Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

השתלה ללשכה הקדמית של העין לאורך, לא פולשני Published: March 10, 2013 doi: 10.3791/50466
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,5
1Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 4Department of Physiology & Biophysics, University of Miami Miller School of Medicine, 5The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet

Summary

גישה חדשה המשלבת השתלת תוך עיני ומיקרוסקופיה confocal מאפשרת הדמית אורכית, לא פולשנית בזמן אמת עם רזולוצית תא בודד בתוך רקמות הושתלו

Abstract

Intravital ההדמיה התפתחה ככלי הכרחי במחקר ביולוגי. בתהליך זה, רבות שיטות הדמיה פותחו כדי לחקור את התהליכים ביולוגיים שונים בבעלי החיים הלא פולשני. עם זאת, מגבלה טכנית עיקרית בשיטות הדמית intravital קיימות היא חוסר היכולת לשלב הדמיה בלתי פולשנית, אורכית עם יכולות רזולוצית תא בודד. והביאו כאן כמה השתלה ללשכה הקדמית של העין עוקפת מגבלה משמעותית כגון מציעה פלטפורמה ניסיונית תכליתית המאפשרת הדמיה לא פולשנית, אורכית עם רזולוציה סלולרית בגוף חי. אנחנו מדגימים את הליך ההשתלה בעכבר ולספק תוצאות תוך שימוש במודל מייצגות עם רלוונטיות קליניות, כלומר לבלב איון השתלה. בנוסף להפעלת הדמיה ישירה במגוון של רקמות הושתלו בלשכה הקדמית של העין, גישה זו מספקת פלטפורמה לחלוקיםתרופות n על ידי ביצוע מעקב ארוך טווח וניטור ברקמות היעד. בגלל הרבגוניות, השתלת הרקמה / תא שלה ללשכה הקדמית של הטבות לא רק טיפולי השתלת העין, הוא משתרע על השני ביישומי vivo כדי לחקור תהליכים פיסיולוגיים וpathophysiological כגון העברת אותות וסרטן או התפתחות מחלה אוטואימונית.

Introduction

התקדמות במיקרוסקופיה intravital חשפה תופעות פיסיולוגיות לא נחזו על ידי מחקרים במבחנה 1. זה מדגיש את האתגר בתרגום ממצאים שהושגו על ידי קונבנציונלי שיטות מבחנה לחי. בעשור האחרון, להדמיה של רקמות חי חיות השתפרה במידה ניכרת על ידי התקדמות טכנולוגית בשיטות הדמיה 2, 3, 4, 5, 6. זה דרבן את צורך בגישות הדמית vivo עם יישום אפשרי במודלים של בעלי חיים ניסיוניים כדי לאפשר הדמית אורך של רקמות היעד הלא פולשני.

שיטות הדמיה כגון הדמיה בתהודה מגנטית וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרוני פליטת אור או אפשרו הדמיה לא פולשנית של איברים / רקמות עמוקים בתוך הגוף 7-8, 9. אבל שיטות אלה לא יכולים להשיג אחת ברזולוצית תא בשל אותות רקע גבוהים ורזולוציה מרחבית נמוכה, למרות השימוש of גבוהים חומרי ניגוד או 4 הארת רקמות ספציפיות. על כך אמר עם כניסתו של מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי שני פוטונים 10. מיקרוסקופ שני פוטונים אפשר מחקרי ההדמיה intravital לדמיין ולכמת אירועים הסלולר עם פרטים חסרי תקדים 11, 12. העובדה זו הובילה לאפיון של תהליכים ביולוגיים מרכזיים בבריאות ומחלה 13, 14, 15, 16. בעוד שמחקרי ההדמיה intravital החלוציים שבעיקר "חיקו" בתנאי vivo ברקמה נכרתה (בלוטות הלימפה, לדוגמה), מחקרים אחרים השתמשו בגישות פולשניות לרקמות יעד תמונה שנחשפו באתרו 17, 18, ​​19, 20, 21. מחקרים אחרים אף נקטו "מודלים קאמריים חלון" כדי לעקוף מגבלות הקשורות לגישות פולשניות ורזולוצית הדמיה מוגבלת ב22 vivo, 23, 24, 25. במודל חדר החלון, חדר עם חלון שקוף הוא מושתל לתוך העור בdiffeמיקומי השכרה (עור הגבה או אוזן, כרית שומן חלב, כבד, וכו ') על בעלי החיים (עכבר, חולדה, ארנבון למשל). למרות שגישה זו באופן ברור מאפשרת רזולוציה גבוהה בתחום הדמית vivo, זה דורש ניתוח פולשני להשתיל הקאמרי וייתכן שלא יהיה מסוגל להכיל מחקרי הדמיה אורכיים, למשך מספר שבועות או חודשים 22.

הוא הוכיח לאחרונה כי שילוב מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה עם הליך פולשנית, כלומר השתלה ללשכה הקדמית של העין (ACE) מספק "חלון גוף טבעי" כחזק ומגוון בפלטפורמת vivo הדמית 26, 27. השתלה לתוך ACE כבר בשימוש בעשורים האחרונים כדי ללמוד היבטים ביולוגיים של מגוון רחב של רקמות 28, 29, 30; והשילוב האחרון שלה עם הדמיה ברזולוציה גבוהה אפשר ללמוד פיזיולוגיה של איי לבלב עם תא החלטה אחת שאינה פולשני ו longitudinally <sup> 26, 27. גישה זו הייתה בשימוש ללמוד תגובות אוטואימוניות בהתפתחות סוכרת מסוג 1 במודלים של בעלי חיים (נתונים שלא פורסמו). זה היה בשימוש גם ללמוד פיתוח לבלב, כמו גם, במחקרים של תפקוד כליות על ידי השתלה לתוך ניצני ACE הלבלב או כלית glomeruli הבודד, בהתאמה (נתונים שלא פורסמו). דו"ח אחרון שימוש בגישה זו, ממשיך להדגים היישום שלה כדי ללמוד את התגובה חיסונית לאחר השתלת לבלב איון 31. חשוב מכך, מחקר זה הראה כי השתלה ללשכה הקדמית של העין מספק חלון טבעי גוף לביצוע: (1) הדמית אורכית, לא פולשנית של רקמות מושתלות בגוף חי; in vivo (2) cytolabeling להעריך פנוטיפ וכדאיות סלולריים ב אתר; (3) מעקב בזמן אמת של חדירת תאי מערכת חיסון ברקמות המטרה, וב( 4) התערבות מקומית על ידי יישום מקומי או הזרקה תוך עיניים.

כאן, אנו iv שemonstrate כיצד לבצע את ההשתלה בלשכה הקדמית של העין באמצעות איי לבלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליך הבא מבוצע בסטריאוסקופ ב 2 שלבים, השלב הראשון כרוך בטעינת האיונים לתוך הצינורית והשלב השני הוא השתלה בפועל לאייס. כל הניתוחים שבוצעו על בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי החיים ועדה המוסדי שימוש (IACUC) מאוניברסיטת מיאמי.

1. איי טוען בקנייה להשתלה

  1. מרכז האיים במנת התרבות של ספינינג המנה בחוגים צרים.
  2. ניתק את הצינורית מ" המאגר "ולמקם את הצינורית וחיבור צינור על משטח נקי. המאגר יכול להתבצע מתוך קצה 300 μl פנוי פלסטיק פיפטה ללא סינון (האיור 1 א).
  3. שטוף את בועות אוויר מתוך המאגר על מנת להבטיח זרם רציף של איונים כאשר aspirating למאגר. פלאשינג המאגר נעשה על ידי נוסע קדימה מזרק הנהג ללא ידות הממונעות באמצעות דוושת הרגל(האיור 1b, ג). זה יהיה גם להפוך את החלל במזרק כדי לאפשר שאיפה של האיים למאגר (נטען מראש בתמיסה סטרילית כגון תקשורת המלוחה, PBS או תרבות).
  4. בעדינות לשאוב כמות רצויה של איונים למאגר. איונים נוטים מערבולת בה הם נכנסים למאגר ויישארו ביחד לכיוון התחתי. שאיפה נעשית על ידי נהיגת מזרק הנהג ממונע אחורה באמצעות דוושת הרגל.
  5. חבר מחדש את הצינורית למאגר דרך הצינור המקשר.
  6. הנח את קצה הצינורית שוב בצלחת התרבות ושטוף את האיים מתוך המאגר לצינורות ואז לתוך הצינורית. ודא שאיונים להישאר ביחד כמו שאתה גב למלא את הצינור / הצינורית ידי בעדינות "מצליף" (ציתות) צינורות (איור 1 ד). עצור לפני או אחרי כל בועות האוויר לפני האיונים הם שטפו את הצינורית. אם אינך בטוח, תפסיקו להיכנס כאיונים האחוריים של הצינורית כמו אוויר שנותרבועות לפני האיונים יכולים לסייע במניעת רפלוקס (זרימה חוזרת) של איונים מתוך ACE. הוא ייעלם בן לילה.
  7. בשלב זה, אתה מוכן להזרים האיונים לACE (ראה שלבים הבאים).

2. איון השתלה ללשכה הקדמית של העין

  1. מקם את העכבר מורדם על משטח חם תחת סטריאוסקופ.
  2. הנח את פרצופו של העכבר להרדמה "מסכה" מחוברת לחמצן / מכונת הרדמת isoflurane. המסכה עשויה מקצה 1 מ"ל פנוי פלסטיק פיפטה (ללא מסנן) ומחוברת לצינורות הרדמה עד הסוף הצר (האיור 2a, ב).
  3. עדינות חוזר בי את העפעפיים של העין כדי להיות מושתלים באמצעות אצבע והאגודל של היד החופשית שלך ו" פופ "העין על חשיפה טובה יותר וגישה נוחה (איור 2 ג). זה ידרוש קצת תרגול כדי לשכלל בלי לפגוע פגיעה קשה נשימה של העכבר על ידי לחץ מוגזם עלצוואר או חסימת זרימת דם לראש.
  4. השימוש במזרק אינסולין חד פעמי (29 - 31G) כאזמל, לחדור בזהירות רק הקצה בקרנית ולעשות חתך רוחבי אחד. הפוך את החתך באמצע בין השיא של הקרנית וגובל למזער ריפלוקס של האיים במהלך הזרקה מתוך ACE (איור 2 ד).
  5. בזהירות להכניס צינורית (preloaded עם איונים) דרך החתך.
  6. לאט להוציא איונים מתוך הצינורית ולהפקיד אותם בחלק העליון של הקשתית. כדי להימנע מריפלוקס איון בשל הצטברות לחץ מוגזמת בACE, להוציא את האיים בדחיפות קצרות כבנפח קטן (הים) שאפשר ברבע השני לחתך. זה יכול להיות עוד יותר על ידי הדחיסה הבטיח איונים בצינורות בעת טעינת הצינורית (אנא ראה שלב 1.6).
  7. לאט לאט לחזור בי הצינורית מתוך ACE. זהו צעד קריטי, במיוחד, אם נפח גדול של איונים הוזרק כריפלוקס איון בשל presבטוח לבנות בתוך ACE עשוי להיות בלתי נמנע. כדי למנוע / למזער ריפלוקס איון, בעדינות לסובב את הצינורית ואילו בתוך ACE לשחרר לחץ עודף דרך החתך מסביב לצינורית. לבדוק סימנים של ריפלוקס כפי שאתה מנסה לחזור בו צינורית ואם צריך, יש להמתין עד שוך לחץ לפני לחלוטין retracting הצינורית מתוך ACE.
  8. יש לשטוף את העיניים עם מושתלות סטרילי PBS או תמיסת מלח.
  9. הזרק עצירות לשיכוך כאבים שלאחר הניתוח (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג, תת עורי) עבור 48 השעות הראשונות.
  10. החל משחה אנטיביוטית עיני אריתרומיצין לעין המושתלת מייד לאחר השתלה.
  11. הנח את החיה חזרה בכלוב מחומם כדי לאפשר התאוששות מן ההרדמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ישנם כמה פרמטרים שמגדירים השתלה "טובה". השתלה טובה היא אחד שנמשך ללא דימום בעת ביצוע החתך כפי שניתן לראות בוידאו. דימום מנוע / ממוזער על ידי חדירה רק קצה האזמל (מחט) לתוך ACE (איור 3 א). זה גם יעזור למנוע מגע ולנקב של הקשתית. זה גם יבטיח חתך קטן שירפא היטב מבלי לגרום לעננות של הקרנית לאורך זמן (איור 3 ג, ד). היבט חשוב נוסף להשתלה מוצלחת הוא להיות מסוגל להשתיל את הסכום הרצוי הכולל של איונים ללא הפסד כתוצאה מההחזר של ACE. כאמור בשלב הפרוטוקול 1.6, זה יכול להיות ממוזער על ידי פולטים האיים בנפח לפחות האפשרי ו, כאשר הדבר ישים, באמצעות בועות אוויר כדי לעזור לאטום את החתך על נסיגה סופית של הצינורית מתוך ACE (איור 3 ב). זאת ועוד, ומספק לי slets על גבי הקשתית בין הקצה של התלמיד וגובל ממקם את האיונים במיקום מאוד נוח לin vivo הדמיה (האיור 3d). מבחינה מעשית, שהאיים בעמדת ביניים הזאת של הקשתית מפחית את העובי של Z-ערימות ההדמיה הנדרשות לגשר איים שלמים (איור 4). הדבר חשוב במיוחד במהלך confocal / שתי פוטוני פלואורסצנטי in vivo ההדמיה בי קטן Z-מחסנית מאפשרת התאוששות טובה יותר של אותות קרינה ספציפיים בסעיפים עמוקים יותר של רקמת ההדמיה עם רזולוציות z בשל פיזור פחות אור על ידי רקמת xy וטוב יותר. יתר על כן, עבה Z-ערימות דורשות זמן רכישה כבר שמועל את הסיכוי של סחיפת אינסטרומנטלי או בעל חיים, במיוחד בתחום הדמית vivo.

ftp_upload/50466/50466fig1highres.jpg "/>
איור 1. תצלומים של מנגנון ההשתלה שלנו כוללים את כל החלקים. () Assembled מזרק זכוכית עם צינורות, מאגר, וקנולה. (ב) ממונע מזרק נהג עם מזרק רכוב. (ג) דוושה כפולה לפעול נהג המזרק הממונע. לחיצה על דוושה או מניעה את בוכנת המזרק אחורה (אספירציה) או קדימה (פליטה). (ד) תקריב של הצינורית וצינור חיבור מראה את האיים העמוסים בחלק האחורי של הצינורית. תצורה זו מאפשרת משלוח של האיונים ללשכה הקדמית של העין בנפח מינימאלי כדי להפחית רפלוקס והפסד של איונים.

איור 2
איור 2. תיאור של transplantatiבהליך ללשכה הקדמית של העין (ACE). (א) תמונה של מסכת הרדמת העכבר. (ב) תצוגת תקריב של מסכת ההרדמה עשויה מקצה 1 מ"ל פנוי פלסטיק פיפטה ללא מסנן. מספר חורים נעשו בקצה כדי לאפשר ערבוב של חמצן עם isoflurane לפני שהגיע לעכבר. (ג) תקריב להציג מראה עיניים להיות מושתל חשוף לגישה טובה יותר. העין חשופה החוצה על ידי מתיחת העור של הראש באמצעות האגודל ואצבע המורה. (ד) תיאור סכמטי של הליך ההשתלה מדגיש את מיקומו של החתך בנקודת האמצע בין השיא של הקרנית וגובל. הצינורית מוחדרת דרך החתך כדי לספק את האיונים לאייס. איונים מופקדים על גבי הקשתית שם הם נקלטים.

איור 3 איור 3. תמונות מייצגות של השתלה "טובה" המדגישה את השלבים קריטיים בהבטחת תוצאות טובות. (א) סדרה של תמונות המראות עד כמה רחוק קצה האזמל (מחט) נדחף לתוך הקרנית תוך ביצוע החתך. חתך קטן נעשה ללא דימום. החתך הוא קצת יותר גדול מהצינורית. (ב) סדרה של תמונות המראות איונים שייפלטו מהצינורית על גבי הקשתית תוך שימוש בבועות אוויר כדי למנוע ריפלוקס. שים לב איך "מכופף" את הצינורית מופיעה עקב להדליק שביר פעם אחת בתוך ACE. (ג) תמונה מייצגת של עין מושתלת מדגישה את הבהירות של ACE מייד לאחר השתלה. (ד) סדרה של תמונות של אותה העין שנרכשה בצוין ימים שלאחר הניתוח (POD) המדגישים את המיקום המועדף של איונים לin vivo imaגינג ואיך גם רפא ומקם את החתך והבהירות של הקרנית בגיל 6 שבועות לאחר השתלה.

איור 4
איור 4. תמונת נציג פלואורסצנטי confocal של לבלב הושתל בלשכה הקדמית של עין העכבר (ACE) המדגישה את היתרונות של מיקום האיון בקשתית העין והיכולת לפתור תאים בודדים במהלך in vivo ההדמיה (א) היטל מקסימאלי (2. - D השקפה) של Z-מחסנית של איון (מסומן בקו מקווקו) בחלק העליון של קשתית עכבר מהונדס C57BL / 6 שמבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ובזיכרון הפעיל תאי T 32. התמונה נרכשה 5 ימים לאחר ההשתלה שבו מעטי חדירת תאי T (ירוק) זוהה בקשתית מקיפה את האי הקטן. האיון ואיריס היו דמיין ידי backscatter ליזר או reflection (אפור). (ב) נוף תלת ממדים (3-D) של אותו האיון מדגיש את היתרונות של זווית צפיית הדמיה / כדי להפחית את עובי Z-המחסנית לרכוש נפח האיון השלם ומקיף את המבנה ותאי מערכת חיסון. שים לב לצירי XYZ לסיבוב של התמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

איי לבלב עכבריים היינו מבודדים באמצעות עיכול collagenase אחרי טיהור בשיפועים בצפיפות, כפי שתואר קודם לכן 33. איים מבודדים בתרבית הלילה לפני ההשתלה. אמנם זה לא ייתכן שיידרש, מומלץ לאפשר לאיונים להתאושש מהליך הבידוד. זה קריטי כאשר ההשתלה מתבצעת במקבלי סוכרת כפי שהוא יבטיח השתלה לשרוד / איונים חזקים.

ההשתלה מתבצעת בהרדמה כללית עם חמצן / שאיפה להשפעת תערובת isoflurane (1.5-3%). הרדמת משאיפת או הזרקה אלטרנטיבית (למשל קטמין) ניתן להשתמש. אם הרדמת הזרקה משמשת, דלג על השלב 2.2 בפרוטוקול. לספק את החיה המורדמת עם מקור החום כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההליך. בעכברים מסוימים, אפשר לשבור כלי דם בעת ביצוע החתך בשיתוף כלל avascularrnea. לדוגמה, בקרנית של עכברים בעירום נוטה להיות כלי דם; להימנע מאזורי כלי דם במידת ההאפשר. השתמש במזרק חדש לחתך. הימנע מניקוב הקשתית עם המחט בעת ביצוע החתך. מניעת מגע עם איריס ניתן להבטיח עוד יותר על ידי מול הצד המעוגל של קצה המחט לקשתית. אל תתייבש / לשאוב הומור מימי לאחר ביצוע החתך. זה קל יותר לחדור לצינורית דרך החתך בקרנית "רטובה", מוסיף כמה טיפין של תקשורת PBS או תרבות סטריליים לקרנית במידת צורך.

כאבים לאחר הניתוח ניתן להשיג על ידי הזרקה תת עורית עצירות (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) או משכך כאבים מועדפים (ות) עבור 48 השעות הראשונות. בשלב 2.9, ואנחנו נותנים שיכוך כאבים מייד לאחר ההליך כחיה היא כבר עמוקה בהרדמה כללית. אם תרצו, לעומת זאת, צעד 2.9 ניתן לבצע לאחר השלב 2.2 בפרוטוקול, עם או בלי הרדמה מקומית לעין (להתייעץ עם הרשות המקומיתIACUC או וטרינר). אנטיביוטיקה לרפואת עיניים אלטרנטיבית יכולה לשמש גם.

כאן, אנו משמשים מנגנון microinjection שהותקן מופעל באמצעות דוושת רגל לנהוג מזרק 100 μl דיוק הזכוכית כדי לשאוב (עומס) ולהוציא את האיים מתוך הצינורית לתוך ACE (איור 1). זה יכול להיות תחליף לכל מזרק 100 μl גז הדוק דיוק זכוכית עם בוכנת בורג המונע שיכול להיות מופעלות באופן ידני כדי לשאוב / להוציא את האיים; זה אולם סביר להניח שיזדקק לעזרתו של אדם אחר כדי לפעול. בכל מקרה, למרות שאינם נדרש אנו ממליצים מראש טעינה-המזרק התאסף, צינורות, והמאגר עם תמיסה סטרילית (מלוח, PBS או תרבות תקשורת), כדי להבטיח את השאיפה ופליטת חלק מהאיים. זה חשוב במיוחד אם / כאשר האיים הארוזים לסתום את הצינורית.

אנחנו בדרך כלל לבצע הליכי השתלתנו בתנאים נקיים בתוך מונית biosafetyINET ללא סיכון לזיהומים. כל הפתרונים המשומשים, המזרקים, הצינורית, הצינורות, והם autoclaved הגזה או עיקור בגז. אמנם, אנחנו לא יכולות לוודא סטריליות מלאה בגלל מגע יד עם העכבר במהלך ההליך, לא היו לנו שום בעיות עם זיהום איון ביצוע השלבים המומלצים לעיל.

אנחנו הדגמנו כאן כיצד השתלת איי לבלב לACE למטרות הדמיה בי איונים פחות נחוצים להשתלה. במקרה שבו היפוך סוכרת הוא רצוי בחית הנמען, כמות גדולה של איונים צריכה להיות מושתלת 26, 27. בעוד הליך ההשתלה הוא זהה לזה שהראינו כאן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולמת על צעדים 2.6 ו -2.7 בפרוטוקול כדי למנוע אובדן של איים מושתלים בשל רפלוקס.

שולט פעם, הליך השתלה זו יכול להתבצע ב~ 5 דקות לעכבר. טכניקה זו יכולה לשמש להשתלה במגוון Tissues ללשכה הקדמית של העין. כאמור, יש לנו מושתלים כלית glomeruli כמו גם רקמה עוברית (ניצני לבלב) ללמוד פיתוח לבלב בלשכה הקדמית של העין בגוף החי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

PO.B. הוא אחד ממייסדי Biocrine החברה ביוטכנולוגיה, שהוא הולך להשתמש בלשכה הקדמית של העין כפלטפורמת שירות מסחרית. AC הוא על הפטנט להגנת טכנולוגיה זו.

Acknowledgments

אנו מכירים בבני זוג. קמילו Ricordi, אנטונלו Pileggi, ר 'דמאריסו Molano, סטפן Speier ודניאל Nyqvist לדיונים פוריים. אנו מודים גם לEleut הרננדז ודייגו אספינוסה-Heidmann לתמיכה טכנית, ומייק ואלדס ומרגרט Formoso לעזרה עם הקלטת וידאו. ביירון מלדונאדו נרשם, הערך והפיק את הווידאו הסופי. תמיכה במחקר סופקה על ידי מכון מחקר סוכרת הקרן (www.DiabetesResearch.org), NIH / NIDDK / פוסי (F32DK083226 לMHA; NIH RO3DK075487 לAC; U01DK089538 לPO.B.). תמיכה במחקר נוספת כדי PO.B סופקה באמצעות כספים מקרולינסקה, מועצת המחקר השבדית, קרן הסוכרת השבדית, Erling-פרסון קרן המשפחה, המשפחה הקנוטה ואליס ולנברג הקרן, Skandia החברה לביטוח בע"מ, תוסס ( FP7-228933-2), תכנית מחקר אסטרטגי בסוכרת בקרולינסקה Institutet, נובו נורדיסק הקרן, וקרן המעגן פון של Kantzow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IsoTHESIA (Isoflurane) Buttler Animal Health Supply 11695-6775-2 99.9% Isoflurane/ml
Ketaset (Ketamine HCL) Fort dodge Animal Health 0856-2013-01 Alternative injectable anesthesia
Beprenex (Buprenorphine HCL) Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. 12496-075-7-1 0.3 mg/ml
Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% Akron 17478-070-35 Applied prophylactically to transplanted eye
0.9% Sodium Chloride (Saline) Hospira Inc. 0409-7983-03 For iv injection. Sterile
PBS Gibco 10010-023 1X. Sterile
CMRL medium 1066 Cellgro 98-304-CV Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
  6. Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
  7. Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
  8. Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
  9. Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
  10. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  11. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  12. Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  13. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  14. Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
  15. Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
  16. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
  17. Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
  18. Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
  19. Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
  20. Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
  21. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
  22. Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
  23. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
  24. Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
  25. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
  26. Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  27. Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  28. Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, Suppl 14. 1082 (1959).
  29. Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
  30. Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
  31. Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
  32. Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
  33. Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).

Tags

רפואה גיליון 73 ביולוגיה מולקולרית הנדסה ביו רפואית אימונולוגיה רפואת עיניים כירורגיה הפרעות מטבוליזם סידן הפרעות חילוף חומרים של הגלוקוז סוכרת היפרגליקמיה hyperinsulinism היפוגליקמיה השתלות איי לבלב איון קאמרי תוך עיניים מוח עיניים קרנית חי חלון, תגובות חיסוניות קנולה הדמיה מודל חיה
השתלה ללשכה הקדמית של העין לאורך, לא פולשני<em&gt; בחי</em&gt; הדמיה ברזולוצית תא בודד בזמן אמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abdulreda, M. H., Caicedo, A.,… More

Abdulreda, M. H., Caicedo, A., Berggren, P. O. Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time. J. Vis. Exp. (73), e50466, doi:10.3791/50466 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter