fluorescerande celler / partiklar som strömmar genom mikroflödessystem kanal med videoläge för mobiltelefon kamera.
B. Provberedning
4. Framställning av Fluorescerande Micro-partikel prover
- Fluorescerande pärlor med 10 nm diameter (röda pärlor: Produkt # F8834 excitation / emission 580nm/605nm, gröna kulor: Produkt # F8836: excitations / utsläpp 505nm/515nm) köps från Invitrogen (Carlsbad, CA).
- Blanda 10 pl av gröna fluorescerande pärlor, 10 pl av röda fluorescerande pärlor med 40 pl avjoniserat vatten.
- Place10 il av denna pärla blandning på en glasskiva med användning av en mikropipett och sätta en annan glasskiva ovanpå den för att göra en sandwichstruktur.
- Sätt detta sandwichstruktur i provet facket och skjut in det i mobiltelefon fastsättning.
5. Beredning av fluorescensmärkt vita blodkroppar
- Ta SYTO16 nukleinsyra fluorescerande märkning kit (# S7578, Life Technology) och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ut ur kylskåpet och föra dem till rumstemperatur.
- Överför 200 pl helblodprov från EDTA-bloduppsamlingsrör till 1,5 ml polystyrenrör (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Tillsätt 1 ml röda blodkroppar lyseringsbuffert (# R7757, Sigma-Aldrich) till 200 pl helblodprovet och blanda väl.
- Efter 5 minuter, centrifugera den lyserade blodprovet och avlägsna den överstående lösningen.
- Resuspendera pelleten vita blodkroppar i 200 pl PBS-buffert och försiktigt blanda dem.
- Lägg 5 pl 1 mM SYTO16 lösning till vita blodkroppar prov. Slå in provet med aluminiumfolie och inkubera i mörker miljö för ~ 30 minuter.
- Centrifugera provet igen. Supernatanten avlägsnas och den märkta vita blodkroppar pelleten re-Suspenderas i PBS-buffert.
- Placera 5-10 ul märkt vita blodprov cell vätska till ett täckglas, och placera en andra täckglas ovanpå provet.
- Sätt in inklämt provet glida in i provet facket och bild den med mobiltelefonen fluorescerande mikroskop.
Alternativt
- Kontinuerligt leverera fluorescensmärkta vita blodkroppar genom en mikroflödessystem kanal med en automatiserad sprutpump samtidigt fånga en fluorescerande mikroskopisk film av strömmande celler genom att använda mobiltelefonen kameran i videoläge. Vi bör också understryka att en bärbar batteridriven sprutpump eller tyngdkraften kan användas för att driva flödet genom mikroflödessystem kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med vår opto-fluider pumpning / excitation systemet (figur 1C och 1D), kan fluorescensmärkta celler kontinuerligt levereras till mikroflödessystem kanal med en sprutpump medan mobiltelefon kamera registrerar en time-lapse fluorescerande mikroskopisk film av strömmande cellerna. Dessa fluorescerande filmer kan sedan snabbt analyseras med kontur-detektering och spårning algoritmer 14,15 att automatiskt bestämma det absoluta antalet och densiteten av cellerna som strömmar genom mikroflödessystem kanalerna, varvid funktionen av ett fluorescerande avbildning flöde-cytometer. Baserat på den ovan beskrivna plattformen (figur 1C och 1D) och prov-protokoll beredning visade vi exakt räkning av totala vita-blodceller (WBC) i mänskliga blodprover, uppnå jämförbara resultat mot en vanlig hematologianalysator. 14 Alternativt kan vi också image de fluorescerande celler / partiklari statiskt läge, 13 så att utan fluidic flöde, uppnå en mycket stor urval fält-of-view av t.ex. ~ 81 mm 2 med en spatial upplösning på ~ 10 | im såsom visas i t.ex. figurerna 2 och 3. Källor av optisk aberration kan minskas genom att utforma en mer komplex linssystem. Alternativt, kan den också partiellt korrigeras genom digital bildbehandling genom en beskrivning av källan till aberration och deras rumsliga mönster.
Figur 1. (A) Schematisk illustration och (B) bild av en mobiltelefon baserad breda fält fluorescerande mikroskop. 13 (C) Schematisk illustration och (D)bild av en mobiltelefon baserad avbildning flödescytometer. 14 Klicka här för att se större bild .
. Figur 2 prestanda vår mobiltelefon baserad fluorescensmikroskop 13 kännetecknas av imaging fluorescerande pärlor (10 nm diameter gröna och röda pärlor, röd pärla excitation / emission: 580 nm/605 nm, grön pärla excitation: 505 nm/515 nm ). En anständig bildkvalitet uppnås över ett fält-of-view på ~ 81 mm 2, se (A, B, C). Mot kanterna av detta centrala område-of-view, finns det aberrerade regioner, se t.ex. (DE).
Figur 3 Top bild:. Mobiltelefon bilder av fluorescensmärkta vita blodkroppar 13 (A-1):. Digitalt zoomad mobiltelefon bilden av fluorescensmärkta vita blodkroppar beskurna uppifrån bilden. (A-2): Tryckhållfasthet avkodning resultat 18 till mobiltelefonen bild visas i (A-1). (A-3): Konventionell fluorescensmikroskop (10X objektiv, NA = 0,25) jämfört bild av samma synfält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presenterat våra senaste resultat på mobiltelefon baserad brett fält fluorescerande mikroskopi och opto-fluid avbildning flödescytometri med användning lätta och kompakta opto-fluidic bilagor till mobiltelefon kameror. Med hjälp av denna plattform teknik vi avbildas fluorescerande föremål, inklusive mikro-partiklar och märkta vita blodkroppar i helblodsprover. Därför kan detta kompakta och kostnadseffektiva mobiltelefon baserad fluorescerande avbildning verktygen vara användbar för point-of-care diagnostik, särskilt i resurs begränsade områden för att bekämpa olika globala hälsoproblem, såsom övervakning av HIV + patienter för deras CD4 + T-lymfocyter räknas .
Förutom analys av kroppsvätskor, samma mobiltelefon-baserade opto-fluidic cytometri plattform kan också vara användbart för andra avkänning behov som kvantifiering av fluorescerande immunanalyser för t.ex. övervakning av vatten / livsmedelskvalitet i resursfattiga begränsad inställningar. För detta ändamål har vi nyligen demonstrated känslig, specifik och snabb detektion av Escherichia coli O157: H7 (E. coli) i vatten och mjölk prover med samma opto-fluidic mobiltelefon bilaga 16. Vi utnyttjade yta funktionaliserad glaskapillärer att specifikt och känsligt fångar E. coli partiklar i flytande prover som flugit genom varje kapillär. Dessa fångade E. coli partiklar vidare märkta med quantum-dot (QD) konjugerade sekundära antikroppar. Den fluorescerande emissionen från dessa funktionaliserade kapillärer detekterades sedan med användning av opto-fluid mobiltelefon imaging plattform och den integrerade fluorescensintensiteten längs kapillären längd användes för att uppskatta densiteten hos det infångade E. coli partiklar i mållösningen. Med denna opto-fluider tillvägagångssätt visade vi en detektionsgräns av ~ 5-10 CFU / ml i både vatten och prover mjölk 16.
Slutligen bör vi notera att beroende på tHan applikationsbehov kan den optiska förstoringen och upplösning av denna plattform ställas in genom att ändra f / f 2, där f är brännvidd mobiltelefonen kameralinsen och f 2 är brännvidden för den externa linsen (Figur 1A) . Förutom systemets förstoring, vi bör också notera att lysdioden brickan och tillhörande filtret lätt kan ändras till olika färger för att tillgodose olika fluoroforer eller ens immunokromatografiska analyser som kan användas i specifika applikationer. 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Ozcan är grundare av ett nystartat företag som syftar till att kommersialisera computational avbildning och verktyg mikroskopi.
Acknowledgments
A. Ozcan tacksam stöd av presidentens tidiga karriär Award för forskare och ingenjörer (PECASE), Army Research Office (ARO) Young Investigator Award, National Science Foundation (NSF) KARRIÄR Award, Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award och National Institutes of Health (NIH) direktörens nya Innovator Award DP2OD006427 från kontoret av direktören, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
- Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
- Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
- Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
- Hell, S. W.
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
- Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
- Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
- Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
- Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
- Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
- Suzuki, S., Abe, K.
- Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
- Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
- Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).
