Summary
Nosotros revisamos nuestros resultados recientes sobre la integración de la microscopía fluorescente y herramientas de imágenes de citometría de flujo en un teléfono celular usando compactas y económicas-opto-fluídicos archivos adjuntos. Estos teléfono móvil basado micro-análisis de dispositivos podría ser útil para el análisis de citometría, tal como realizar diversas tareas de recuento de células, así como para el cribado de alto rendimiento de muestras de agua, por ejemplo, en entornos con recursos limitados.
Abstract
Microscopía de fluorescencia y citometría de flujo se utilizan ampliamente herramientas en la investigación biomédica y el diagnóstico clínico. Sin embargo, estos dispositivos son, en general, relativamente voluminoso y costoso, que los hace menos eficaz en los entornos con recursos limitados. Para hacer frente a estas limitaciones potenciales, hemos demostrado recientemente la integración de gran campo microscopía de fluorescencia y citometría de flujo de las herramientas de imágenes en teléfonos celulares utilizando compacto, ligero y rentable adjuntos opto-fluidos. En nuestro diseño citometría flujo, las células marcadas fluorescentemente se vacían a través de un canal microfluídico que se coloca por encima de la unidad de la cámara existente teléfono móvil. Alimentado por batería diodos emisores de luz (LED) son a tope acoplado al lado de este chip microfluídico, que actúa eficazmente como una guía de ondas de losa multi-modo, donde se guía la luz de excitación para excitar uniformemente los objetivos fluorescentes. La cámara del teléfono móvil registra una película de lapso de tiempo de las células fluorescentes que fluyen a travésel canal microfluídico, donde las tramas digitales de esta película se procesan para contar el número de las células marcadas dentro de la solución diana de interés. El uso de un semejante opto-fluídico diseño, también puede imagen estas células marcadas fluorescentemente en modo estático por ejemplo intercalando las partículas fluorescentes entre dos portaobjetos de vidrio y la captura de sus imágenes de fluorescencia utilizando la cámara del teléfono móvil, que puede alcanzar una resolución espacial de por ejemplo ~ 10 micras más de un muy gran campo de visión de ~ 81 mm 2. Este teléfono móvil basado citometría de flujo fluorescente de imágenes y microscopía plataforma podría ser útil especialmente en entornos con recursos limitados, por ejemplo, el recuento de células T CD4 + hacia el seguimiento de pacientes VIH + o para la detección de parásitos transmitidos por el agua en el agua potable.
Introduction
Microscopía y citometría flujo se usan ampliamente técnicas de 1-12 en la investigación biomédica y científica así como de diagnóstico clínico para conteo y caracterización de diversos tipos de células. Sin embargo, los microscopios convencionales y los instrumentos de citometría de flujo son relativamente complejos y costosos, lo que limita su uso a principalmente bien establecidos laboratorios centrales. Recientemente hemos desarrollado una citometría de imagen fluorescente compacto y ligero y el dispositivo de microscopía integrado en un teléfono celular, 13,14 lo que demuestra promesa rentable traducir microscopía fluorescente, citometría de flujo y técnicas relacionadas con micro-análisis para entornos con recursos limitados para diversas aplicaciones de telemedicina que afectan la salud mundial.
En el optofluidic citometría de flujo de configuración (ver Figura 1C y 1D por ejemplo), un diseño personalizado polidimetilsiloxano (PDMS) canal de microfluidos basada es positioned delante del teléfono móvil con cámara y unidad, donde emisores de luz-diodos (LED) están a tope acoplados a los bordes del canal. Este chip microfluídico, junto con el interior de la muestra líquida, forma una guía de onda planar opto-fluídico (por ejemplo compuesto de PDMS-líquido-PDMS) de tal manera que la luz de excitación se guía a bombear de manera uniforme los especímenes fluorescentes marcadas dentro de la micro-canal. La emisión de fluorescencia de estos objetos etiquetados, por ejemplo, pilas, se ve reflejado a través de una lente adicional colocado justo después de que el teléfono móvil con cámara y unidad y se mapea en el teléfono móvil Complementary Metal-Oxido-Semiconductor sensor de imagen (CMOS). Dado que la emisión fluorescente se recoge perpendicular a la trayectoria de la luz de excitación, un filtro de absorción de plástico barato es suficiente para eliminar la luz de excitación dispersa y puede proporcionar un decente de campo oscuro de fondo requerida para imágenes fluorescentes. El uso de un semejante opto-fluídico diseño, también puede imagen los objetos fluorescentes en static modo (véase la Figura 1A y 1B), en la que las partículas fluorescentes se intercala entre dos portaobjetos de vidrio en lugar de fluir a través de un canal microfluídico y la emisión fluorescente desde estas partículas fluorescentes son capturados por el sensor de imagen CMOS de teléfono celular para el recuento de partículas y caracterización. En base a distintos requisitos de aplicación, citometría de flujo o microscopía de campo amplio fluorescente puede ser elegido. Por ejemplo, teléfono celular dispositivo de citometría de flujo podría ser especialmente útil para el cribado de grandes volúmenes de muestras líquidas (por ejemplo, unos pocos ml) para la detección de células raras o patógenos.
En este manuscrito se revisan algunos de nuestros resultados recientes sobre la integración de la microscopía fluorescente y herramientas de imágenes de citometría de flujo en un teléfono celular usando compactas y económicas-opto-fluídicos archivos adjuntos. Estos teléfonos celulares basados en micro-análisis, citometría de imagen y plataformas de sensores podría ofrecer oportunidades diversaspara el diagnóstico de telemedicina y puntos de atención, en especial impacto en nuestra lucha contra los problemas mundiales de salud en regiones de recursos limitados del mundo.
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Protocol
En esta sección, presentamos los protocolos experimentales para nuestro teléfono móvil basado de campo amplio microscopía de fluorescencia 13 y opto-plataforma fluídica citometría de imagen 14. Usaremos perlas fluorescentes y marcados con fluorescencia células blancas de la sangre para probar estas plataformas de diagnóstico por imágenes.
A. Preparación del teléfono móvil basado Wide-field microscopio de fluorescencia y Opto-fluídico citómetro de flujo de imágenes
El teléfono móvil basado de campo amplio microscopio de fluorescencia o citómetro de flujo se compone de dos partes principales: un teléfono con cámara y un compacto opto-fluídico add-on fijación.
1. El teléfono con cámara
Mientras que las técnicas presentadas son aplicables a casi cualquier teléfono con cámara, hemos optado por Sony Erickson Aino como base para estos dispositivos. Este teléfono móvil cuenta con un ~ 8 megapíxeles sensor RGB CMOS instalado en él y una lente incorporada que tiene una longitud focal (f 1) de ~ 4,65 mm. 2. Opto-fluido de montaje para Wide-field Microscopía Fluorescente
El accesorio óptico está diseñado por Autodesk y se imprime una dimensión Elite impresora 3-D con material termoplástico ABSplus. En este proceso de impresión, los materiales de modelo y el soporte se calienta en un cabezal de extrusión dentro de la impresora y se depositan capa a capa sobre una base de modelado. Cuando se complete este paso, el material de soporte puede ser disuelto, dejando un sólido modelo 3D del prototipo deseado Nuestro diseño de acoplamiento óptico se compone de LEDs (centro de longitud de onda a ~ 470 nm, Digikey), un filtro de plástico (# NT54-46, Edmund Óptica), una bandeja de muestra, y una lente plano-convexa f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Todos los LEDs y los filtros de plástico se pueden cambiar fácilmente sobre la base de los espectros de los fluoróforos. Los pasos para montar este accesorio opto-fluídico son:
- Coloque la lente en el accesorio en su posición específica soporte de la lente.
- Coloque el filtro de plástico en la bandeja de filtro y deslícelo en el archivo adjunto, o cinta de plástico del filtro delante de la lente de la cámara del teléfono móvil.
- Inserte la bandeja de LED en el archivo adjunto.
- Colocar los portaobjetos de muestra de vidrio en la bandeja de muestra. Deslice la bandeja de la muestra en el archivo adjunto. Frente a los LEDs hacia la muestra.
- Sujete el accesorio sobre el teléfono móvil, de manera que la lente adicional está directamente en contacto con la lente de la cámara del teléfono móvil.
- Con el interruptor en el archivo adjunto para encender el LED.
- Imagen de la muestra de interés con la unidad de la cámara del teléfono móvil con su "modo noche".
3. Opto-fluido de montaje para citometría de imagen fluorescente
Cuando hay una necesidad de examinar grandes volúmenes de muestras líquidas para la detección de eventos raros, dispositivo optofluidic citometría de flujo podría ser preferido. Podemos modificar nuestro campo amplio diseño microscopio fluorescente y lo convierten en un citómetro de flujo, waquí un canal microfluídico basado PDMS son utilizados para entregar continuamente la muestra de líquido a través del volumen de formación de imágenes. El accesorio óptico también está diseñado por Autodesk e impreso por la impresora Dimension Elite 3-D. También consta de LEDs (longitud de onda central en ~ 470 nm, Digikey), un filtro de plástico (# NT54-46, Edmund Optics), una bandeja de muestras, y una lente asférica (f = 4,5 mm) (producto # C230TME-A; Thorlab). Los pasos para montar este accesorio opto-fluídico son:
- Coloque el lente asférica en el archivo adjunto.
- Coloque el filtro de plástico en la bandeja de filtro y deslícelo en el archivo adjunto, o cinta de plástico del filtro delante de la lente de la cámara móvil.
- Deslice el canal de microfluidos en el mismo opto-fluídico archivo adjunto.
- Sujete el accesorio sobre el teléfono móvil de manera que la lente adicional está directamente en contacto con la lente de la cámara del teléfono móvil.
- Con el interruptor en el archivo adjunto para encender el LED.
- Conecte el microfluidoic canal de la bomba de jeringa y entregar la muestra líquida en el dispositivo microfluídico a un caudal constante.
- Capturar una película de las células fluorescentes / partículas que fluyen a través del canal de microfluidos con el modo de vídeo de la cámara del teléfono móvil.
B. Preparación de la Muestra
4. Preparación de partículas fluorescentes Micro-Muestras
- Perlas fluorescentes con m de diámetro 10 (cuentas rojas: producto # F8834 excitación / emisión 580nm/605nm; granos verdes: Producto #: F8836 excitación / emisión 505nm/515nm) se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA).
- Mezclar 10 l de perlas fluorescentes verdes, 10 l de perlas fluorescentes rojas con 40 l de agua DI.
- Place10 l de esta mezcla de glóbulos sobre un portaobjetos de vidrio utilizando una micropipeta y se puso otra placa de vidrio sobre la parte superior de la misma para hacer una estructura de sándwich.
- Insertar esta estructura sándwich en la bandeja de muestras y deslícela en la adhesión celular móvil.
5. Preparación de la etiqueta fluorescente glóbulos blancos
- Tome SYTO16 ácido nucleico fluorescente kit de etiquetado (# S7578, Life Technology) y tampón fosfato salino (PBS) fuera de la nevera y llevarlos a temperatura ambiente.
- Transferir 200 l de muestra de sangre completa de EDTA tubo de recogida de sangre de 1,5 ml tubo de poliestireno (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Añadir 1 ml de tampón de células de sangre roja de lisis (# R7757, Sigma-Aldrich) a la muestra de 200 l de sangre entera y se mezcla a fondo.
- Después de 5 min, se centrifuga la muestra de sangre lisada y eliminar la solución sobrenadante.
- Resuspender el pellet de células blancas de la sangre en 200 l de tampón PBS y suavemente mezclarlos.
- Añadir 5 l 1 mM SYTO16 solución a la muestra de glóbulos blancos. Envolver la muestra con papel de aluminio e incubar en un ambiente oscuro durante ~ 30 min.
- Se centrifuga la muestra otra vez. El sobrenadante se eliminó y el etiquetado de glóbulos blancos pellet se reA poner en suspensión en tampón PBS.
- Coloque l 5-10 etiqueta de glóbulos blancos Se muestra de líquido a una hoja de cubierta, y colocar un cubreobjetos de un segundo en la parte superior de la muestra.
- Insertar el portaobjetos de la muestra intercalada en la bandeja de muestras y la imagen utilizando el microscopio de teléfono celular fluorescente.
Alternativamente
- Continuamente entregar las células marcadas fluorescentemente blancas de la sangre a través de un canal de microfluidos con una bomba de jeringa automatizada, mientras que también la captura de una película fluorescente microscópica de las células que fluyen con la cámara del teléfono móvil en modo de vídeo. También debemos destacar que una bomba de jeringa batería portátil alimentado por la fuerza de gravedad o incluso puede ser utilizado para conducir el flujo a través del canal microfluídico.
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Representative Results
Con nuestro opto-fluídico de bombeo / esquema de excitación (Figuras 1C y 1D), las células marcadas con fluorescencia puede ser continuamente entregado en el canal microfluídico utilizando una bomba de jeringa mientras que la cámara del teléfono móvil registra un tiempo de intervalo fluorescente microscópica de las células que fluyen. Estas películas fluorescentes pueden entonces ser rápidamente analizados mediante detección de contornos y algoritmos de seguimiento 14,15 para determinar automáticamente el número absoluto y la densidad de las células que fluyen a través de los canales microfluídicos, teniendo la función de una imagen fluorescente de flujo citómetro. Basado en la plataforma descrita anteriormente (figuras 1C y 1D) y los protocolos de preparación de muestras, hemos demostrado recuento preciso de blanco total-sangre-células (glóbulos blancos) en muestras de sangre humana, obtener resultados comparables en contra de un analizador de hematología estándar. 14 Alternativamente, se puede también la imagen de las células fluorescentes / partículasen el modo estático, 13 de tal manera que sin flujo de fluido, el logro de una muy amplia de muestras de campo de visión de 81 mm por ejemplo, ~ 2 con una resolución espacial de ~ 10 micras como se ilustra en las Figuras 2 y 3 por ejemplo. Fuentes de aberración óptica puede ser reducida mediante el diseño de un sistema de lentes más complejo. Alternativamente, también puede corregirse parcialmente a través de procesamiento de imagen digital mediante la caracterización de la fuente de la aberración y sus patrones espaciales.
Figura 1. (A) Ilustración esquemática y (B) la imagen de un teléfono móvil basado en gran campo microscopio de fluorescencia. 13 (C) Ilustración esquemática y (D)imagen de un teléfono celular citómetro de flujo basado en imágenes. 14 Haga clic aquí para ampliar la cifra .
. Figura 2 El rendimiento de nuestro teléfono móvil basado en microscopio fluorescente 13 se caracteriza por granos de imágenes fluorescentes (10 m de diámetro bolas verdes y rojas, rojo perla excitación / emisión: 580 nm/605 nm, excitación grano verde: 505 nm/515 nm ). Una buena calidad de imagen se logra a través de un campo de visión de ~ 81 mm 2, ver (A, B, C). Hacia los bordes de este campo central de visión, hay regiones aberrados, véase por ejemplo (DE).
Figura 3 Imagen superior:. Teléfono celular de imágenes marcados con fluorescencia células blancas de la sangre 13 (A-1):. Ampliada digitalmente teléfono celular imagen de la etiqueta fluorescente las células blancas de la sangre recortada de la imagen superior. (A-2): la compresión de decodificación da como resultado 18 para la imagen del teléfono móvil se muestra en (A-1). (A-3): microscopio fluorescente convencional (objetivo 10X, NA = 0,25) de comparación de imágenes del mismo campo de vista.
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Discussion
Hemos presentado nuestros resultados recientes en el teléfono móvil basado de campo amplio microscopía fluorescente y opto-fluídico citometría de flujo utilizando imágenes ligero y compacto adjuntos opto-fluídicos para cámaras de teléfonos celulares. Con esta plataforma tecnológica que fotografiado objetos fluorescentes incluyendo micro-partículas y etiquetados células blancas de la sangre en las muestras de sangre total. Por lo tanto, este compacto y rentable de teléfonos celulares conjunto de herramientas basado en imágenes fluorescentes puede ser útil para el diagnóstico de punto de atención, especialmente en regiones con recursos limitados para combatir diversos problemas de salud mundiales, como el seguimiento de los pacientes VIH + por sus linfocitos T CD4 + conteos .
Además el análisis de los fluidos corporales, el mismo teléfono móvil basado en opto-fluídico plataforma de citometría también puede ser útil para otras necesidades de detección tales como la cuantificación de inmunoensayos fluorescentes para la supervisión por ejemplo de la calidad del agua / alimento en entornos con recursos limitados. Con este fin, recientemente hemos demostraciónnstrated detección sensible, específico y rápido de Escherichia coli O157: H7 (E. coli) en muestras de agua y la leche utilizando el mismo opto-fluídico teléfono móvil fijación 16. Hemos utilizado superficie funcionalizada capilares de vidrio de forma específica y sensible capturar E. partículas coli en muestras líquidas que fueron trasladados a través de cada capilar. Estos capturado E. partículas coli fueron marcados adicionalmente con puntos cuánticos (QD) conjugado con anticuerpos secundarios. La emisión fluorescente desde estos funcionalizado capilares se detectó después usando el opto-fluídico teléfono celular plataforma de imágenes y la intensidad de fluorescencia integrada a lo largo de la longitud del capilar se utilizó para estimar la densidad de la E. capturado partículas coli en la solución objetivo. Con este enfoque opto-fluídico, hemos demostrado un límite de detección de ~ 5-10 CFU / ml en agua y muestras de leche 16.
Por último, hay que señalar que en función de tque necesita la aplicación, la ampliación óptica y resolución de esta plataforma se puede ajustar mediante el cambio de f / f 2, donde f es la longitud focal de la lente de la cámara del teléfono móvil y f 2 es la longitud focal de la lente exterior (Figura 1A) . Además de aumento del sistema, también hay que señalar que la bandeja de LED y el filtro asociado puede ser cambiado fácilmente a diferentes colores para adaptarse a diferentes fluoróforos o ensayos incluso inmunocromatográficas que podrían ser utilizados en aplicaciones específicas. 17
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Disclosures
Dr. Ozcan es el fundador de una empresa de nueva creación que tiene como objetivo comercializar imágenes computacionales y herramientas de microscopía.
Acknowledgments
A. Ozcan agradece el apoyo del Premio Presidencial de Carrera Temprana para Científicos e Ingenieros (PECASE), Army Research Office (ARO) Premio al Investigador Joven, National Science Foundation (NSF) Premio a la Trayectoria de la Oficina de Investigación Naval (ONR) Premio al Investigador Joven y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Premio a la Innovación Nuevo Director DP2OD006427 de la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
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