Summary
نهج جديد يجمع بين العين وزرع المجهري متحد البؤر تمكن طولية، غير الغازية في الوقت الحقيقي التصوير مع وحيدة الخلية القرار داخل أنسجة المطعمة
Abstract
وقد برزت Intravital التصوير كأداة لا غنى عنها في مجال البحوث البيولوجية. في هذه العملية، وقد وضعت العديد من تقنيات التصوير لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في الحيوانات غير جراحية. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية في التقنية الحالية طرائق التصوير intravital هو عدم القدرة على الجمع بين غير الغازية، والتصوير الطولي مع قدرات القرار وحيدة الخلية. نعرض هنا كيف زرع في الغرفة الأمامية من العين تلتف الحد يعتد توفير منصة تنوعا التجريبية التي تمكن غير الغازية، والتصوير الطولي للقرار الخلوية في الجسم الحي. علينا أن نبرهن الإجراء زرع في الماوس وتقديم نتائج ممثل باستخدام نموذج مع أهمية سريرية، وهي جزيرة البنكرياس الزرع. بالإضافة إلى تمكين التصور المباشر في مجموعة متنوعة من الأنسجة المزروعة في الغرفة الأمامية للعين، فإن هذا النهج يوفر منبرا لحصاةن المخدرات عن طريق أداء على المدى الطويل متابعة والرصد في الأنسجة المستهدفة. بسبب زرع الأنسجة في براعة / خلية، في الغرفة الأمامية للعين علاجات زرع ليس فقط الفوائد، فهي تمتد إلى غيرها من التطبيقات في الجسم الحي لدراسة العمليات الفسيولوجية المرضية في جسم المريض ومثل نقل الإشارة والسرطان أو المناعة الذاتية تطور المرض.
Introduction
وقد كشفت التطورات في المجهر intravital الظواهر الفسيولوجية لا تنبأ بها في الدراسات المختبرية 1. هذا يسلط الضوء على التحدي في ترجمة النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق أساليب التقليدية في المختبر في الحيوانات الحية. في العقد الماضي، تحسنا كبيرا في التصور من أنسجة الحيوانات الحية من التقدم التكنولوجي في طرائق التصوير 2، 3، 4، 5، 6. وقد حفزت هذه في حاجة إلى نهج التصوير المجراة مع التطبيق ممكنا في النماذج الحيوانية التجريبية لتمكين التصور طولية من الأنسجة المستهدفة غير جراحية.
وقد مكنت تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بوزيترون الانبعاثات أو تلألؤ بيولوجي غير الغازية تصوير الأعضاء / الأنسجة العميقة داخل الجسم 7-8، 9. ولكن يمكن لهذه التقنيات أن تحقق واحدة الخلية القرار بسبب الإشارات الخلفية عالية ومنخفضة القرار المكانية، على الرغم من استخدام سو المواد التباين العالي أو الأنسجة محددة 4 التلألؤ. وقد وجهت هذا مع ظهور المجهر ثنائي الفوتون مبائر مضان 10. تمكين ثنائي الفوتون المجهري دراسات التصوير intravital لتصور وقياس الأحداث الخلوية مع تفاصيل لم يسبق لها مثيل 11 و 12. وقد أدى هذا إلى توصيف العمليات البيولوجية الأساسية في الصحة والمرض 13 و 14 و 15 و 16. بينما الرائد دراسات التصوير وintravital في المقام الأول "تحاكي" في ظروف فيفو في الأنسجة رفعه (مثل العقد الليمفاوية)، استخدمت دراسات أخرى النهج الغازية إلى الأنسجة المستهدفة تتعرض الصور في الموقع 17، 18، 19، 20، 21. وقد استخدمت دراسات أخرى أيضا "النماذج غرفة نافذة" للتحايل على القيود المرتبطة النهج الغازية ومحدودة في الجسم الحي التصوير القرار 22، 23، 24، 25. في إطار نموذج الدائرة، هو مزروع جراحيا غرفة مع نافذة شفافة في الجلد في diffeإيجار (الجلد الظهرية أو الأذن، وسادة الثدي الدهون والكبد وغيرها) على الحيوان (مثل الجرذان والفئران، والأرانب). في حين أن هذا النهج يمكن بوضوح عالي الدقة في التصوير المجراة، يقتضي وجود جراحة لزرع الدائرة وربما لا تكون قادرة على استيعاب أكثر من الدراسات الطولية التصوير عدة أسابيع أو 22 شهرا.
وقد تجلى مؤخرا أن الجمع بين عالية الدقة المجهر مبائر مع إجراء مينيملي، أي زرع في الغرفة الأمامية للعين (ACE) يوفر "نافذة الجسم الطبيعية" وذلك قوية وتنوعا في الجسم الحي التصوير منصة 26 و 27 وقد استخدم في زرع ACE في العقود القليلة الماضية لدراسة الجوانب البيولوجية من مجموعة متنوعة من الأنسجة 28، 29، 30، والأخيرة مع مزيج عالية الدقة التصوير تمكين دراسة علم وظائف الأعضاء من الجزر البنكرياسية مع خلية واحدة قرار غير وجراحية طوليا <سوب> 26 و 27. وقد استخدم هذا النهج لدراسة الاستجابات الذاتية خلال تطوير داء السكري نوع 1 في النماذج الحيوانية (بيانات غير منشورة). كما كان يستخدم لدراسة التنمية البنكرياس، وكذلك، في الدراسات وظائف الكلى عن طريق زرع البنكرياس في براعم ACE أو الكبيبات الكلوية الفردية، على التوالي (بيانات غير منشورة). A تقرير صدر مؤخرا باستخدام هذا النهج أثبت مزيد من تطبيقه لدراسة الاستجابات المناعية بعد زرع البنكرياس جزيرة 31. الأهم من ذلك، أظهرت هذه الدراسة أن زرع في الغرفة الأمامية من العين يوفر نافذة لأداء الجسم الطبيعية: (1) طولية، غير الغازية تصوير الأنسجة المزروعة في الجسم الحي، (2) في الجسم الحي cytolabeling لتقييم الجدوى والنمط الظاهري الخلوية في الموقع، (3) تتبع في الوقت الحقيقي من التسلل الخلايا المناعية في الأنسجة المستهدفة؛ و (4) المحلية عن طريق التدخل التطبيق الموضعي أو الحقن داخل العين.
هنا، نحن Demonstrate كيفية تنفيذ زرع في الغرفة الأمامية للعين باستخدام الجزر البنكرياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ الإجراء التالي تحت المجسام في 2 خطوات، الخطوة الأولى تنطوي تحميل الجزر في قنية والخطوة الثانية هي زرع الفعلية في ACE. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الحيوانات عن طريق رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) من جامعة ميامي.
1. تحميل الفشوت في قنية لزراعة
- مركز الجزر في صحن الثقافة من خلال الدوران في حلقة مفرغة الطبق تضييق.
- فصل قنية من "خزان" ووضع قنية وأنابيب يربط على سطح نظيف. ويمكن إجراء الخزان من أصل 300 ميكرولتر المتاح تلميح ماصة بلاستيكية بدون فلتر (الشكل 1A).
- طرد فقاعات الهواء من الخزان لضمان تيار مستمر من الجزر عندما الشفط في الخزان. بيغ الخزان ويتم ذلك من قبل القيادة إلى الأمام أيدي خالية الآلية حقنة سائق باستخدام دواسة القدم(1B الشكل، ج). وهذا سيجعل أيضا في الفضاء الحقنة للسماح تطلع الجزر في المكمن (محملة مسبقا مع محلول معقم المالحة مثل وسائل الإعلام، أو الثقافة PBS).
- نضح بلطف المبلغ المطلوب من الجزر في المكمن. سوف تميل إلى دوامة الجزر لأنها تدخل الخزان وستبقى معا نحو القاع. ويتم ذلك من قبل القيادة تطلع إلى الوراء والآلية حقنة سائق باستخدام دواسة القدم.
- أعد توصيل قنية إلى الخزان عبر أنابيب الاتصال.
- وضع قنية تلميح مرة أخرى في طبق الثقافة وتدفق الجزر من الخزان إلى الأنبوب ثم إلى قنية. تأكد من أن الجزر البقاء معا كما كنت مرة أخرى ملء الأنبوب / قنية بواسطة بلطف "عبها" (التنصت) وأنابيب (1D الشكل). وقف إما قبل أو بعد كل فقاعات الهواء قبل الجزر ويخرجوا من قنية. إذا لم تكن متأكدا، كما وقف الجزر أدخل الجزء الخلفي من قنية والهواء المتبقيةيمكن الفقاعات قبل الجزر يساعد على منع ارتجاع (ارتجاعي) من الجزر من ACE. سوف تتبدد بين عشية وضحاها.
- في هذه المرحلة، كنت على استعداد لحقن الجزر في ACE (يرجى الاطلاع الخطوات التالية).
2. جزيرة زرع في الغرفة الأمامية للعين
- وضع الماوس على وسادة تخدير دافئة تحت المجسام.
- وضع خطم من الفأرة إلى "قناع" التخدير متصلة الأكسجين / isoflurane آلة التخدير. يتكون القناع من أصل 1 مل ماصة الحافة البلاستيكية (بدون فلتر) وأنابيب متصلة التخدير حتى نهاية الضيقة (الشكل 2A، ب).
- سحب بلطف الجفون للعين أن زرع باستخدام السبابة والإبهام من يدك حرة و"البوب" في العين لأفضل التعرض وسهولة الوصول (الشكل 2C). وهذا يتطلب بعض الممارسة لاتقان دون إعاقة التنفس من الماوس عن طريق الضغط الزائد علىالرقبة أو عرقلة تدفق الدم في الرأس.
- باستخدام حقنة الانسولين المتاح (29 - 31G)، ومشرط، اختراق بعناية سوى غيض في القرنية وجعل شق واحد الجانبية. جعل شق في منتصف الفترة الفاصلة بين قمة حوف القرنية والتقليل إلى أدنى حد من الجزر الجزر خلال حقن من ACE (الشكل 2D).
- إدراج بعناية قنية (مسبقة مع الجزر) من خلال شق.
- إخراج ببطء للخروج من الجزر قنية وإيداعها على رأس القزحية. لتجنب الجزر جزيرة بسبب تراكم الضغط المفرط في ACE، إخراج الجزر في التوجهات وجيزة في وحدة تخزين صغيرة (ق) ممكن في مقابل رباعي إلى شق. ويمكن ضمان هذه الجزر مزيد من ضغط في الأنبوب أثناء تحميل قنية (يرجى راجع الخطوة 1.6).
- التراجع ببطء قنية من ACE. هذا هو خطوة حاسمة، وخاصة، إذا تم حقن كمية كبيرة من الجزر والجزر جزيرة بسبب بريهقد تأكد بناء داخل ACE أمرا لا مفر منه. للقضاء على / تقليل الجزر جزيرة، وتناوب بلطف بينما قنية داخل ACE للافراج عن الضغط الزائد من خلال شق حول قنية. تحقق من وجود علامات على الجزر وحاولت التراجع عن قنية، وإذا لزم الأمر، والانتظار حتى تهدأ الضغوط قبل التراجع تماما قنية من ACE.
- شطف العين المزروع مع PBS أو محلول ملحي معقم.
- حقن البوبرينورفين لتسكين بعد العملية (0،05-0،1 ملغ / كغ، تحت الجلد) لأول 48 ساعة.
- تطبيق مرهم الاريثروميسين العيون المضادات الحيوية للعين المزروع مباشرة بعد الزرع.
- وضع الحيوانات في قفص مرة أخرى للسماح حرارة التعافي من التخدير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هناك عدد قليل من المعالم التي تحدد "جيد" الزرع. A زرع جيد واحد هو أن العائدات دون نزيف عند إجراء شق كما يتضح في الفيديو. يتم منع النزيف / التقليل من اختراق فقط غيض من مشرط (الإبرة) في ACE (الشكل 3A). وهذا سوف يساعد أيضا في منع الاتصال وثقب القزحية. فإنه سيتم أيضا التأكد من شق صغير الذي سوف تلتئم بشكل جيد للغاية دون وقوع الغيوم القرنية مع مرور الوقت (الشكل 3C، د). وهناك جانب آخر مهم لزرع ناجحة هو أن تكون قادرة على زرع المبلغ الإجمالي المطلوب من الجزر دون خسارة بسبب نفاذ الجزر من ACE. كما ذكر في الخطوة 1.6 بروتوكول، يمكن التقليل من ذلك عن طريق لإخراج الجزر في حجم أقل درجة ممكنة، وعند الاقتضاء، وذلك باستخدام فقاعات الهواء للمساعدة على اغلاق شق تراجع النهائية للقنية من ACE (الشكل 3B). وعلاوة على ذلك، وتقديم ط slets على رأس القزحية بين حافة التلميذ وحوف المواقف الجزر في موقع قابلة جدا للتصوير في الجسم الحي (الشكل 3D). من الناحية العملية، وبعد ان الجزر في هذا موقفا وسطا للقزحية يقلل من سمك مداخن زي التصوير اللازمة لتمتد الجزر كله (الشكل 4). هذا مهم بشكل خاص خلال مضان مبائر / فوتون والثاني في الجسم الحي التصوير حيث أصغر Z-مكدس يسمح للإشارات الانتعاش أفضل مضان محددة في أعمق أجزاء من الأنسجة المصورة مع أفضل س ص والقرارات Z بسبب مبعثر أقل ضوء من الأنسجة. وعلاوة على ذلك، سمكا Z-مداخن تحتاج إلى وقت أطول الاستحواذ التي يزيد من احتمال انجراف جوهري أو الحيوان، وخصوصا خلال التصوير في الجسم الحي.
ftp_upload/50466/50466fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. صور لجهاز زرع لدينا بما في ذلك جميع أجزاء (أ) حقنة تجميعها الزجاج مع أنابيب، خزان، وقنية. (ب) بمحركات حقنة حقنة مع سائق المركبة. (ج) المزدوج دواسة القدم لتشغيل برنامج تشغيل حقنة الآلية. الضغط على دواسة يدفع إما إلى الوراء المكبس حقنة (الطموح) أو إلى الأمام (طرد) (د) عن قرب من قنية وأنابيب يربط تظهر الجزر معبأة في الجزء الخلفي من قنية. هذا التكوين يسمح تسليم الجزر في الغرفة الأمامية للعين في مجلد والحد الأدنى للحد من الجزر والجزر الصغيرة فقدان.
الشكل 2. تصوير لtransplantatiعلى الإجراء في الغرفة الأمامية للعين (ACE) (أ) صورة من الفأرة قناع التخدير. (ب) عن قرب نظرا للقناع التخدير مصنوعة من البلاستيك القابل للتصرف 1 مل تلميح ماصة بدون فلتر. وأدلى العديد من الثقوب في الطرف للسماح خلط الأوكسجين مع isoflurane قبل الوصول إلى الماوس. (ج) عن قرب عرض تظهر العين إلى أن زرع يتعرض لتحسين الوصول. تتعرض العين تمتد بها جلد الرأس باستخدام الإبهام والسبابة. (د) تصوير تخطيطي لإجراء زرع تسليط الضوء على موقع شق في منتصف الفترة الفاصلة بين قمة القرنية وحوف و. يتم إدراج قنية من خلال شق لتسليم الجزر إلى ACE. تودع الجزر على رأس القزحية حيث تدبر.
الشكل 3. ممثل الصور من زرع "جيد" تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في ضمان نتائج ناجحة. (أ) سلسلة من الصور تظهر مدى يتم الضغط غيض من مشرط (الإبرة) في القرنية في حين جعل شق. يتم إجراء شق صغير دون النزيف. شق هو أكبر قليلا من قنية. (ب) سلسلة من الصور تظهر الجزر طرده من قنية على رأس القزحية أثناء استخدام فقاعات الهواء لمنع ارتداد. لاحظ كيف "عازمة" على قنية يبدو بسبب انكسار الضوء مرة واحدة داخل ACE. (ج) صورة الممثل للعين المزروعة تسليط الضوء على وضوح ACE مباشرة بعد الزرع. (د) سلسلة من الصور من العين نفسها حصلت على المحدد بعد الجراحة يوم (POD) تسليط الضوء على الموقع المفضل من الجزر في معهد العالم العربي للفيفوجينج وكيف تلتئم بشكل جيد والمترجمة هو شق وضوح القرنية في 6 أسابيع بعد الزرع.
الشكل 4. ممثل صورة مبائر مضان من جزيرة البنكرياس زرع في الغرفة الأمامية للعين الماوس (ACE) تسليط الضوء على فوائد الموقف جزيرة على القزحية والقدرة على حل الخلايا الفردية خلال التصوير في الجسم الحي (أ) الإسقاط الأقصى (2 - D عرض) لZ-كومة من جزيرة (المبينة مع خط منقط) على أعلى من قزحية على فأرة الحاسوب C57BL / 6 المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في المنشط والذاكرة الخلايا T-32. وقد حصلت على صورة 5 أيام بعد زرع حيث تم الكشف عن عدد قليل من الخلايا T-التسلل (الأخضر) في جزيرة القزحية المحيطة. كانت جزيرة والقزحية من تصور تشتت ارتدادي الليزر أو reflection (رمادي). (ب) آراء ثلاثي الأبعاد (3-D) من جزيرة نفسه تسليط الضوء على فوائد زاوية التصوير مشاهدة / للحد من سمك Z-المكدس للحصول على حجم وهيكل جزيرة بأكملها المحيطة والخلايا المناعية. لاحظ محاور XYZ لدوران الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم عزل الجزر البنكرياسية الفئران باستخدام الهضم كولاجيناز تليها تنقية على تدرجات الكثافة، كما هو موضح سابقا 33. تم زراعة الجزر المعزولة بين عشية وضحاها قبل الزرع. بينما قد لا تكون هناك حاجة هذا، فمن المستحسن أن تسمح الجزر للتعافي من إجراء العزل. هذا أمر بالغ الأهمية عندما يتم تنفيذ زرع في متلقي السكري لأنها سوف تضمن زرع على قيد الحياة / الجزر قوية.
يتم تنفيذ زرع تحت التخدير المعمم مع الأكسجين / خليط isoflurane (1.5-3٪) لاستنشاق المفعول. ويمكن استخدام بديل استنشاق أو حقن التخدير (مثل الكيتامين). إذا تم استخدام التخدير بالحقن، تخطي الخطوة 2.2 في البروتوكول. تقدم الحيوان تخدير مع مصدر للحرارة لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء العملية. في بعض الفئران، فمن الممكن لكسر الأوعية الدموية عند إجراء شق في التعاون اوعائي عادةrnea. على سبيل المثال، القرنية من الفئران عارية يميل إلى أن يكون أوعية دموية، وتجنب المناطق أوعية دموية عندما يكون ذلك ممكنا. استخدام حقنة جديدة في شق. تجنب ثقب إبرة مع قزحية عند إجراء شق. يمكن منع اتصال مع القزحية يمكن ضمان تواجه مزيدا من الجانب مشطوف من طرف الإبرة نحو القزحية. لا تجف / نضح الخلط المائي بعد إجراء شق. أنه من الأسهل لاختراق قنية من خلال شق في القرنية "الرطب"؛ إضافة بضع قطرات من سائل الإعلام أو الثقافة العقيمة PBS إلى القرنية إذا لزم الأمر.
ويمكن الحصول على تسكين بعد العملية عن طريق حقن تحت الجلد البوبرينورفين (0،05-0،1 ملغ / كغ) أو مسكن المفضل (ق) لأول 48 ساعة. في الخطوة 2.9، ونحن إدارة التسكين مباشرة بعد الإجراء والحيوان هو بالفعل عميق تحت التخدير العام. إذا رغبت، ومع ذلك، يمكن تنفيذ الخطوة بعد الخطوة 2.9 2.2 في البروتوكول، مع أو بدون مخدر موضعي للعين (التشاور مع المحلية الخاصة بكIACUC أو طبيب بيطري). ويمكن أيضا المضادات الحيوية البديلة العيون استخدامها.
هنا، استخدمنا جهاز حقن مكروي مبنية خصيصا تعمل عن طريق دواسة القدم لدفع ال 100 ميكرولتر الدقة الزجاج حقنة لنضح (تحميل) وإخراج الجزر من قنية إلى ACE (الشكل 1). يمكن أن تكون بديلا هذا مع أي 100 ميكرولتر الغاز محكم الدقة حقنة زجاجية مع المكبس المسمار يحركها التي يمكن تشغيلها يدويا لنضح / إخراج الجزر، وهذا سوف يتطلب على الأرجح إلا بمساعدة شخص آخر للعمل. في كلتا الحالتين، وإن لم يكن المطلوب من المستحسن قبل التحميل الحقنة تجميعها، وأنابيب، وخزان مع محلول معقم (المالحة، أو وسائل الإعلام الثقافة PBS) لضمان تطلع على نحو سلس وطرد من الجزر. هذا مهم بشكل خاص إذا / عندما الجزر معبأة تسد قنية.
نقوم عادة إجراءات زرع لدينا في ظل ظروف نظيفة داخل سيارة أجرة للسلامة الأحيائيةآينت دون التعرض لخطر العدوى. وتعقيمها كل الحلول المستخدمة، المحاقن، قنية، وأنابيب، والشاش المعقم أو الغاز. في حين، ونحن لا يمكن التأكد من العقم التام بسبب الاتصال جنب مع الماوس أثناء العملية، لم يكن لدينا أي مشاكل مع التلوث جزيرة اتباع الخطوات الموصى بها أعلاه.
أثبتنا هنا كيفية زرع البنكرياس الجزر في ACE لأغراض التصوير التي تحتاج إلى عدد أقل من الجزر زرع. في الحالة حيث هو المطلوب عكس مرض السكري في الحيوان المتلقي، كمية أكبر من الجزر يحتاج إلى زرع 26 و 27. في حين أن إجراء زرع مطابق لما أظهرنا هنا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لخطوات 2.6 و 2.7 في البروتوكول لتجنب فقدان الجزر المزروعة بسبب الجزر.
يتقن مرة واحدة، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في زرع حد أدنى 5 ~ في الماوس. ويمكن استخدام هذه التقنية لزرع مجموعة متنوعة من tissuوفاق في الغرفة الأمامية للعين. كما ذكر أعلاه، فقد زرع الكلى نحن الكبيبات وكذلك الأنسجة الجنينية (براعم البنكرياس) لدراسة التنمية البنكرياس في الغرفة الأمامية للعين في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PO.B. هي واحدة من مؤسسي شركة للتكنولوجيا الحيوية Biocrine، والتي سوف تستخدم الغرفة الأمامية للعين كمنصة الخدمات التجارية. AC على حماية براءة الاختراع هذه التكنولوجيا.
Acknowledgments
نعترف الدكاترة. كاميلو Ricordi، Pileggi انتونيلو، R. Molano داماريس، Speier ستيفان ودانيال Nyqvist لإجراء مناقشات مثمرة. نشكر أيضا Eleut هرنانديز ودييجو اسبينوزا-Heidmann للمساعدة التقنية، ومايك فالديز وفورموسو مارجريت للمساعدة في تسجيل الفيديو. سجلت بايرون مالدونادو، تحرير، وإنتاج الفيديو النهائي. وقدم الدعم من قبل مؤسسة البحوث معهد بحوث السكري ( www.DiabetesResearch.org )، والمعاهد الوطنية للصحة / NIDDK / NIAID (F32DK083226 لMHA؛ NIH RO3DK075487 لAC؛ U01DK089538 لPO.B.). وقدم دعم إضافي من خلال البحوث لPO.B الأموال من معهد كارولينسكا، ومجلس البحوث السويدية ومؤسسة مرض السكري السويدية ومؤسسة الأسرة مؤسسة Erling-بيرسون، وكنوت الأسرة وأليس النبرغ، ومؤسسة التأمين سكانديا المحدودة، VIBRANT ( FP7-228933-2)، وبرنامج البحوث الاستراتيجية في مرض السكري في انست كارولينسكاitutet، ومؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة فون للرصيف Kantzow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, Suppl 14. 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
