Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

Summary

biosensors phage ממוסס וחרוזים נוגדנים מסוגלים להבחין בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. לפאגים היו משותקים על ידי שיטת אנגמיור-Blodgett על גבי משטח של חיישן microbalance גביש קוורץ ועבדו כבדיקות סטפילוקוקוס מגוון רחבות. חרוזים נוגדנים לזהות MRSA.

Abstract

Bacteriophage ממס הפך מבני שיש מגוון רחב של זני מארח סטפילוקוקוס וחלבון פניצילין מחייב (PBP 2a) חרוזים לטקס מצומדות נוגדנים כבר נוצלו ליצירת biosensor המיועד לאפליה של Methicillin עמיד (MRSA) ו-S רגיש (MSSA) . מיני aureus ^1,2. לפאגים ממוסס הוסבו spheroids phage על ידי מגע עם ממשק מים, כלורופורם. monolayers אליפטית הפאג הועברה על גבי משטח biosensor על ידי טכניקת ³ אנגמיור-Blodgett (LB). את biosensors נוצר נבחן על ידי microbalance קוורץ גביש עם מעקב פיזור (QCM-D) כדי להעריך אינטראקציות חיידקים-phage. אינטראקציות חיידקים אליפטית הובילו לתדר תהודה מופחת ועלייה באנרגיה פיזור עבור שניהם זני MRSA ו MSSA. לאחר מחייב חיידקים, חיישנים אלה נחשפו בהמשך לפניצילין, מחייב חלבון נוגדן לטקס חרוזים. חיישנים ניתח עם MRSA הגיבו לPBP חרוזים נוגדני 2a; למרות חיישנים נבדקו עם MSSA לא נתנו שום תגובה. הבחנה ניסיונית זו קובעת חד משמעית אפליה בין methicillin עמיד וס הרגישים זני סטפילוקוקוס. מחויב באותה מידה ולא כרוך bacteriophages לדכא התפתחות חיידקים על משטחים ובהשעיות מים. ברגע שהם שינו phages ממוסס לתוך spheroids, הם שומרים על פעילות ממס החזקה שלהם ולהראות יכולת ללכוד חיידקים גבוהה. ניתן יהיה לנצל את spheroids phage והפאג לבחינות ולעיקור של מיקרואורגניזמים עמידים לאנטיביוטיקה. יישומים אחרים עשויים לכלול שימוש בטיפול bacteriophage ומשטחי מיקרוביאלית.

Introduction

זנים עמידים של סטפילוקוקוס Methicillin הוצעו כגורם חיוני בזיהומים והתפרצויות nosocomial ^4-8. דרכים נפוצות להכרה בהתנגדות methicillin, כגון בדיקת דיסק דיפוזיה oxacillin אגר מסך, או microdilution מרק, להסתמך על תנאי תרבות מותאמים כדי לשפר את הביטוי של התנגדות. שינויים כוללים ניצול של oxacillin, דגירה על 30 או 35 מעלות צלזיוס ולא 37 מעלות צלזיוס, וההכללה של NaCl למדיום הגידול. יתר על כן, לזיהוי נכון של סוגים של טכניקות אלה, תקופת דגירה ארוכה של 24 שעות, במקום 16 עד 18 שעות נדרשת. טכניקות מהירות עם רמה (> 96%) מתאימה לרגישות לזיהוי של התנגדות methicillin כוללות טכניקות microdilution אוטומטיות כגון כרטיס יטק GPS-SA, מערכת Staph ATB המהירה, ומערכת לוח Microscan המהירה אשר מייצרות תוצאות לאחר 3-11 שעות ^9-11. קריסטל M RSA מזהה מערכת היא שיטה מהירה המבוססת על הכרה בצמיחתו של ס ' aureus בנוכחות של 2% NaCl ו 4 מ"ג של oxacillin לליטר עם חיישן חמצן הקרינה רגיש. רגישויות טענו נעות בין% 91 עד 100 לאחר 4 שעות של דגירה ^12-14. שיטות פנוטיפי אלה מוגבלות בדיוקים שלהם על ידי ההשפעה של זנים נפוצים שמבטאים התנגדות הטרוגנית. לכן, השיטות הטובים ביותר המקובלת להכרה בהתנגדות methicillin היא ההכלאה PCR או DNA של גן Meca ^15. עם זאת טכניקה זו דורשת ה-DNA מטוהר והוא רגיש מאוד למוספים שונים (זיהומים), הכוללים ¹⁶ פסולת תא.

יתר על כן, שיטות אלה צריכים זמן רב לבצע. אסטרטגיות להכרה של מוצר גן Meca, 2a PBP החלבון, יכולה להיות מנוצלים כדי לקבוע התנגדות ועשויות להיות אמינה יותר בהשוואה לשיטות בדיקה רגילה ^17.

<p clasS = "jove_content"> זה היה שהוצג קודם לכן, כי יכול להיות מנוצל bacteriophage 12600 כמו בדיקה לזיהוי זני סטפילוקוקוס, כולל אלה שיש methicillin התנגדות ^1,2,18. בעבודה זו אנו מציעים שיטה חדשנית בהכרה הספציפית וזיהוי של MRSA, כגון הכרה בחיידקים יחד עם קונפורמציה של MRSA בזמן אמת. למטרה הספציפית הזה ס (PBP 2 א) היה בשימוש bacteriophage aureus עם ספקטרום רחב של מארחים (כולל זני MRSA) בשילוב עם נוגדן חד שבטי כנגד חלבון. PBP 2a הוא חלבון דופן תא ואת זה הוא הגורם של התנגדות לאנטיביוטיקה של MRSA. עם זאת נוגדן 2a PBP אינו ספציפי עבור ס aureus מאז כמה חיידקים אחרים יש חלבונים מחייבים אנטיביוטיקה עם דמיון רצף לPBP 2a ^19,20. כתוצאה מכך בעבודה זו, ש ' היו בשימוש bacteriophage aureus ונוגדנים כנגד חלבון 2a PBP. כדי להיות מסוגל לפתח biosensor לספציפיקאלי לאתר ולזהות MRSA מכשיר עם פעולת שני שלבים נוצלה. הצעד הראשון בשימוש ס monolayer aureus bacteriophage כמו בדיקה חיישן, ואילו בשלב השני הועסק 2a נוגדנים ספציפיים PBP. לכן, צעד אחד יכיר ס חיידק סטפילוקוקוס, כאחד האחר יהיה רגיש לחלבון לאנטיביוטיקה המחייב. כאשר אותות שהתקבלו משני צעדים הם חיוביים, הוא מציין את הגילוי הספציפי של MRSA.

Protocol

1. הכין את הקרקע השג סוג זן ס aureus ATCC 12600, ש ' aureus 27690 וBacillus subtilis ATCC ATCC 6051. זנים עמידים methicillin של ס ' aureus – MRSA1, 2 MRSA, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, 34 MRSA, MRSA 45, ב ' anthracis סטרן, סלמונלה typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia ente…

Representative Results

הפאג הוכיח פעילות ממס נגד כל הזנים שנבדקו של ס ' aureus, כולל זני MRSA, כפי שעולים מבדיקת מקום הפאג. גדלי פלאק בדרך כלל נע בין 5 עד 15 מ"מ. לא נמצאה פעילות נגד בדיקת תרבויות אחרות (טבלת 1). צמיחה נורמלית של ס ' aureus ATCC 12…

Discussion

זה ידוע היטב כי phages יכול לשמש כבדיקות biosensor לחיידקים פתוגנים ^28. זה בא לידי הביטוי בעבודה זו, שיכול להיות מנוצל הפאג יחד עם נוגדני 2a PBP כדי לפתור את הבעיה הישנה: זנים עמידים ורגישים אנטיביוטיים מהירים אפליה.

נמצא עם זאת phages staphyl…

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools