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Medicine

纵向，非侵入性的移植到眼睛的前房 Published: March 10, 2013 doi: 10.3791/50466
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,5
1Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 4Department of Physiology & Biophysics, University of Miami Miller School of Medicine, 5The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet

Summary

眼内移植和共聚焦显微镜相结合的一种新的方法移植组织内，使纵向的，非侵入性的单细胞分辨率的实时成像

Abstract

活体成像已成为生物学研究的一个不可缺少的工具。的过程中，许多成像技术已经发展到在非侵入性动物研究的不同生物过程。然而，一个重要的技术在现有的活体成像方式的限制是无法以非侵入性的结合，纵向成像与单细胞的分辨能力。我们在这里展示，如何移植进入前房的眼睛，会在显着的限制，提供一个多功能的实验平台，使非侵入性的， 体内细胞高分辨率成像与纵向。我们展示了鼠标和移植过程中使用的模型与临床相关性，即胰岛移植提供有代表性的结果。除了能够直接可视化的各种组织移植到眼的前房，这种方法提供了一个平台，卵石Ň药物进行长期的跟进和监测靶组织中。由于它的多功能性，组织/细胞移植到眼睛的前房不仅有利于移植疗法，它延伸到其它在体内应用研究的生理和病理生理过程，如信号转导和癌症或自身免疫性疾病的发展。

Introduction

在活体显微镜的进展显示，预计不会在体外研究中的生理现象。这突出表明在体外培养的方法，通过常规的活的动物的研究结果，在翻译的挑战。在过去的十年中，大大改善生活的动物的组织中的可视化技术进步的成像方式2，3，4，5，6。这促使需要在体内成像方法与可行的在实验动物模型中的应用，使纵向的非侵入性的靶组织的可视化。

启用非侵入性的成像技术，如磁共振成像和正电子发射断层扫描或生物发光成像的器官/组织深身体内的7-8，9。但是，这些技术无法实现单细胞分辨率高的背景信号和低空间分辨率，但使用of高对比度的材料或组织特异性的发光4。这是解决与双光子荧光共焦显微镜10的到来。双光子显微镜活体成像研究，以前所未有的细节11，12，可视化和量化细胞的活动。这导致了在健康和疾病的13，14，15，16中的关键的生物过程的表征。开拓性的活体成像研究主要是“模仿” 在体内切除的组织（ 如淋巴结）的条件，但其他研究已经使用侵入性的方法，图像暴露目标组织在原位 17日，18日，19日，20日，21。其他研究也使用“窗口室模式”，以规避限制，与侵入性方法和有限的成像分辨率在体内 22日，23日，24日，25。在窗口中的腔模型中，一个腔室与一个透明的窗口是在不同的外科手术植入到皮肤租金位置（背侧或耳部皮肤，乳腺脂肪垫，肝等）上的动物（ 如小鼠，大鼠，兔）。虽然这种做法显然使高分辨率成像在体内 ，它需要一个微创手术植入室，可能无法以适应纵向成像研究在数周或数个月22。

这是最近展示了一种微创手术，即移植到前房的眼睛，结合高分辨率的共聚焦显微镜（ACE）提供了一个“自然的身体”窗口“作为一个强大和灵活的体内成像平台，26日，27。移植到ACE在过去的几十年中被用于研究生物方面的各种组织28日，29日，30和其最近的高分辨率成像结合，使胰岛生理研究单细胞分辨率的非侵入和纵向<sup>的26，27。这种方法被用于研究自身免疫反应，在开发过程中的1型糖尿病的动物模型（未发表资料）。它也被用来研究胰腺发育，以及，在肾功能的研究，通过移植到的ACE胰芽或个别肾小球，分别为（未发表的数据）。最近的一份报告使用这种方法进一步证明其研究中的应用胰岛移植31后的免疫反应。更重要的是，本研究表明，移植到的眼球的前房中，提供了一种自然的身体窗口来执行：（1） 在体内的移植组织的纵向的，非侵入性的成像，（2） 在体内 cytolabeling评估细胞表型和生存能力原位 ;（3）实时跟踪，在靶组织中的免疫细胞浸润;（4）通过局部应用或眼内注射的地方干预。

在这里，我们ðemonstrate如何进入前房的眼睛胰岛进行移植。

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Protocol

下的立体镜执行下面的过程，2步，第一步涉及胰岛加载到套管和第二步骤是实际的移植到ACE。对动物进行的所有程序批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC），迈阿密大学的。

1。载入套管用于移植的胰岛

  1. 中心的胰岛细胞在培养皿中通过旋转的菜在缩小圈子。
  2. 断开的“蓄水池”，并将其放置在清洁的表面和连接管的套管套管。水库可以做出来的300微升一次性塑料吸管尖不带过滤器（ 图1a）。
  3. 冲洗气泡时吸进水库的水库，以确保源源不断的小岛。法拉盛水库是通过推动免提电动注射器驱动程序使用的脚踏（ 图1b，c）。这也将在注射器中的空间，以允许吸入的胰岛入储液器（预加载了，如生理盐水，PBS或培养基的无菌溶液）。
  4. 轻轻吸出所需数量的胰岛入水库。胰岛往往会旋转，当他们进入水库，将继续向底部。愿望是做的向后驱动电动注射器使用脚踏板驱动程序。
  5. 插管重新连接到储存器经由所述连接管。
  6. 将导管尖端在培养皿中，并刷新了小岛的水库管，然后在套管。确保小岛留在一起，因为你回填管/套管轻轻“弹”（攻丝）管（ 图1d）。之前或之后的所有气泡停止提前胰岛被冲出插管。如果不能确定，停止小岛的套管剩余的空气进入回气泡领先的胰岛细胞可以帮助防止反流（逆流）的胰岛细胞的ACE。会在一夜之间消失。
  7. 在这个阶段，你准备好注入到的ACE（请参阅下面的步骤）的小岛。

2。胰岛移植到眼睛的前房

  1. 麻醉在一个温暖的鼠标垫在体视镜上。
  2. 将口鼻部的鼠标连接到氧气/异氟醚麻醉机麻醉“面具”。该掩模是做出来的1毫升的一次性塑料移液管尖（不带过滤器），通过麻醉油管连接的窄端（ 图2A，B）。
  3. 轻轻缩回眼睑的眼睛，用另一只手的食指和拇指，“啪”的眼睛了更好的接触和方便地访问（ 图2c）被移植。不妨碍呼吸的鼠标，过大的压力，这将需要一些练习来完善颈部或阻止血液流向头部。
  4. 使用一次性胰岛素注射器（29 - 31G），手术刀，小心地渗透只是冰山在角膜上，使一个单一的横向切口。使切口在角膜和角膜缘的顶点之间的中点位置处，以尽量减少在注射过程中，满分的ACE（ 图2d）回流的胰岛。
  5. 小心通过切口插入套管（预装小岛）。
  6. 慢慢地弹出胰岛的套管和虹膜的顶部将它们存放。为了避免由于过大的压力积聚在ACE的胰岛回流，弹出的小岛在短暂的推力体积小（S）可能在象限相反的切口。这可以进一步确保在加载套管（请参阅第1.6步），通过压缩胰岛管。
  7. 慢慢地缩回套管的ACE。这是关键的一步，特别是，如果将大量的胰岛细胞注射压力由于胰岛回流确保建立内部的ACE可能是不可避免的。为了消除，/尽量减少胰岛回流，轻轻地旋转套管内的ACE释放多余的压力通过切口周围的套管。检查是否有回流的迹象，如果您尝试收回的套管，如果需要的话，等到压力消退之前完全缩回套管的ACE。
  8. 用无菌PBS或生理盐水冲洗移植眼。
  9. 注射丁丙诺啡术后镇痛（0.05-0.1毫克/公斤），皮下的第一个48小时。
  10. 红霉素眼药抗生素软膏后立即移植到移植的眼睛。
  11. 将动物在加热的笼子，让从麻醉中恢复。

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Representative Results

有几个参数来定义一个“好”移植。一个良好的移植是会继续进行，而不会出现出血使切口在视频中可以看出，当一个。出血防止/最小化到ACE仅贯通的手术刀（针）的前端（ 图3a）。这也将有助于防止虹膜的接触和穿刺。它也将确保小切口愈合得很好，而不会造成角膜混浊随着时间的推移（ 图3C，D）。一个成功的移植的另一个重要的方面是可移植的胰岛的总的所需量，而不损失至回流，满分的ACE。协议的步骤1.6中提到的，这可以最小化，通过弹出胰岛尽可能少的量，适用时，使用气泡密封切口在最终收缩套管的ACE（ 图3b）。此外，提供的i的顶部边缘的瞳孔和角膜缘之间的虹膜slets胰岛定位在一个位置，非常适合在体内成像（ 图3d）。从实际的角度来看，在这个中间位置上的虹膜具有胰岛降低成像的z堆栈跨越整个胰岛（ 图4）所需的厚度。荧光共焦/双光子体内成像期间，这是特别重要的，其中一个较小的z堆栈允许在更深的部分成像的组织提供更好的XY和Z决议由于光散射少由组织的特定的荧光信号的更好的恢复。此外，较厚的z栈需要更长的采集时间的可能性增加了的器乐或动物漂移，尤其是在体内成像。

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图1。照片在内的所有部件。我们的移植设备（一）组装的玻璃注射器管，水库，套管的。（二）电动驱动器，注射器的注射器上。（三）双脚踏板操作电动注射器驱动程序。按任一踏板驱动的注射器柱塞向后（吸入）或向前（喷射）（d）关闭的套管和连接管示出在背面填充的套管的胰岛。此配置允许交付胰岛到的眼球的前房中的最小体积，以减少回流和损失的胰岛。

图2
图2。描写的transplantati的进入前房的眼睛（ACE）。程序（一）鼠标麻醉面罩的照片。（二）关闭1毫升一次性塑料吸管尖不带过滤器的麻醉面罩。几个洞尖允许混合氧气与异氟醚之前，鼠标。（c）关闭查看的眼睛暴露了更好的访问被移植。眼睛露出通过拉伸的头部，用拇指和食指的皮肤（四）突出的切口的位置之间的中点的顶点的角膜和角膜缘移植过程的原理描述。穿过该切口插入套管提供胰岛进ACE。胰岛他们灌输虹膜上沉积。

图3 图3。代表图像的“好”移植突出在确保成功的结果的关键步骤（一）系列的图像，示出多远的手术刀（针）的前端被压入，同时使切口的角膜。一个小切口无出血。切口是略大于插管，（b）A系列表示同时使用气泡，防止回流的胰岛被喷出的套管的顶部的虹膜的图像。请注意，“弯曲”在套管内的ACE由于光线折射出现。（c）代表图像的一个突出清晰的ACE移植后的移植眼睛。（D）系列相同的眼睛的图像在指定的收购手术后的天（POD），突出的首选地点的胰岛细胞在体内 IMA晋和切口愈合和本地化，并在6个星期后，移植角膜的清晰度。

图4
图4。代表荧光共聚焦图像的胰岛移植的老鼠的眼睛（ACE）的前房突出的胰岛位置上的虹膜和能力来解决单个细胞在体内成像的好处。（a）最大投影（2 - D视图）的z-堆栈之上的C57BL / 6的表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠，在活化的和记忆T-细胞32的虹膜的胰岛（虚线概述）。一些浸润性T细胞（绿色）进行检测的虹膜周围的胰岛移植后的图像被收购5天。胰岛和虹膜的可视化的激光后向散射或reflection（灰色）。（二）三维（3-D）相同的胰岛突出的好处查看/摄影角度，以减少Z-Stack的厚度，以收购全部的的胰岛量和周围的结构和免疫细胞。请注意的xyz轴的图像旋转。

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Discussion

小鼠胰岛分离使用胶原酶消化其次密度梯度纯化，如前所述，33。胰岛移植前培养过夜。虽然这可能不是必需的，它建议允许从隔离过程中恢复的胰岛。这是因为这将确保幸存的/强大的胰岛细胞移植时，移植糖尿病的收件人进行。

移植全身麻醉下进行，与氧/异氟醚混合物（1.5-3％）吸入效果。可以用来替代吸入或注射麻醉剂（ 例如，氯胺酮）。如果注射麻醉时，请跳到步骤2.2协议。提供了麻醉动物防止在操作过程中的低温热源的。在一些小鼠，它是可能的，以打破血管中的切口时，典型的缺血性合作rnea。例如，角膜裸鼠是血管化的倾向;避免血管区在可能的情况下。每切口，使用新的注射器。避免与针时的切口穿刺虹膜。防止与虹膜接触，可以进一步确保朝向虹膜针尖朝向的斜面侧的。干/不要使切口吸出后房水。这是比较容易穿透插管穿过该切口中的“湿”的角膜;无菌PBS或培养基中加几滴角膜，如果需要的话。

可以通过皮下注射丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/公斤）或的首选镇痛药（S）的第一个48小时的手术后镇痛。在步骤2.9中，我们管理镇痛手术后立即在动物已经深深地在全身麻醉下。然而，如果需要，进行步骤2.9 2.2步后，在协议中，使用或不使用局部麻醉剂的眼睛（请咨询您当地的IACUC或兽医）。也可以用来替代眼科抗生素。

这里，我们使用一个定制的显微注射装置，通过脚踏操作驱动100μl的精密玻璃注射器吸移（负载），并弹出到ACE（ 图1）的套管胰岛。这可以被取代的任何100μl的气密性精密玻璃注射器与螺杆驱动的柱塞，可手动操作吸入/弹出胰岛，不过，这将很可能需要另一人的协助下进行操作。在任一情况下，虽然不是必需的，我们建议预加载组装的注射器，油管，和水库用无菌溶液（生理盐水，PBS或培养基），以确保顺利的愿望和喷射胰岛的。这是特别重要的，如果/当包装小岛堵塞套管。

我们通常内生物安全驾驶室在洁净条件下进行移植手术INET没有感染的风险。所有使用的解决方案，注射器，套管，油管，和纱布高压灭菌或气体消毒。虽然，我们不能确定完全不育，因为手部接触，用鼠标在操作过程中，我们已经没有任何与胰岛污染问题后，上述建议的步骤。

在这里，我们展示了如何成像的目的，需要较少的胰岛移植胰岛移植的ACE。在糖尿病逆转期望的受体动物中的情况下，需要更大范围内的量的胰岛移植26，27。虽然移植的程序是什么，我们在这里显示相同，特别要注意的步骤2.6和2.7的协议，以避免由于回流的胰岛移植的损失。

一旦熟练掌握，移植的程序可以执行，在每只小鼠的〜5分钟。此技术可用于移植到各种tissuES进入前房的眼睛。正如上文所述，我们已移植肾的肾小球，以及在体内的眼球前房中研究胰腺发育的胚胎组织（胰芽）。

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Disclosures

PO.B.是的生物技术公司Biocrine的，这是作为一个商业服务平台，要使用眼的前房的创始人之一。 AC是这项技术的专利保护。

Acknowledgments

我们承认博士。斯蒂芬R.华军莫拉诺，卡米洛里科尔迪，安东内洛Pileggi，Speier和丹尼尔Nyqvist富有成果的讨论。我们也感谢鲁特埃尔南德斯和迭戈·埃斯皮诺萨Heidmann技术援助和麦克·巴尔德斯和玛格丽特福莫苏，具有视频录制的帮助。拜伦马尔多纳多记录，编辑和制作最终的视频。研究提供了支持;美国国立卫生研究院糖尿病研究基金会（ www.DiabetesResearch.org ），美国国立卫生研究院/ NIDDK / NIAID（F32DK083226 MHA RO3DK075487 AC; U01DK089538 PO.B.）。通过资金来自卡罗林斯卡医学院，瑞典研究委员会，瑞典糖尿病基金会，家庭二苓佩尔松基金会，家庭克努特和Alice Wallenberg基金会，瑞泰人寿保险股份有限公司，充满活力的进一步的研究提供了支持PO.B（ FP7-228933-2），卡罗林斯卡研究所战略研究计划在糖尿病itutet，诺和诺德基金会，和泊位冯Kantzow的的基础。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IsoTHESIA (Isoflurane) Buttler Animal Health Supply 11695-6775-2 99.9% Isoflurane/ml
Ketaset (Ketamine HCL) Fort dodge Animal Health 0856-2013-01 Alternative injectable anesthesia
Beprenex (Buprenorphine HCL) Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. 12496-075-7-1 0.3 mg/ml
Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% Akron 17478-070-35 Applied prophylactically to transplanted eye
0.9% Sodium Chloride (Saline) Hospira Inc. 0409-7983-03 For iv injection. Sterile
PBS Gibco 10010-023 1X. Sterile
CMRL medium 1066 Cellgro 98-304-CV Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets

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医药，第73，生物医学工程，免疫学，眼科，外科，钙代谢紊乱，糖代谢紊乱，糖尿病，高血糖，高胰岛素血症，低血糖，肝移植，胰岛细胞，胰岛，眼压，前房，眼，角膜，生活窗口，
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Abdulreda, M. H., Caicedo, A., Berggren, P. O. Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time. J. Vis. Exp. (73), e50466, doi:10.3791/50466 (2013).

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