Summary
Vi gjennomgår våre nylige resultater på integrering av fluorescerende mikroskopi og bildebehandling flowcytometri verktøy på en mobiltelefon ved hjelp av kompakte og kostnadseffektive opto-fluidic vedlegg. Disse celle-telefon basert mikro-analyse-enheter kan være nyttig for cytometrisk analyse, for eksempel å utføre ulike Celletellingen oppgaver samt for high-throughput screening av f.eks vannprøver ressursanslag begrensede innstillinger.
Abstract
Fluoriserende mikroskopi og flowcytometri er mye brukt verktøy i biomedisinsk forskning og klinisk diagnose. Men disse enhetene er generelt relativt klumpete og kostbart, noe som gjør dem mindre effektive i ressursregnskapet begrensede innstillinger. Potensielt løse disse begrensningene, har vi nylig demonstrert integreringen av wide-feltet fluoriserende mikroskopi og bildebehandling flowcytometri verktøy på mobiltelefoner ved hjelp av kompakte, lette, og kostnadseffektive opto-fluidic vedlegg. I vår strømningscytometri motivet, blir fluorescensmerkede cellene flushet gjennom en microfluidic kanal som er plassert over den eksisterende mobiltelefon kameraenheten. Batteridrevne lysdioder (LED) er butt-koplet til den side av denne microfluidic chip, som effektivt virker som en multi-modus skive bølgeleder, hvor magnetiseringsstrømmen lyset ledes til jevnt eksitere fluorescerende mål. Den mobiltelefon kamera registrerer en tid lapse film av fluorescerende celler som strømmer gjennommicrofluidic kanalen hvor de digitale rammer denne filmen blir behandlet for å telle antall av de merkede celler innenfor målet løsning av interesse. Ved hjelp av en lignende opto-fluidic design, kan vi også bilde disse fluorescently merkede celler i statisk modus ved f.eks sandwiching fluorescerende partikler mellom to glassplater og fange deres fluorescerende bilder ved hjelp av mobiltelefonen kamera, som kan gi en romlig oppløsning på f.eks ~ 10 mm over en svært stort felt-of-view av ~ 81 mm 2. Dette mobiltelefon basert fluoriserende bildebehandling flowcytometri og mikroskopi plattform kan være nyttig, spesielt i ressurs begrensede innstillinger, for eksempel telling av CD4 + T celler mot overvåking av HIV + pasienter eller for påvisning av vannbårne parasitter i drikkevannet.
Introduction
Mikroskopi og flow-cytometri er mye brukt teknikker 1-12 i biomedisinsk og vitenskapelig forskning, samt klinisk diagnose for telling og karakterisering av ulike celletyper. Men konvensjonelle mikroskoper og flow-cytometri instrumenter er relativt komplisert og dyrt, noe som begrenser bruken til hovedsakelig veletablerte sentrale laboratorier. Nylig har vi utviklet en kompakt og lett fluoriserende bildebehandling cytometri og mikroskopi enhet integrert på en mobiltelefon, 13,14 som viser løfte om å kostnadseffektivt oversette fluoriserende mikroskopi, flow-cytometri og relaterte mikro-analyseteknikker til ressurs-begrensede miljøer for ulike telemedisinske applikasjoner påvirker global helse.
I optofluidic flow-cytometri konfigurasjon (se f.eks figur 1C og 1D), er en spesialdesignet polydimethysiloxane (PDMS) basert microfluidic kanal positioned foran mobiltelefonen kamera-enhet, der lysemitterende-dioder (LED) er butt-koplet til kantene av kanalen. Dette microfluidic chip, sammen med den flytende prøve inne, danner en opto-fluidic planar bølgeleder (sammensatt av f.eks PDMS-væske-PDMS) slik at magnetiseringsstrømmen lyset ledes til jevnt pumpe fluorescerende merket prøvene inne i mikro-kanal. Fluorescensemisjonen fra disse merkede objekter, for eksempel celler, er ytterligere avbildes gjennom en ekstra linse plassert rett etter mobiltelefonen kamera-enhet og er kartlagt på mobiltelefonen Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) bildesensorer. Siden fluorescensemisjonen samles vinkelrett på eksitasjon lysbanen, er en billig plast absorpsjon filteret tilstrekkelig til å fjerne det spredte magnetisering lys og kan gi en anstendig mørke-feltet bakgrunn kreves for fluoriserende avbildning. Ved hjelp av en lignende opto-fluidic design, kan vi også bilde fluorescerende objekter i static-modus (se figur 1A og 1B), hvor det fluorescerende partikler blir klemt mellom to glassplater i stedet for å renne gjennom en microfluidic kanal og fluorescensemisjonen fra disse fluorescerende partiklene fanges opp av mobiltelefonen CMOS bildesensor for partikkeltelling og karakterisering. Basert på ulike krav til søknaden, flowcytometri eller wide-feltet fluoriserende mikroskopi kan velges. For eksempel, kunne celle-telefon flowcytometri enheten være spesielt nyttig for screening av store mengder væskeprøver (f.eks noen ml) for påvisning av sjeldne celler eller patogener.
I dette manuskriptet gjennomgår vi noen av våre nylige resultater på integrering av fluorescerende mikroskopi og bildebehandling flowcytometri verktøy på en mobiltelefon ved hjelp av kompakte og kostnadseffektive opto-fluidic vedlegg. Disse mobiltelefon-baserte mikro-analyse, bildebehandling cytometri og sensing plattformer kan tilby ulike muligheterfor telemedisin og point-of-care diagnostikk, spesielt påvirker vår kamp mot globale helseutfordringer i ressurs begrensede deler av verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne delen, introduserer vi de eksperimentelle protokoller for vår mobiltelefon basert wide-feltet fluorescens mikroskopi 13 og opto-fluidic bildebehandling cytometri plattform 14. Vi vil bruke fluorescerende perler og fluorescensmerkede hvite blodceller til å teste disse bildebehandling plattformer.
A. Forberedelse av Cell-telefon basert Wide-field fluoriserende mikroskop og Opto-fluidic Imaging flowcytometeret
Celle-telefon basert wide-feltet fluoriserende mikroskop eller flowcytometeret består av to hoveddeler: en kameratelefon og en kompakt opto-fluidic add-on vedlegg.
1. Kameratelefon
Mens de presenterte teknikkene gjelder for nesten alle kameratelefon, har vi valgt Sony Erickson Aino som base for disse enhetene. Dette mobiltelefon har en ~ 8 megapiksel RGB CMOS-sensor installert på den og en innebygd linse som har en brennvidde (f 1) av ~ 4,65 mm. 2. Opto-fluidic Attachment for Wide-field Fluorescent Mikroskopi
Den optiske vedlegget er utformet av Autodesk og er trykket av en Dimension Elite 3-D skriver ved hjelp ABSplus termoplastisk materiale. I denne trykkeprosessen blir modell og støtte materialer varmes i en ekstrudering hodet i skriveren og avsettes lagvis på en modellering base. Når dette trinnet er fullført, kan den bærende materiale oppløses, og etterlater en robust 3D-modell av den ønskede prototypen optiske feste design består av lysdioder (senterbølgelengde på ~ 470 nm, Digikey), en plast filter (# NT54-46, Edmund optikk), en prøve skuffen, og en plano-konveks f 2 objektiv = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Alle lysene og plast filtre kan enkelt endres basert på fluoroforer 'spektra. Trinnene for sammenstillingen av denne opto-fluidic vedlegg inkluderer:
- Plasser linsen i vedlegget innenfor sine spesifikke objektivet holder stillingen.
- Plasser plast filter på filter og skyv den inn i vedlegget, eller tape plasten filter foran mobiltelefon kameralinsen.
- Sett LED skuffen inn i vedlegget.
- Plasser prøven glassplater inn i prøven skuffen. Skyv prøven skuffen inn i vedlegget. Face lampene mot prøven.
- Clip fiksturen på mobiltelefonen, slik at den ekstra linsen er direkte i kontakt med mobiltelefon kameralinsen.
- Bruk bryteren på vedlegget for å slå på lysene.
- Bilde utvalget av interesse med mobiltelefonen kamera enheten med sin "nattmodus".
3. Opto-fluidic Feste for Fluorescent Imaging cytometri
Når det er behov for å screene store volumer av flytende prøver for påvisning av sjeldne hendelser, kunne optofluidic strømningscytometri enheten bli foretrukket. Vi kan endre våre brede feltet fluoriserende mikroskop design og konvertere den til et flowcytometer, wher en PDMS baserte microfluidic kanal brukes til å kontinuerlig levere væskeprøven gjennom bildebehandling volum. Den optiske vedlegget er også designet av Autodesk og skrives ut av Dimension Elite 3-D skriver. Den består også av lysdioder (senterbølgelengde på ~ 470 nm, Digikey), en plast filter (# NT54-46, Edmund Optics), en prøve skuffen, og en asfærisk linse (f = 4,5 mm) (produkt # C230TME-A; Thorlab). Trinnene for sammenstillingen av denne opto-fluidic vedlegg inkluderer:
- Plasser asfærisk linse i vedlegget.
- Plasser plast filter på filter og skyv den inn i vedlegget, eller tape plasten filter foran cellphone kameralinsen.
- Skyv microfluidic kanal i samme opto-fluidic vedlegg.
- Clip fiksturen på mobiltelefonen slik at den ekstra linsen er direkte i kontakt med mobiltelefon kameralinsen.
- Bruk bryteren på vedlegget for å slå på lysene.
- Koble microfluidic kanal til sprøytepumpen og levere væskeprøven inn microfluidic enheten ved en konstant strømningshastighet.
- Fange en film av de fluorescerende celler / partikler som strømmer gjennom microfluidic kanal med videomodus av mobiltelefon-kamera.
B. Prøvepreparering
4. Utarbeidelse av Fluorescent Micro-partikkel Samples
- Fluorescerende perler med 10 mikrometer diameter (røde perler: Produktet # F8834 eksitasjon / utslipp 580nm/605nm, grønne perler: Produktet # F8836: eksitasjon / utslipp 505nm/515nm) kjøpes fra Invitrogen (Carlsbad, California).
- Bland 10 ul av grønne fluorescerende perler, 10 pl av røde fluorescerende perler med 40 pl av DI-vann.
- Place10 pl av denne perle blandingen på en glass-slide ved hjelp av en mikropipette og sette en annen glass-slide på toppen av den til å gjøre en sandwich-struktur.
- Sett denne sandwich struktur i prøven og skyv den inn i mobiltelefonen vedlegg.
5. Utarbeidelse av fluorescensmerkede White Blood Cells
- Ta SYTO16 nukleinsyre fluorescerende merking kit (# S7578, Liv Technology) og fosfatbufret saltløsning (PBS) ut fra kjøleskapet og bringe dem til romtemperatur.
- Overfør 200 ul fullblodsprøve fra EDTA blodprøverør til 1,5 ml polystyren tube (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Tilsett 1 ml røde blodceller lysebuffer (# R7757, Sigma-Aldrich) i 200 ul fullblodsprøve og bland grundig.
- Etter 5 min, sentrifuger lyserte blodprøven og fjern den overliggende oppløsning.
- Resuspender hvite blodlegemer pellet i 200 ul PBS buffer og forsiktig bland dem.
- Tilsett 5 pl 1 mM SYTO16 løsning på hvite blodlegemer prøven. Pakk prøven med aluminiumsfolie og inkuber i mørke omgivelser for ~ 30 min.
- Sentrifuger prøven på nytt. Supernatanten fjernes, og den merkede hvite blodceller pelleten re-Suspendert i PBS buffer.
- Plasser 5-10 pl merket hvite blodlegemer væskeprøve i et dekkglass, og plassere en andre dekkglass på toppen av prøven.
- Sett klemt prøven glir inn prøven skuffen og bilde den ved hjelp av mobiltelefonen fluorescerende mikroskop.
Alternativt
- Stadig levere fluorescensmerkede hvite blodlegemer gjennom en microfluidic kanal med en automatisert sprøytepumpe, samtidig fange en fluorescerende mikroskopisk film av rennende celler ved hjelp av mobiltelefonen kameraet i videomodus. Vi bør også understrekes at en bærbar batteridrevet sprøytepumpe eller tyngdekraften kan utnyttes til å drive strøm gjennom microfluidic kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med vår opto-fluidic pumping / eksitasjon ordningen (Tall 1C og 1D), kan fluorescensmerkede celler kontinuerlig levert inn microfluidic kanal med en sprøyte pumpe mens mobiltelefonen kamera registrerer en time-lapse fluorescerende mikroskopisk film av rennende celler. Disse fluorescerende filmer kan deretter raskt analysert ved hjelp kontur-deteksjon og sporing algoritmer 14,15 automatisk bestemme det absolutte antallet og tettheten av cellene strømmer gjennom microfluidic kanaler, tar funksjonen av en fluorescerende avbildning flyt-cytometer. Basert på ovennevnte beskrevet plattform (Tall 1C og 1D) og prøveopparbeidelse protokoller, viste vi nøyaktig telling av totalt hvite blod-celler (WBCs) i humane blodprøver, oppnå sammenlignbare resultater mot en standard hematologimaskin. 14 Alternativt kan vi også bilde fluorescerende celler / partikleri statisk modus, 13 slik at uten fluidic flyt, oppnå en meget stor prøve felt-av-visning av f.eks ~ 81 mm 2 med en romlig oppløsning på ~ 10 mikrometer som illustrert i f.eks figur 2 og 3. Kilder til optiske aberrasjon kan reduseres ved å utforme et mer komplekst linsesystem. Alternativt kan det også være delvis korrigeres gjennom digital bildebehandling ved å karakterisere kilden til aberrasjon og deres romlige mønstre.
Figur 1. (A) Skjematisk illustrasjon og (B) bilde av en celle-telefon-baserte bred-felt fluorescerende mikroskop. 13 (C) Skjematisk illustrasjon og (D)bilde av en mobiltelefon basert bildebehandling strømningscytometer. 14 Klikk her for å se større figur .
. Figur 2 resultatene av vår mobiltelefon basert fluorescerende mikroskop 13 er preget av tenkelig fluorescerende perler (10 mikrometer i diameter grønne og røde perler, rød perle eksitasjon / utslipp: 580 nm/605 nm, grønn perle eksitasjon: 505 nm/515 nm ). En anstendig bildekvalitet oppnås over et felt-of-view av ~ 81 mm 2, se (A, B, C). Mot kantene av denne sentrale felt-of-view, er det Aberrert regioner, se for eksempel (DE).
Figur 3 Top image:. Mobiltelefonnumre bilder av fluorescensmerkede hvite blodlegemer 13 (A-1):. Digitalt zoomet mobiltelefon bilde av fluorescensmerkede hvite blodceller beskjæres fra toppen bildet. (A-2): Trykkfasthet dekoding resulterer 18 for mobiltelefonen bilde vist i (A-1). (A-3): Konvensjonell fluorescerende mikroskop (10X objektiv, NA = 0,25) sammenligning bilde av det samme synsfelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presentert våre nylige resultater på mobiltelefon basert wide-feltet fluoriserende mikroskopi og opto-fluidic bildebehandling flowcytometri ved hjelp av lys-vekt og kompakte opto-fluidic vedlegg til celle-telefonen kameraer. Ved hjelp av denne teknologien vi fotografert fluorescerende objekter, inkludert mikro-partikler og merket hvite blodceller i fullblodsprøver. Derfor kan denne kompakte og kostnadseffektive mobiltelefon basert fluoriserende bildebehandling verktøysett være nyttig for point-of-care diagnose, særlig i ressurs begrenset regioner for å bekjempe ulike globale helseproblemer, som for eksempel overvåking av HIV + pasienter for deres CD4 + T-lymfocytter teller .
Foruten analyse av kroppsvæsker, samme celle-telefon-baserte opto-fluidic cytometri plattform kan også være nyttig for andre sensorbehov eksempel kvantifisering av fluorescerende immunoanalyser for f.eks overvåking av vann / mat kvalitet i ressurs-begrensede innstillinger. Mot dette målet, har vi nylig demonstrated sensitiv, spesifikk og rask påvisning av Escherichia coli O157: H7 (E. coli) i vann og melk prøver å bruke samme opto-fluidic mobiltelefon vedlegg 16. Vi utnyttet overflaten funksjonalisert glass kapillærer spesifikt og følsomt fange E. coli partikler i væskeprøver som ble fløyet gjennom hver kapillær. Disse fanget E. coli partiklene ble ytterligere merket med kvante-dot (QD) konjugerte sekundære antistoffer. Fluorescensemisjonen fra disse funksjonaliserte kapillærer ble så detektert ved hjelp av opto-fluidic mobiltelefon bildebehandling plattform og den integrerte fluorescensintensiteten langs kapillær lengden ble benyttet for å estimere tettheten av fanget E. coli partikler i målet løsningen. Med denne opto-fluidic tilnærming, viste vi en deteksjonsgrense av ~ 5-10 CFU / ml i både vann og melkeprøver 16.
Til slutt bør vi merke oss at avhengig than bruksbehov, kan den optiske forstørrelse og løsning av denne plattformen være innstilt ved å endre f / f 2, hvor f er brennvidden av mobiltelefonen kameralinsen og f 2 er brennvidden av den eksterne linse (figur 1A) . I tillegg til system forstørrelse, skal også vi være oppmerksom på at LED skuffen og tilhørende filter kan enkelt endres til forskjellige farger for å tilrettelegge for ulike fluoroforer eller enda immunochromatographic analyser som kan brukes i spesifikke applikasjoner. 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Ozcan er grunnleggeren av en start-up selskap som tar sikte på å kommersialisere beregningsorientert bildebehandling og mikroskopi verktøy.
Acknowledgments
A. Ozcan er takknemlige for støtten fra Presidential Early Career Award for forskere og ingeniører (PECASE), Army Research Office (ARO) Young Investigator Award, National Science Foundation (NSF) KARRIERE Award, Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award og National Institutes of Health (NIH) regissørens New Innovator Award DP2OD006427 fra Office of Director, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
- Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
- Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
- Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
- Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
- Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
- Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
- Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
- Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
- Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
- Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
- Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
- Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
- Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).
