Summary
우리는 컴팩트하고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 휴대 전화의 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합에 우리의 최근 결과를 검토합니다. 이 휴대 전화 기반 마이크로 분석 장치는 다음과 같은 자원 제한 설정에서 예를 들어, 물 시료의 높은 처리량 검사를위한뿐만 아니라 다양한 세포 계수 작업을 수행하는 등 cytometric 분석을 위해 유용 할 수 있습니다.
Abstract
형광 현미경과 유동 세포 계측법은 널리 생명 의학 연구 및 임상 진단에서 도구를 사용합니다. 그러나이 장치는 자원 제한 설정에서이를 덜 효율적 만들기, 일반적으로 상대적으로 부피가 큰과 비용이 많이 드는 있습니다. 잠재적으로 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 최근 소형, 경량, 그리고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 셀의 휴대 전화에서 폭 넓은 분야 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합을 보여주고 있습니다. 우리 유동 세포 계측법 디자인에서 휘황 표시된 셀은 기존의 휴대폰 카메라 유닛 위에 위치하는 마이크로 유체 채널을 통해 플러시됩니다. 배터리 전원 발광 다이오드 (LED)가 효과적으로 여기 광이 균일 형광 목표를 자극 안내하는 멀티 모드 판 도파관, 역할이 마이크로 칩의 옆에 엉덩이 커플 링입니다. 휴대 전화 카메라를 통해 흐르는 형광 세포의 시간 경과 영화를 기록이 영화의 디지털 프레임이 관심의 대상 솔루션 내에서 레이블 셀의 개수를 계산하기 위해 처리하는 마이크로 유체 채널. 우리는이 휘황 표시 셀은 예를 들어 두개의 유리 슬라이드 사이에 형광 입자를 sandwiching하고 예를 공간적 해상도를 달성 할 수있는 휴대 전화 카메라를 사용하여 형광 이미지를 캡처하여 정적 모드에서 이미지도 비슷한 광학 유체 디자인을 할 수 있습니다 사용 ~ ~ 81mm 2의 매우 큰 뷰 필드 지난 10 μm. 이 휴대 전화는 형광 이미징 유동 세포 계측법을 기반으로하며 현미경 플랫폼은 CD4 + HIV + 환자의 모니터링을 향해 나 마시는 물에 수 인성 기생충 검출을위한 T 세포의 계산 예를 들어, 특히 자원 제한 설정에 유용 할 수 있습니다.
Introduction
현미경과 흐름 세포 계측법은 널리 생물 의학 및 과학 연구 기술 1-12뿐만 아니라 다양한 세포 유형의 계산 및 특성에 대한 임상 진단을하는 데 사용됩니다. 그러나, 기존의 현미경과 흐름 세포 계측법 장비는 주로 잘 알려진 중앙 실험실로 사용을 제한하는 상대적으로 복잡하고 비싼합니다. 최근 우리는 약속을 보여주는 휴대 전화, 13,14에 통합 된 콤팩트하고 경량 형광 이미징 세포 계측법 및 현미경 장치를 개발 비용 효율적위한 리소스 제한 환경에 형광 현미경, 흐름 세포 계측법 및 관련 마이크로 분석 기법을 번역 세계 보건에 영향을 미치는 다양한 telemedicine 응용 프로그램.
optofluidic 흐름 세포 계측법 구성에서 (예를 들어 그림 1C 및 1D 참조), 맞춤 설계 polydimethysiloxane (PDMS) 기반 마이크로 유체 채널 positione입니다발광 - 다이오드 (LED)이 채널의 가장자리에 엉덩이 연결되는 휴대폰 카메라 유닛, 앞의 D. 이 마이크로 칩은 함께 액체 샘플 내부와, 여기 광이 균일 마이크로 채널 내부의 형광 라벨이 표본을 넣으려고 안내되는 등 광학 유체 평면 도파관 (예를 들어 PDMS - 액체 - PDMS 용으로 구성) 형성한다. 이 표시 객체의 형광 방출, 예를 들어 세포가 추가로 휴대폰 카메라 유닛 후에 바로 위치 추가 렌즈를 통해 이미지로되어 있으며 휴대 전화 보완 금속 - 산화물 - 반도체 (CMOS) 이미지 센서에 매핑됩니다. 형광 방출이 여기 빛의 경로에 수직 수집되어 있기 때문에, 저렴한 플라스틱 흡수 필터는 분산 된 여기 빛을 제거하기에 충분하며, 형광 이미징에 필요한 괜찮은 어두운 필드 배경을 제공 할 수 있습니다. 우리는 이미지 합계에 형광 물체도 비슷한 광학 유체 디자인을 할 수 사용형광 입자가 두 유리 사이에 끼어되는 IC 모드 (그림 1A와 1B 참조), 휴대 전화 CMOS 이미지 입자 계산을위한 센서와에 의해 캡처되어 대신 이러한 형광 입자의 마이크로 유체 채널 및 형광 방출을 통해 유동의 슬라이드 특성. 다른 응용 프로그램 요구 사항, 유동 세포 계측법이나 폭 넓은 분야 형광 현미경에 따라 선택할 수 있습니다. 예를 들어, 휴대폰 유동 세포 계측법 장치는 희귀 한 셀이나 병원균의 검출을위한 액체 샘플 (몇 ML을 예를 들어)의 큰 볼륨을 검사에 특히 유용 할 수 있습니다.
이 원고에서 우리는 컴팩트하고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 휴대 전화의 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합에 최근 결과의 일부를 검토합니다. 이 휴대 전화 기반의 마이크로 분석, 이미징 세포 계측법 및 감지 플랫폼은 다양한 기회를 제공 할 수telemedicine과 포인트의 케어 진단, 특히 세계의 자원 제한된 지역에서 글로벌 건강 문제와의 싸움에 영향을.
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Protocol
이 섹션에서는, 우리는 휴대 전화 바탕으로 폭 넓은 분야 형광 현미경 13 광학 유체 이미징 세포 계측법 플랫폼 14 실험 프로토콜을 소개합니다. 우리는이 이미징 플랫폼을 테스트하기 위해 형광 구슬과 휘황 표시 백혈구를 사용합니다.
휴대 전화의 A. 준비는 와이드 필드 형광 현미경 및 광 유체 이미징 흐름 Cytometer를 바탕으로
카메라 폰 및 첨부 파일 추가에 소형 광학 유체 : 휴대 전화 바탕으로 폭 넓은 분야 형광 현미경이나 흐름 cytometer는 두 가지 주요 부분으로 구성되어 있습니다.
1. 카메라 폰
발표 기술은 거의 모든 카메라 폰에 적용하는 동안, 우리는이 장치에 대한 거점으로 소니 에릭슨 Aino를 선택했다. 이 휴대 전화에 설치 ~ 8 메가 픽셀 RGB CMOS 센서와의 초점 거리 (F 1) ~ 4.65 mm가 내장 된 렌즈가 있습니다. 2. 와이드 필드 형광 현미경을위한 광 유체 첨부 파일
광학 첨부 파일은 오토 데스크가 설계되어 있으며 ABSplus 열가소성 소재를 사용하여 3-D 프린터 치수 엘리트에 의해 인쇄됩니다. 이 인쇄 과정에서, 모델 및 지원 자료는 프린터에서 압출 머리에 가열하고 모델링베이스 층에 층을 증착하고 있습니다. 이 단계가 완료되면 지원 자료는 당사의 광학 첨부 파일 디자인 LED가 (~ 470 nm의 센터 파장 Digikey), 플라스틱 필터 (# NT54-46, 에드먼드로 구성되어 원하는 프로토 타입의 강력한 3D 모델을 떠나지, 용해 할 수 있습니다 광학), 샘플 트레이 및 평철의 렌즈 F 2 = 15mm (# NT45-302, 에드먼드 광학). 모든 LED 및 플라스틱 필터는 쉽게 fluorophores '스펙트럼에 따라 변경 될 수 있습니다. 이 광학 유체 첨부 파일을 조립하는 단계는 다음과 같습니다 :
- 그 구체적인 렌즈 홀더 위치에서 첨부 파일에 렌즈를 배치합니다.
- 필터 트레이에 플라스틱 필터를 놓고 첨부 파일에 밀어, 또는 테이프 휴대폰 카메라 렌즈 앞의 플라스틱 필터입니다.
- 첨부 파일에 LED 트레이를 삽입합니다.
- 샘플 트레이에 샘플 유리 슬라이드를 놓습니다. 첨부 파일에 샘플 트레이를 밀어 넣습니다. 샘플을 향해 LED를 직면하고 있습니다.
- 추가 렌즈가 직접 휴대폰 카메라 렌즈와 연락 있다는 등의 휴대 전화에 첨부 파일을 클립.
- LED가 켜 첨부 파일에있는 스위치를 사용합니다.
- 는 "야간 모드"를 사용하여 휴대 전화 카메라 유닛과 관심의 이미지 샘플을.
3. 형광 이미징 세포 계측법을위한 광 유체 첨부 파일
희귀 한 사건의 검출을위한 액체 샘플의 큰 볼륨을 화면에 필요가있는 경우, optofluidic 유동 세포 계측법 장치가 선호 될 수 있습니다. 우리는 우리의 폭 넓은 분야 형광 현미경 디자인을 수정하고 흐름 cytometer, w로 변환 할 수 있습니다여기에 PDMS 기반의 마이크로 유체 채널이 지속적으로 이미징 볼륨을 통해 액체 샘플을 제공하는 데 사용됩니다. 광학 첨부 파일은 오토 데스크가 설계하고 크기가 엘리트 3-D 프린터를 인쇄합니다. 또한 LED가 (~ 470 nm의에서 중심 파장, Digikey), 플라스틱 필터 (# NT54-46, 에드먼드 광학), 샘플 트레이, 그리고 비구면 렌즈 (F = 4.5 mm) (제품 # C230TME-A로 구성되어 있습니다; Thorlab). 이 광학 유체 첨부 파일을 조립하는 단계는 다음과 같습니다 :
- 첨부 파일에 비구면 렌즈를 배치합니다.
- 필터 트레이에 플라스틱 필터를 놓고 첨부 파일에 밀어, 또는 테이프 휴대 전화 카메라 렌즈 앞의 플라스틱 필터입니다.
- 같은 광학 유체 첨부 파일에 마이크로 유체 채널을 밀어 넣습니다.
- 추가 렌즈가 직접 휴대폰 카메라 렌즈와 연락 있다는 등의 휴대 전화에 첨부 파일을 클립.
- LED가 켜 첨부 파일에있는 스위치를 사용합니다.
- microfluid를 연결IC는 주사기 펌프에 채널 및 일정한 유량의 마이크로 유체 장치에 액체 샘플을 제공합니다.
- 형광 셀 / 휴대폰 카메라의 비디오 모드를 사용하여 마이크로 유체 채널을 통해 흐르는 입자의 동영상을 캡처합니다.
B. 샘플 준비
4. 형광 마이크로 입자 샘플의 작성
- 10 μm 직경 (: 제품 # F8834 여기 / 580nm/605nm 방출, 녹색 구슬 : 빨강 구슬 제품 # F8836 : 여기 / 방출 505nm/515nm)과 형광 구슬은 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하고 있습니다.
- 녹색 형광 구슬, DI 물을 40 μl와 붉은 색 형광 구슬의 10 μl 10 μl를 섞는다.
- micropipette와 샌드위치 구조를 만들기 위해 그것의 상단에 다른 유리 덮개를 씌우고을 사용하여 유리 슬라이드에이 구슬 혼합물의 Place10 μl.
- 샘플 작업 표시 줄에이 샌드위치 구조를 삽입하고 휴대 전화의 첨부 파일에 밀어.
5. 휘황 레이블 화이트 혈액 세포의 준비
- SYTO16 핵산 형광 라벨 키트 (# S7578, 생명 기술)와 인산을 생리 (PBS)는 냉장고에서 아웃 버퍼와 실내 온도로 방문을 유도 할 수 있습니다.
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 혈액 수집 관에서 1.5 ML의 폴리스티렌 튜브 (# 05-408-129, 피셔 과학)에 200 μl 전체 혈액 샘플을 전송합니다.
- 철저하게 200 μl 전체 혈액 샘플과 믹스에 (# R7757, 시그마 - 알드리치) 1 ML 적혈구 lysing 버퍼를 추가합니다.
- 5 분 후, lysed 혈액 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 솔루션을 제거합니다.
- 200 μl PBS 버퍼로 백혈구 세포 펠렛을 Resuspend하고 부드럽게을 섞는다.
- 흰색 혈액 세포 샘플 5 μl 1 ㎜ SYTO16 솔루션을 추가 할 수 있습니다. ~ 30 분에 대한 어두운 환경에서 알루미늄 호일 및 배양과 샘플을 넣어.
- 다시 샘플을 원심 분리기. 표면에 뜨는이 제거되고 분류 백혈구 세포 펠렛을 다시합니다PBS 버퍼로 - 일시 중지되었습니다.
- 커버 슬립에 흰색 혈액 세포 액체 샘플을 표시 5-10 μl를 배치하고, 표본의 상단에 두 번째 커버 슬립을 배치합니다.
- 샘플 작업 표시 줄 및 이미지를 휴대 전화 형광 현미경을 사용하여에 끼어 샘플 슬라이드를 삽입합니다.
양자 택일로
- 지속적으로 또한 비디오 모드에 휴대폰 카메라를 사용하여 흐르는 세포의 형광 현미경 동영상을 캡처하는 동안, 자동 주사기 펌프를 사용하여 마이크로 유체 채널을 통해 휘황 표시 백혈구를 제공합니다. 우리는 또한 휴대용 배터리 전원 주사기 펌프 또는 중력 힘이 마이크로 유체 채널을 통해 흐름을 유도하기 위해 이용 될 수 있다는 것을 강조한다.
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Representative Results
휴대폰 카메라가 흐르는 세포의 시간 경과 형광 현미경 동영상을 기록하는 동안 펌핑 광학 유체 / 여기 체계 (인물 1C 및 1D)로 휘황 표시 세포는 지속적으로 주사기 펌프를 사용하여 마이크로 유체 채널에 제공 할 수 있습니다. 이러한 형광 영화는 이후 빠르게 형광 이미징 흐름 cytometer의 기능을 고려 자동으로 절대 번호와 마이크로 유체 채널을 통해 흐르는 세포의 밀도를 결정하기 위해 윤곽 - 감지 및 추적 알고리즘 14,15을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 위에서 설명한 플랫폼 (인물 1C 및 1D) 및 샘플 준비 프로토콜을 기반으로, 우리는 표준 혈액학 분석기에 대한 비교 결과를 달성, 인간의 혈액 샘플에서 총 흰색 혈액 세포 (백혈구)의 정확한 계산을 보여 주었다. 또는 14 우리가 할 수있는 또한 이미지 형광 셀 / 입자모든 유체 흐름없이, 예를 들어 매우 큰 샘플 뷰 필드 ~ 예를 들어도 2 및도 3에 도시 된 바와 같이 ~ 10 μm의 공간 해상도를 가진 81mm 2 달성하는 정적 모드에서, 13 등. 광학 수차의 소스가 좀 더 복잡한 렌즈 시스템을 설계하여 감소 될 수있다. 또는, 또한 부분적으로 수차와 공간 패턴의 소스를 특성화하여 디지털 영상 처리를 통해 해결 될 수 있습니다.
그림 1. (A) 도식 일러스트와 (B) 휴대 전화 기반의 폭 넓은 분야 형광 현미경의 그림 13. (C) 도식 일러스트 및 (D)휴대 전화 기반 이미징 흐름 cytometer의 그림. 14 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
. 580 nm/605 nm의, 녹색 구슬 여기 : 505 nm/515 nm의 붉은 구슬 여기 / 방출, 그림 2의 휴대 전화 기반의 형광 현미경 13 성능 이미징 형광 구슬 (10 μm 직경 녹색과 붉은 구슬이 특징입니다 ). 점잖은 이미지 품질이 ~ 81mm 2 뷰 필드를 통해 달성되고, (A, B, C)을 참조하십시오. 이 중앙 뷰 필드의 가장자리를 향해, aberrated 지역이 있습니다, 예 (DE)을 참조하십시오.
그림 3 위로 이미지 :. 휘황 표시 백혈구의 휴대폰 이미지 13 (A-1) :. 상단 이미지에서 잘라 휘황 표시 흰색 혈액 세포의 디지털 확대 휴대폰 이미지입니다. (A-2) : 압축 디코딩은 (A-1)에 표시된 휴대폰 이미지에 대한 18 결과. (A-3) : 종래의 형광 현미경 (10X 목적, NA = 0.25)보기 같은 분야의 비교 이미지입니다.
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Discussion
우리는 폭 넓은 분야 형광 현미경과 휴대 전화 카메라로 경량 및 소형 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 광학 유체 이미징 유동 세포 계측법을 기반으로 휴대 전화에 우리의 최근 결과를 발표했습니다. 이 플랫폼 기술을 사용 우리는 마이크로 입자와 전체 혈액 샘플에 표시 백혈구 등의 형광 개체를 이미지로. 따라서,이 컴팩트하고 비용 효율적인 휴대 전화 기반의 형광 이미징 도구 모음은 CD4에 대한 이러한 HIV + 환자의 모니터링과 같은 다양한 세계적인 건강 문제를 방지 특히 자원 제한 지역에서, 포인트의 케어 진단에 유용 할 수 있습니다 + T 림프구 카운트 .
신체 유체의 분석 외에 같은 휴대 전화 기반의 광학 유체 세포 계측법 플랫폼은 또한 자원 제한 설정에서 물 / 식품 품질의 예를 들어 모니터링을위한 형광 immunoassays의 정량화와 같은 다른 감지 요구 사항에 유용 할 수 있습니다. 이를 향해, 우리는 최근 데모가같은 광학 유체 휴대폰 첨부 파일 16를 사용하여 물과 우유 샘플에서 H7 (대장균) : 에스 대장균 O157의 민감한, 구체적이고 빠른 검색을 nstrated. 우리는 특별히 표면에 작용 유리 모세 혈관을 활용하고 민감 E.를 캡처 각 모세관을 통해 비행 한 액체 샘플에서 대장균 입자. 이 캡처 E. 대장균 입자가 더욱 양자 점 (QD) 복합 이차 항체로 분류되었습니다. 이러한 작용 모세 혈관에서 형광 방출은 다음 캡처 E.의 밀도를 추정하는 데 사용 된 모세관 길이를 따라 광학 유체 휴대폰 이미징 플랫폼과 통합 된 형광 강도를 사용하여 감지되었습니다 대상 솔루션 대장균 입자가 있습니다.이 광학 유체 접근 방법으로, 우리는 물과 우유 샘플 16 모두에서 ~ 5-10 CFU / ML의 검출 한계를 보여 주었다.
마지막으로, 우리는주의해야 그 t에 따라그는 응용 프로그램의 요구,이 플랫폼의 광학 배율과 해상도는 F는 외부 렌즈 (그림 1A)의 초점 길이 휴대폰 카메라 렌즈 및 f (2)의 초점 길이되어 있습니다 F / F 2를 변경하여 조정 할 수 있습니다 . 시스템 배율뿐만 아니라, 우리는 또한 LED 트레이 및 관련 필터가 쉽게 특정 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다 다양한 fluorophores 또는 immunochromatographic assays에 대한 수용하기 위해 서로 다른 색상으로 변경 될 수 있습니다해야합니다. 17
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Disclosures
박사 Ozcan는 전산 영상과 현미경 도구를 상용화하는 것을 목표로 시동 회사의 설립자입니다.
Acknowledgments
A. Ozcan는 굉장히 과학자와 기술자에 대한 대통령 조기 직업 상 (PECASE)의 지원을 인정 육군 연구 사무소 (ARO) 젊은 연구자 상, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (NSF) 경력 상, 해군 연구 사무소 (ONR) 젊은 연구자 상 보건 국립 연구소 (NIH) 이사, 보건 국립 연구소의 사무실에서 감독의 새로운 혁신 상 DP2OD006427.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
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