Summary
Esaminiamo i nostri risultati recenti sull'integrazione di microscopia a fluorescenza e di imaging strumenti di citometria a flusso su un telefono cellulare utilizzando compatte e convenienti opto-fluidici allegati. Questi cellulare basato micro-dispositivi di analisi può essere utile per l'analisi citometrica, ad esempio per eseguire operazioni di conteggio cellulari diversi e per high throughput screening di campioni di acqua, ad esempio in impostazioni delle risorse limitate.
Abstract
Microscopia a fluorescenza e citometria a flusso sono ampiamente utilizzati strumenti nella ricerca biomedica e diagnosi clinica. Tuttavia questi dispositivi sono in generale relativamente ingombranti e costosi, rendendoli meno efficaci nelle impostazioni delle risorse limitate. Per far fronte a queste limitazioni potenzialmente, abbiamo recentemente dimostrato l'integrazione di ampio campo di microscopia a fluorescenza e di imaging strumenti di citometria a flusso su telefoni cellulari utilizzando compatto, leggero, e costo-efficacia opto-fluidici allegati. Nel nostro disegno citometria di flusso, le cellule sono contrassegnati in modo fluorescente lavata attraverso un canale microfluidico che è posizionata sopra l'esistente cellulare telecamera. Alimentati a batteria diodi emettitori di luce (LED) sono di testa accoppiata al lato di questo chip microfluidica, che agisce efficacemente come una guida d'onda multimodale lastra, dove viene guidato la luce di eccitazione per eccitare uniformemente gli obiettivi fluorescenti. Il telefono cellulare fotocamera registra un film lasso di tempo di cellule fluorescenti fluisce attraversoil canale microfluidico, dove vengono elaborate le cornici digitali di questo film per contare il numero di cellule marcate nella soluzione bersaglio di interesse. Utilizzando un simile opto-fluidico disegno, possiamo anche un'immagine queste cellule contrassegnati in modo fluorescente in modalità statica es intramezzando particelle fluorescenti tra due vetrini e catturare le loro immagini fluorescenti utilizzando il telefono cellulare fotocamera, che possono raggiungere una risoluzione spaziale di esempio ~ 10 micron su un grande campo di vista di ~ 81 mm 2. Questo telefono cellulare basato fluorescente citofluorimetria imaging e microscopia piattaforma potrebbe essere utile specialmente in impostazioni di risorse limitate, per esempio il conteggio delle cellule T CD4 + verso il monitoraggio dei pazienti HIV + o per il rilevamento di acqua da parassiti nell'acqua potabile.
Introduction
Microscopia e citometria a flusso sono ampiamente utilizzate tecniche di 1-12 nella ricerca biomedica e scientifica, nonché la diagnosi clinica per il conteggio e la caratterizzazione di vari tipi di cellule. Tuttavia, microscopi convenzionali e flusso-citometria strumenti sono relativamente complesse e costose, che limita il loro uso principalmente alla laboratori centrali consolidate. Recentemente abbiamo sviluppato un citometria compatto e leggero dispositivo di imaging a fluorescenza e microscopia integrato su un telefono cellulare, che mostra la promessa 13,14 a costi contenuti tradurre microscopia a fluorescenza, citometria a flusso e le relative micro tecniche di analisi di ambienti con risorse limitate per applicazioni di telemedicina vari settori: la salute globale.
Nel optofluidic citometria a flusso di configurazione (vedere ad esempio la Figura 1C e 1D), una custom-designed polydimethysiloxane (PDMS) canale in base microfluidica è positioned davanti al telefono cellulare fotocamera-unità, dove emettitori di luce a diodi (LED) sono accoppiate di testa ai bordi del canale. Questo chip microfluidica, unito all'interno campione liquido, forma un opto-fluidico guida d'onda planare (composto ad esempio PDMS-liquido-PDMS) tale che la luce di eccitazione è guidata per pompare uniformemente i campioni etichettati fluorescenti all'interno del micro-canali. L'emissione di fluorescenza da questi oggetti etichettati, ad esempio, le cellule, è ulteriormente ripreso attraverso una lente aggiuntiva collocata subito dopo il telefono cellulare fotocamera unità ed è mappato sul cellulare Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) sensore di immagine. Poiché l'emissione fluorescente viene raccolto perpendicolare al percorso di luce di eccitazione, un filtro di assorbimento di plastica poco costoso è sufficiente rimuovere la luce diffusa di eccitazione e può fornire un discreto campo scuro sfondo necessaria per l'imaging fluorescente. Utilizzando un simile opto-fluidico disegno, possiamo anche l'immagine degli oggetti fluorescenti in static modalità (vedi figura 1A e 1B), in cui sono le particelle fluorescenti sandwich tra due vetrini invece di fluire attraverso un canale microfluidico e l'emissione fluorescente da queste particelle fluorescenti vengono catturati dal telefono cellulare sensore di immagine CMOS per conteggio di particelle e caratterizzazione. Sulla base delle diverse esigenze applicative, citometria a flusso o grande campo di microscopia a fluorescenza possono essere scelti. Per esempio, cellulare dispositivo citometria di flusso potrebbe essere particolarmente utile per lo screening di grandi volumi di campioni liquidi (ad esempio alcuni ml) per la rilevazione di cellule rare o patogeni.
In questo manoscritto passiamo in rassegna alcuni dei nostri recenti risultati sull'integrazione di microscopia a fluorescenza e di imaging strumenti di citometria a flusso su un telefono cellulare utilizzando compatte e convenienti opto-fluidici allegati. Questi cellulare a base di micro-analisi, citometria di imaging e le piattaforme di rilevamento in grado di fornire diverse opportunitàper la diagnostica di telemedicina e point-of-care, in particolare impatto la nostra lotta contro le sfide della salute globale nelle regioni delle risorse limitate del mondo.
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Protocol
In questa sezione, si introducono i protocolli sperimentali per il nostro cellulare in base a grande campo microscopia a fluorescenza 13 e opto-fluidici piattaforma di citometria di imaging 14. Useremo perline fluorescenti e contrassegnati in modo fluorescente le cellule bianche del sangue per testare queste piattaforme di imaging.
A. Preparazione del telefono cellulare Basato Wide-field microscopio a fluorescenza e Opto-fluidico citometro a flusso Imaging
Il telefono cellulare in base a grande campo microscopio a fluorescenza o citometria a flusso è costituito da due parti principali: un telefono con fotocamera e un compatto opto-fluidico aggiuntivo allegato.
1. La fotocamera del telefono
Mentre le tecniche presentate sono applicabili a qualsiasi telefono cellulare con fotocamera, abbiamo scelto Sony Erickson Aino come base per questi dispositivi. Questo cellulare ha un ~ 8 MegaPixel RGB sensore CMOS installato su di esso e un obiettivo incorporato che ha una lunghezza focale (f 1) di ~ 4,65 millimetri. 2. Opto-fluidico Attachment per Wide-field microscopia a fluorescenza
L'allegato ottico è stato progettato da Autodesk ed è stampato da un Elite Dimension stampante 3-D con materiale termoplastico ABSplus. In questo processo di stampa, materiali modello e il supporto vengono riscaldati in una testa di estrusione all'interno della stampante e si depositano a strati su una base di modellazione. Quando questo passaggio è completato, il materiale di supporto può essere dissolto, lasciando un solido modello 3D del prototipo desiderato nostro disegno allegato ottico composto da LEDs (centro lunghezza d'onda a 470 nm ~, Digikey), un filtro di plastica (# NT54-46, Edmund ottiche), un vassoio campioni, e una lente piano-convessa f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Tutti i led e filtri di plastica può essere facilmente modificato in base spettri dei fluorofori. I passaggi per assemblare questo opto-fluidico allegato comprendono:
- Posizionare la lente nell'attacco Nella sua posizione specifica porta-lente.
- Posizionare il filtro in plastica sul vassoio filtro e farlo scorrere in l'attacco, o nastro adesivo il filtro in plastica di fronte al telefono cellulare fotocamera.
- Inserire il vassoio LED in allegato.
- Porre i vetrini campione di vetro nel cassetto campione. Far scorrere il vassoio dei campioni in attacco. Affronta i LED verso il campione.
- Agganciare l'attacco sul telefono cellulare, in modo tale che la lente in più è direttamente in contatto con il telefono cellulare fotocamera.
- Utilizzare l'interruttore per il sequestro conservativo per accendere il LED.
- Immagine il campione di interesse con il telefono cellulare telecamera usando la sua "modalità notturna".
3. Opto-fluidico di collegamento per Citometria Imaging fluorescente
Quando vi è la necessità di schermare grandi volumi di campioni liquidi per la rilevazione di eventi rari, optofluidic dispositivo di citometria di flusso potrebbe essere preferito. Siamo in grado di modificare il nostro ampio settore del design microscopio a fluorescenza e di convertirlo in un citofluorimetro, wqui una base PDMS canale microfluidico vengono usati per fornire continuamente il campione di liquido attraverso il volume di imaging. Il collegamento ottico è progettato anche da Autodesk e stampato da Dimension Elite stampante 3-D. Si compone anche di LED (lunghezza d'onda centrale a ~ 470 nm, Digikey), un filtro in plastica (# NT54-46, Edmund Optics), un vassoio di campione e una lente asferica (f = 4.5 mm) (prodotto # C230TME-A; Thorlab). I passaggi per assemblare questo opto-fluidico allegato comprendono:
- Posizionare la lente asferica in allegato.
- Posizionare il filtro in plastica sul vassoio filtro e farlo scorrere in l'attacco, o nastro adesivo il filtro in plastica di fronte alla lente della fotocamera del cellulare.
- Far scorrere il canale microfluidica nello stesso opto-fluidico attacco.
- Agganciare l'attacco sul telefono cellulare in modo tale che la lente in più è direttamente in contatto con il telefono cellulare fotocamera.
- Utilizzare l'interruttore per il sequestro conservativo per accendere il LED.
- Collegare il microfluidic canale per la pompa a siringa e consegnare il campione di liquido nel dispositivo microfluidico ad una portata costante.
- Cattura un filmato delle cellule fluorescenti / particelle che attraversano il canale microfluidica utilizzando la modalità video del telefono cellulare fotocamera.
B. Preparazione del campione
4. Preparazione di Micro-particelle fluorescenti Campioni
- Perline fluorescenti con diametro di 10 micron (perline rosse: prodotto # F8834 eccitazione / emissione 580nm/605nm, perline verdi: prodotti # F8836: eccitazione / emissione 505nm/515nm) vengono acquistati da Invitrogen (Carlsbad, CA).
- Miscelare 10 ml di perline verdi fluorescenti, 10 microlitri di rosso perline fluorescenti con 40 ml di acqua deionizzata.
- Place10 pl di questa miscela tallone su un vetrino utilizzando una micropipetta e mettere un altro vetrino sulla parte superiore di esso per realizzare una struttura a sandwich.
- Inserisci questa struttura a sandwich nel cassetto campione e farla scorrere nel telefono cellulare attaccamento.
5. Preparazione del marcato in modo fluorescente globuli bianchi
- Prendere SYTO16 acido nucleico fluorescente etichettatura kit (# S7578, Life Technology) e tampone fosfato salino (PBS) fuori dal frigorifero e portarli a temperatura ambiente.
- Trasferire 200 microlitri campione di sangue intero da provetta di raccolta del sangue con EDTA a 1,5 ml tubetto polistirolo (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Aggiungere 1 ml di tampone di globuli rossi lisante (# R7757, Sigma-Aldrich) per il campione di 200 pl di sangue intero e mescolare accuratamente.
- Dopo 5 min, centrifugare il campione lisato sangue e rimuovere la soluzione surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule bianche del sangue in 200 microlitri di buffer PBS e mescolare delicatamente.
- Aggiungere 5 l 1 mM SYTO16 soluzione del campione di globuli bianchi. Avvolgere il campione con un foglio di alluminio e incubare in ambiente buio per ~ 30 min.
- Centrifugare il campione di nuovo. Surnatante viene rimosso e l'etichetta bianca del sangue pellet cellulare è ri-Sospese in PBS.
- Microlitri 5-10 etichettato bianco cella campione sangue liquido ad un vetrino, e posizionare un foglio secondo coperchio sulla parte superiore del campione.
- Inserire la diapositiva campione inserita nel vassoio di campione e l'immagine utilizzando il telefono cellulare microscopio a fluorescenza.
In alternativa
- Continuamente consegnare le cellule bianche del sangue fluorescente etichettati attraverso un canale microfluidica utilizzando una pompa siringa automatica, ma anche di acquisizione di un filmato fluorescente microscopica delle cellule che scorrono con il telefono cellulare fotocamera in modalità video. È necessario inoltre sottolineare che una pompa a siringa portatile alimentato a batteria o anche forza di gravità può essere utilizzato per guidare il flusso attraverso il canale microfluidico.
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Representative Results
Con il nostro opto-fluidico di pompaggio / eccitazione schema (figure 1C e 1D), le cellule marcate fluorescente può essere continuamente consegnato nel canale microfluidica utilizzando una pompa a siringa, mentre il telefono cellulare fotocamera registra una time-lapse film fluorescente microscopica delle cellule che scorre. Questi film fluorescenti possono essere rapidamente analizzati utilizzando contorno rilevamento e algoritmi di monitoraggio 14,15 per determinare automaticamente il numero assoluto e la densità delle cellule che scorre attraverso i canali microfluidici, prendendo la funzione di imaging a fluorescenza flusso citometro. Basato sulla piattaforma sopra descritta (1C e 1D figure) e di protocolli di preparazione dei campioni, abbiamo dimostrato conteggio preciso del totale bianco-alle cellule del sangue (globuli bianchi) in campioni di sangue umano, giungere a risultati comparabili nei confronti di un analizzatore ematologico standard di 14. In alternativa, possiamo anche Image cellule fluorescenti / particellein modalità statica, 13 in modo tale che, senza alcun flusso fluidico, ottenendo un grande campione campo di vista per esempio ~ 81 mm 2, con una risoluzione spaziale di circa 10 um come illustrato ad esempio nelle figure 2 e 3. Fonti di aberrazione ottica possono essere ridotte utilizzando un sistema di lenti più complesso. In alternativa, può anche essere parzialmente corretta attraverso l'elaborazione di immagini digitali per caratterizzare la fonte dell'aberrazione e loro modelli spaziali.
Figura 1. (A) Rappresentazione schematica e (B) l'immagine di un telefono cellulare a base di ampio campo di microscopio a fluorescenza. 13 (C) Rappresentazione schematica e (D)immagine di un telefono cellulare basato citometro flusso di immagini 14. Clicca qui per ingrandire la figura .
. Figura 2 Le prestazioni del nostro telefono cellulare basato su microscopio a fluorescenza 13 è caratterizzata da immagini perline fluorescenti (10 micron di diametro perle verdi e rosso, rosso di eccitazione tallone / emissione: 580 nm nm/605, verde eccitazione tallone: 505 nm nm/515 ). Una qualità d'immagine decente è ottenuta su un campo di vista di ~ 81 mm 2, vedere (A, B, C). Verso i bordi di questo centrale campo di vista, ci sono regioni aberrati, si veda ad esempio (DE).
Figura 3 Immagine Top:. Telefoni cellulari immagini di contrassegnati in modo fluorescente globuli bianchi 13 (A-1):. Zoom digitale telefono cellulare immagine di fluorescenza marcate globuli bianchi tagliati dall'immagine in alto. (A-2): compressione risulta decodifica 18 per il telefono cellulare immagine mostrato in (A-1). (A-3): Convenzionale microscopio a fluorescenza (obiettivo 10X, NA = 0.25) immagine confronto dello stesso campo di vista.
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Discussion
Abbiamo presentato i nostri risultati recenti sul telefono cellulare basato ampio campo microscopia a fluorescenza e opto-fluidici citometria a flusso di immagini utilizzando leggeri e compatti opto-fluidici allegati a telefoni cellulari fotocamere. Grazie a questa tecnologia piattaforma abbiamo ripreso oggetti fluorescenti incluse micro-particelle ed etichettati globuli bianchi in campioni di sangue intero. Pertanto, questo compatto ed economico cellulare set di strumenti basati imaging a fluorescenza può essere utile per point-of-care la diagnosi, in particolare nelle regioni di risorse limitate per combattere vari problemi di salute globali, quali il monitoraggio dei pazienti HIV + per i loro linfociti T CD4 + conta .
Oltre analisi di fluidi corporei, lo stesso cellulare basata opto-fluidico citometria piattaforma può anche essere utile per altre esigenze di rilevamento come la quantificazione di immunosaggi fluorescenti per esempio: monitoraggio di acqua / qualità alimentare in risorse limitate. A questo fine, abbiamo di recente demonstrated sensibile, specifiche di individuazione e rapida di Escherichia coli O157: H7 (E. coli) in campioni di acqua e il latte usando la stessa opto-fluidico cellulare allegato 16. Abbiamo utilizzato superficie funzionalizzata capillari di vetro in modo specifico e sensibile catturare E. particelle coli in campioni di liquido che sono state volate attraverso ogni capillare. Questi catturato E. particelle coli sono stati ulteriormente etichettati con quantum-dot (QD) anticorpi secondari coniugati. L'emissione fluorescente da questi capillari funzionalizzata è stata quindi rilevata utilizzando l'opto-fluidico cellulare piattaforma di imaging e l'intensità di fluorescenza integrato lungo la lunghezza del capillare è stato utilizzato per stimare la densità del catturato E. coli particelle nella soluzione di destinazione. Con questo approccio opto-fluidico, abbiamo dimostrato un limite di rilevazione di ~ 5-10 CFU / ml in acqua e 16 campioni di latte.
Infine, dobbiamo notare che in base alla tegli esigenze applicative, l'ingrandimento ottico e risoluzione di questa piattaforma può essere regolato modificando f / f 2, dove f è la lunghezza focale del telefono cellulare fotocamera e 2 f è la lunghezza focale della lente esterna (Figura 1A) . Oltre al sistema di ingrandimento, si dovrebbe anche notare che il vassoio LED e il filtro associato può essere facilmente modificato per colori differenti per adattarsi a vari fluorofori o saggi anche immunocromatografici che possono essere utilizzati in applicazioni specifiche. 17
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Disclosures
Dr. Ozcan è il fondatore di una start-up che si propone di commercializzare l'imaging di calcolo e strumenti di microscopia.
Acknowledgments
A. Ozcan ringrazia il sostegno del Premio Presidenziale per Early Career Scientists and Engineers (PECASE), Army Research Office (ARO) Young Investigator Award, National Science Foundation (NSF) premio alla carriera, Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award e National Institutes of Health (NIH) Innovator Award Nuovo direttore DP2OD006427 presso l'Ufficio del Direttore, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
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