Summary
Wir überprüfen unsere jüngsten Ergebnisse auf der Integration der Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf einem Mobiltelefon mit kompakten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. Diese Handy-Basis Mikro-Analyse-Geräte könnte für durchflusszytometrische Analyse nützlich, wie die Ausführung verschiedener Zellzählung Aufgaben sowie für High-Throughput-Screening von z. B. Wasserproben in beschränkten Ressourcen-Einstellungen.
Abstract
Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie sind weit Werkzeugen in der biomedizinischen Forschung und der klinischen Diagnostik eingesetzt. Allerdings sind diese Geräte sind in der Regel relativ sperrig und teuer, so dass sie weniger wirksam in den beschränkten Ressourcen-Einstellungen. Potenziell Bewältigung dieser Einschränkungen haben wir vor kurzem die Integration von Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf Handys gezeigt mit kompakten, leichten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. In unserem Durchflusszytometrie Design sind fluoreszenzmarkierte Zellen durch einen mikrofluidischen Kanal, der über dem bestehenden Handy-Kamera positioniert gespült wird. Batteriebetriebenen Leuchtdioden (LEDs) sind an der Seite des mikrofluidischen Chips, die effektiv wirkt als Multi-Mode-Wellenleiter, wobei das Anregungslicht geführt gleichmäßig erregen die fluoreszierenden Meßobjekten wird stumpf gekoppelt. Das Mobiltelefon Kamera ein Zeitraffer-Film der fluoreszierenden Zellen fließt durchdie mikrofluidischen Kanal, wo die digitalen Rahmen des Films verarbeitet, um die Anzahl der markierten Zellen in der Ziellösung von Interesse zählen sind. Unter Verwendung eines ähnlichen opto-fluidische Aufbau kann auch diese Bild fluoreszenzmarkierte Zellen im statischen Modus durch zB die fluoreszierenden Teilchen sandwichartig zwischen zwei Glasplatten und Erfassung ihrer fluoreszierenden Bildern unter Verwendung des Mobiltelefons Kamera, die eine räumliche Auflösung von z. B. erreichen kann ~ 10 um über einen sehr großen Feld-of-view von ~ 81 mm 2. Diese Handy-Basis Fluoreszenz-Bildgebung Durchflusszytometrie und Mikroskopie-Plattform könnte besonders in beschränkten Ressourcen-Einstellungen nützlich sein, z. B. Zählen von CD4 + T-Zellen in Richtung Überwachung von HIV + Patienten oder für die Erkennung von Wasser-borne Parasiten im Trinkwasser.
Introduction
Mikroskopie und Durchflusszytometrie sind weit Techniken 1-12 in der biomedizinischen und der wissenschaftlichen Forschung sowie der klinischen Diagnostik zum Zählen und Charakterisierung von verschiedenen Zelltypen verwendet. Allerdings sind herkömmliche Mikroskope und Durchflusszytometrie Instrumenten relativ komplex und teuer, was ihren Einsatz begrenzt, hauptsächlich etablierten zentralen Labors. Vor kurzem haben wir eine kompakte und leichte Fluoreszenz-Bildgebung Durchflusszytometrie und Mikroskopie Gerät auf einem Handy, 13,14 integriert, zeigt Versprechen entwickelt kostengünstig übersetzen Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie und verwandten Mikro-Analyse Techniken, um mit begrenzten Ressourcen Umgebungen für verschiedenen Anwendungen der Telemedizin Auswirkungen der globalen Gesundheit.
In der optofluidischer Durchflusszytometrie Konfiguration (siehe z. B. Abbildung 1C und 1D), ist ein speziell angefertigten Polydimethylsiloxan (PDMS) basiert mikrofluidischen Kanal positioned vor dem Mobiltelefon Kamera-Einheit, wobei Licht emittierende Dioden-(LED) sind an den Kanten des Kanals Stumpfschweißen gekoppelt. Diese mikrofluidischen Chip zusammen mit der flüssigen Probe im Inneren bildet einen opto-fluidische planaren Wellenleiter (zusammengesetzt aus beispielsweise PDMS-Flüssig-PDMS), so dass das Anregungslicht geführt wird, gleichmäßig zu pumpen die fluoreszierend markierten Proben innerhalb des Mikrokanals. Die Fluoreszenzemission von diesen markierten Objekte, z. B. Zellen, wird ferner durch eine zusätzliche Linse direkt nach dem Mobiltelefon Kamera-Einheit platziert abgebildet wird und auf dem Mobiltelefon Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) Bildsensor abgebildet. Da die Fluoreszenzemission senkrecht zur Anregungslichtpfad gesammelt, ist eine kostengünstige Kunststoff Absorptionsfilter ausreicht, um das gestreute Anregungslicht zu entfernen und einen angemessenen Dunkelfeld-Hintergrund für Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich sind. Mit einer ähnlichen opto-fluidischen Design, können wir auch Bild die fluoreszierenden Objekte in statIC-Modus (siehe 1A und 1B), in dem die fluoreszierenden Teilchen zwischen zwei Glasplatten eingeschlossen sind gleitet statt Durchströmen eines mikrofluidischen Kanals und der Fluoreszenzemission von dieser fluoreszierenden Teilchen durch das Mobiltelefon CMOS-Bildsensor für Partikelzählung und eingefangen Charakterisierung. Basierend auf verschiedenen Anwendungsanforderungen, Durchflusszytometrie oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ausgewählt werden. Zum Beispiel könnte Mobiltelefons Durchflusszytometrie Vorrichtung besonders nützlich zum Screening großer Volumina flüssiger Proben (zB ein paar ml) für die Detektion von seltenen Zellen oder Pathogenen.
In diesem Manuskript wir einige unserer jüngsten Ergebnisse auf der Integration der Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf einem Mobiltelefon mit kompakten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. Diese cell-phone-basierten Mikro-Analyse, Imaging-Zytometrie und Sensorik Plattformen könnten bieten verschiedene Möglichkeitenfür Telemedizin und Point-of-Care-Diagnostik, insbesondere Auswirkungen auf unseren Kampf gegen die globale gesundheitliche Herausforderungen in beschränkten Ressourcen Regionen der Welt.
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Protocol
In diesem Abschnitt stellen wir die experimentelle Protokolle für unsere Handy-Basis Weitfeld-Mikroskopie 13 und opto-fluidischen Imaging-Zytometrie Plattform 14. Wir verwenden fluoreszierenden Perlen und fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen, diese bildgebende Plattformen testen.
A. Herstellung von Cell-phone Basierend Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskop und Optofluidikvorrichtung Imaging Durchflusszytometer
Das Mobiltelefon basiert wide-field Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer besteht aus zwei Hauptteilen: ein Kamera-Handy und ein kompaktes opto-Fluidik-Befestigung.
Ein. Der Camera Phone
Während die vorgestellten Techniken auf fast jedes Kamera-Handy sind, haben wir Sony Erickson Aino als Basis für diese Geräte gewählt. Diese Zelle-Telefon verfügt über ein ~ 8 MegaPixel RGB CMOS-Sensor installiert ist und eine eingebaute Linse, die eine Brennweite (f 1) von ~ 4,65 mm hat. 2. Optofluidikvorrichtung Aufsatz für Weitwinkel-Fluoreszenz-Mikroskopie
Die optische Befestigung durch Autodesk entworfen und wird von einer Dimension Elite 3-D-Drucker mit ABSplus thermoplastischen Material gedruckt. In diesem Druckvorgang werden Modell und Trägermaterialien in einem Extrusionskopf in dem Drucker erhitzt und abgeschiedene Schicht für Schicht auf einer Modellierung Base. Wenn dieser Schritt abgeschlossen ist, kann das Trägermaterial gelöst, so dass ein robuster 3D-Modell des gewünschten Prototyps Unsere Vorsatzoptik Ausführung besteht aus LEDs (Mittenwellenlänge bei ~ 470 nm, Digikey), einen Kunststoff-Filter (# NT54-46, Edmund Optik), eine Probenschale und eine plankonvexe Linse f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Alle LEDs und Kunststoff-Filter kann leicht anhand der Fluorophore 'Spektren geändert werden. Die Schritte für die Montage dieses opto-fluidischen Anlage gehören:
- Legen Sie die Linse in der Anlage im Rahmen ihrer spezifischen Linsenhalter Position.
- Setzen Sie die Kunststoff-Filter auf den Filter-Fach und schieben Sie sie in die Halterung, oder kleben Sie das Kunststoff-Filter vor der Handy-Kamera.
- Legen Sie die LED Fach in der Anlage.
- Legen Sie die Probe Glasträger in den Probenteller. Schieben Sie den Probenteller in die Anlage. Stell dich den LEDs auf die Probe.
- Stecken Sie den Aufsatz auf dem Mobiltelefon, so dass die zusätzliche Linse direkt in Kontakt mit dem Mobiltelefon Kameralinse.
- Verwenden Sie den Schalter auf die Befestigung auf der LEDs einzuschalten.
- Bild der Probe von Interesse mit der Handy-Kamera-Einheit mit seiner "Nacht-Modus".
3. Optofluidikvorrichtung Aufsatz für Fluorescent Imaging Cytometry
Wenn es notwendig ist, große Mengen an flüssigen Proben für den Nachweis von seltenen Ereignissen screenen, könnte optofluidischer Durchflusszytometrie Vorrichtung bevorzugt sein. Wir ändern unsere wide-field Fluoreszenzmikroskop Design und wandeln es in einem Durchflusszytometer, whier ein PDMS basierten mikrofluidischen Kanal verwendet wird, kontinuierlich liefern die flüssige Probe durch das Bildgebungsvolumen. Die optische Anlage wird auch von Autodesk entwickelt und gedruckt von Dimension Elite 3-D-Drucker. Es besteht ebenfalls aus LEDs (Mittenwellenlänge bei ~ 470 nm, Digikey), einen Kunststoff-Filter (# NT54-46, Edmund Optics), einem Probenteller und einer asphärischen Linse (f = 4,5 mm) (Produkt # C230TME-A; Thorlab). Die Schritte für die Montage dieses opto-fluidischen Anlage gehören:
- Legen Sie die asphärische Linse in der Anlage.
- Setzen Sie die Kunststoff-Filter auf den Filter-Fach und schieben Sie sie in die Halterung, oder kleben Sie das Kunststoff-Filter vor der Handy-Kamera-Objektiv.
- Schieben Sie den mikrofluidischen Kanal in die gleiche opto-fluidischen Anlage.
- Stecken Sie den Aufsatz auf dem Mobiltelefon, so dass die zusätzliche Linse direkt in Kontakt mit dem Mobiltelefon Kameralinse.
- Verwenden Sie den Schalter auf die Befestigung auf der LEDs einzuschalten.
- Verbinden Sie den mikrofluidischenIC-Kanal an den Spritzenpumpe und liefern die flüssige Probe in die Mikrofluidik-Vorrichtung bei einer konstanten Flußrate.
- Nehmen Sie einen Film der fluoreszierenden Zellen / Partikel, die durch den mikrofluidischen Kanal mit Hilfe der Video-Modus der Handy-Kamera.
B. Probenvorbereitung
4. Herstellung von optischen Micro-Partikel-Proben
- Fluoreszierende Kügelchen mit 10 Mikrometer Durchmesser (rot Perlen: product # F8834 Anregung / Emission 580nm/605nm; grünen Perlen: product # F8836: Anregung / Emission 505nm/515nm) von Invitrogen (Carlsbad, CA) gekauft.
- Mix 10 ul des grün fluoreszierenden Kügelchen, 10 ul rot fluoreszierende Kügelchen mit 40 ul DI-Wasser.
- Place10 ul dieser Wulst Mischung auf einem Glasträger unter Verwendung einer Mikropipette und setzte noch einen Glasträger auf der Oberseite davon, um eine Sandwich-Struktur zu machen.
- Legen Sie diese Sandwich-Struktur in den Probenteller und schieben Sie sie in die Handy-Befestigung.
5. Vorbereitung von fluoreszenzmarkierten White Blood Cells
- Nehmen SYTO16 Nukleinsäure Fluoreszenzmarkierung Kit (# S7578, Life Technology) und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) aus dem Kühlschrank und bringen sie auf Raumtemperatur.
- Übertragen 200 ul Vollblut aus EDTA-Blutentnahmeröhrchen bis 1,5 ml Polystyrol-Röhrchen (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- 1 ml roter Blutkörperchen Lysepuffer (# R7757, Sigma-Aldrich) zu den 200 ul Vollblut und gründlich mischen.
- Nach 5 min zentrifugieren lysierten Blutprobe und entfernen Sie die überstehende Lösung.
- Resuspendieren des weißen Blutkörperchen Pellet in 200 ul PBS-Puffer und vorsichtig mischen sie.
- Hinzufügen 5 ul 1 mM SYTO16 Lösung des weißen Blutzellprobe. Wickeln Sie die Probe mit Aluminiumfolie und inkubieren in dunkler Umgebung für ~ 30 min.
- Zentrifuge die Probe wieder. Überstand wird entfernt und die markierten Leukozyten-Pellet wird erneutIn PBS-Puffer suspendiert.
- Platzieren 5-10 ul markierten Leukozyten flüssigen Probe auf ein Deckglas, und legen ein zweites Deckglas auf der Oberseite der Probe.
- Legen Sie die Sandwich Probenobjektträger in den Probenteller und Bild, das sie mit dem Handy-Fluoreszenzmikroskop.
Alternativ
- Kontinuierlich liefern die fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen durch einen mikrofluidischen Kanal mit Hilfe eines automatisierten Spritzenpumpe, aber auch die Erfassung eines fluoreszierenden mikroskopischen Film der fließenden Zellen unter Verwendung des Handy-Kamera im Video-Modus. Wir sollten auch betonen, dass eine tragbare batteriebetriebene Spritzenpumpe oder sogar Schwerkraft ausgenutzt werden, um die Strömung durch den mikrofluidischen Kanal anzutreiben.
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Representative Results
Mit unserem opto-Fluidpumpsystem / Anregungsschema (1C und 1D), können fluoreszenzmarkierte Zellen kontinuierlich in den mikrofluidischen Kanal mit einer Spritze Pumpe geliefert werden, während der Handy-Kamera ein Zeitraffer fluoreszierende mikroskopischen Film der fließenden Zellen. Diese fluoreszierenden Filme können dann rasch analysiert werden unter Verwendung Kontur-Erkennung und Tracking-Algorithmen 14,15 zur automatischen Bestimmung der absoluten Anzahl und die Dichte der Zellen fließt durch die mikrofluidische Kanäle, wobei die Funktion einer Fluoreszenzabbildung Durchflusszytometer. Basierend auf dem oben beschriebenen Plattform (1C und 1D) und Probenvorbereitung Protokolle zeigten wir genaues Zählen der gesamten weißen Blutkörperchen (Leukozyten) im menschlichen Blutproben, vergleichbare Ergebnisse erzielt gegen einen Standard Hämatologieanalysator. 14 Alternativ können wir auch Bild die fluoreszierenden Zellen / Partikelim statischen Modus, 13, so daß ohne fluidische Strömung Erzielung einer sehr großen Probe field-of-view von zB ~ 81 mm 2 mit einer räumlichen Auflösung von ~ 10 um, wie in Beispiel 2 und 3 veranschaulicht. Quellen optischer Aberration kann durch die Gestaltung eines komplexeren Linsensystems gekürzt. Alternativ kann es auch teilweise durch digitale Bildverarbeitung werden durch Charakterisieren die Quelle der Aberration und deren räumliche Muster korrigiert.
Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung und (B) Bild von einem cell-phone-based wide-field Fluoreszenzmikroskop. 13 (C) Schematische Darstellung und (D)Bild von einem Handy-basierten Imaging Durchflusszytometer. 14 Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
. 580 nm/605 nm, grüne Perle Erregung: 505 nm/515 nm rote Perle Anregung / Emission; Abbildung 2 Die Leistung unserer Handy-basierte Fluoreszenzmikroskop 13 wird durch bildgebende fluoreszierende Kügelchen (10 &mgr; m Durchmesser grünen und roten Perlen gekennzeichnet ). Eine anständige Bildqualität über ein Feld-of-view von ~ 81 mm 2 erreicht, siehe (A, B, C). Gegen den Rändern dieser zentralen field-of-view, gibt es aberrierten Regionen; siehe z. B. (DE).
Abbildung 3 oben:. Mobiltelefon Bilder von fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen 13 (A-1):. Digital herausgezoomt Mobiltelefons Bild von fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen aus dem oberen Bild abgeschnitten. (A-2): Druckfestigkeit Decodierungsergebnisse 18 für das Mobiltelefon Bild in (A-1) gezeigt. (A-3): Konventionelle Fluoreszenzmikroskop (10X-Objektiv, NA = 0,25) gegenüber Bild des gleichen Sichtfeld.
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Discussion
Wir haben unsere bisherigen Ergebnisse auf Mobiltelefons basierend Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und opto-fluidische Bildgebung Durchflusszytometrie unter Verwendung leicht und kompakt opto-fluidische Anhänge auf Handy-Kameras präsentiert. Mit dieser Plattform Technologie, die wir abgebildet fluoreszierenden Objekten einschließlich Mikro-Partikel und beschriftet weißen Blutkörperchen in Vollblutproben. Daher könnte diese kompakte und kostengünstige Handy-basierte Fluoreszenz-Bildgebung Toolset nützlich sein für Point-of-Care-Diagnostik, insbesondere der Ressourcen begrenzten Bereichen zur Bekämpfung von verschiedenen globalen Gesundheitsproblemen, wie die Überwachung von HIV + Patienten für ihre CD4 + T-Lymphozyten zählt .
Neben Analyse von Körperflüssigkeiten, die gleiche cell-phone-based opto-fluidischen Zytometrie Plattform kann auch nützlich sein für andere sensing Bedürfnisse wie die Quantifizierung der Fluoreszenz-Immunoassays für zB Überwachung von Wasser / Lebensmittelqualität in begrenzten Ressourcen Einstellungen. Zu diesem Zweck haben wir vor kurzem demonstrated empfindlichen, spezifischen und schnellen Nachweis von Escherichia coli O157: H7 (von E. coli) in Wasser und Milchproben mit demselben opto-fluidische Mobiltelefons Aufsatz 16. Wir verwendeten oberflächenfunktionalisierte Glaskapillaren zu spezifisch und sensitiv zu erfassen E. coli Partikeln in flüssigen Proben, die durch jede Kapillare geflogen wurden. Diese erfasst E. coli Partikel wurden weiter mit Quantenpunkt-(QD) konjugierten sekundären Antikörpern markiert. Die Fluoreszenzemission von diesen funktionalisierten Kapillaren wurde dann unter Verwendung des opto-fluidische Mobiltelefons Bildgebungsplattform und die integrierte Fluoreszenzintensität entlang der Kapillarlänge wurde verwendet, um die Dichte des aufgenommenen E. abzuschätzen coli Teilchen in der Ziellösung. Bei dieser opto-fluidische Konzept zeigten wir eine Nachweisgrenze von ~ 5-10 KBE / ml in Wasser und Milchproben 16.
Schließlich sollten wir beachten, dass je nach tEr Anwendung benötigt, kann die optische Vergrößerung und Auflösung dieser Plattform, indem f / f 2, wobei f die Brennweite der Handy-Kamera und f 2 wird die Brennweite des externen Objektiv (Abbildung 1A) abgestimmt werden . Neben Systems Vergrößerung, sollten wir auch beachten, dass die LED-Fach und die zugehörigen Filter leicht unterschiedliche Farben geändert werden, um für verschiedene Fluorophore oder sogar immunochromatographic Assays, die in bestimmten Anwendungen verwendet werden könnten, aufzunehmen. 17
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Disclosures
Dr. Ozcan ist der Gründer eines Start-up-Unternehmen, die Computational Imaging und Mikroskopie Werkzeuge zu vermarkten soll.
Acknowledgments
A. Ozcan dankt die Unterstützung der Presidential Early Career Award für Wissenschaftler und Ingenieure (PECASE), Army Research Office (ARO) Young Investigator Award, der National Science Foundation (NSF) CAREER Award, Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award und National Institutes of Health (NIH) Director New Innovator Award DP2OD006427 aus dem Büro des Direktors, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
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