Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

Biosensori fagi litici e perline anticorpi sono in grado di discriminare tra resistente alla meticillina (MRSA) e batteri di stafilococco sensibili. I fagi sono stati immobilizzati con un metodo Langmuir-Blodgett su una superficie di un sensore microbilancia cristallo di quarzo e lavorato come larghe sonde stafilococco gamma. Perle di anticorpi riconoscono MRSA.

Abstract

Un batteriofago litico strutturalmente trasformato avere una vasta gamma di ospiti di ceppi di Staphylococcus aureus e di una proteina legante la penicillina (PBP 2a) anticorpi coniugati perle di lattice sono stati utilizzati per creare un biosensore progettato per la discriminazione di meticillino-resistente (MRSA) e sensibile (MSSA) S . specie aureus 1,2. I fagi litici sono state convertite in sferoidi fagiche dal contatto con all'interfaccia acqua-cloroformio. Fago monostrati sferoidali sono stati spostati su una superficie biosensore da Langmuir-Blodgett (LB) tecnica 3. I biosensori creati sono stati esaminati da una microbilancia cristallo di quarzo con il monitoraggio di dissipazione (QCM-D) per valutare le interazioni batteri-fagi. Interazioni batterio-sferoidali portato alla frequenza di risonanza ridotta e un aumento della dissipazione energetica per entrambi i ceppi MRSA e MSSA. Dopo il legame batterico, questi sensori sono stati ulteriormente esposta alla penicillina-binding protein anticorpo lattice tallones. Sensori analizzati con MRSA hanno risposto a PBP 2a perline anticorpi, anche se i sensori controllati con MSSA hanno dato alcuna risposta. Questa distinzione sperimentale determina una discriminazione univoca tra resistente alla meticillina e S. sensibile aureus. Altrettanto legati e non legati batteriofagi sopprimere la crescita batterica sulle superfici e nelle sospensioni idriche. Una volta che i fagi litici vengono trasformati in sferoidi, conservano la loro forte attività litica e mostrano un'elevata capacità di cattura batterica. Il fago e fago sferoidi possono essere utilizzati per il test e la sterilizzazione di microrganismi resistenti agli antibiotici. Altre applicazioni possono includere l'uso in terapia batteriofago e superfici antimicrobiche.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ceppi meticillino-resistenti di Staphylococcus aureus sono stati suggeriti come fattore di infezioni essenziali e le epidemie nosocomiali 4-8. Modi comuni di riconoscimento di resistenza alla meticillina, come la diffusione oxacillina prova schermo agar disco, o brodo microdiluizione, affidano a condizioni di coltura su misura per migliorare l'espressione di resistenza. Alterazioni comprendono l'utilizzo di oxacillina, incubazione a 30 o 35 ° C invece di 37 ° C, e l'inclusione di NaCl al mezzo di crescita. Inoltre, per una corretta rilevazione da questi tipi di tecniche, un lungo periodo di incubazione di 24 ore anziché 16 a 18 ore è necessaria. Tecniche rapide con appropriato livello (> 96%) di sensibilità per l'identificazione di resistenza alla meticillina comprendono tecniche microdiluizione automatici come il Vitek GPS-SA card, il sistema Rapid ATB stafilococco, e il sistema pannello Rapid Microscan che producono risultati dopo 3-11 ore 9-11. The Crystal MID sistema RSA è un metodo rapido basato sul riconoscimento della crescita di S. aureus in presenza di 2% di NaCl e 4 mg di oxacillina per litro con un sensore di fluorescenza sensibili all'ossigeno. Sensibilità rivendicati variano tra il 91 e il 100% dopo 4 ore di incubazione di 12-14. Questi metodi fenotipici limita le precisioni dall'impatto di ceppi prevalenti che esprimono resistenza eterogenea. Pertanto, i metodi più ampiamente accettato per il riconoscimento della resistenza alla meticillina è PCR o ibridazione DNA del gene mecA 15. Tuttavia questa tecnica richiede DNA purificato ed è estremamente sensibile a vari additivi (impurità), che includono cellule detriti 16.

Inoltre, queste tecniche hanno bisogno di molto tempo per eseguire. Strategie per il riconoscimento del prodotto del gene mecA, proteina PBP 2a, potrebbero essere utilizzati per determinare la resistenza e possono essere più affidabile rispetto alle tecniche di prova standard 17.

di Staphylococcus aureus compresi quelli aventi resistenza alla meticillina 1,2,18. In questo lavoro abbiamo proposto una nuova tecnica nel riconoscimento specifico e la rilevazione di MRSA, come ad esempio il riconoscimento di batteri con conformazione di MRSA in tempo reale. Per questo scopo specifico di una S. batteriofago aureus con un ampio spettro di ospiti (tra cui i ceppi di MRSA) in combinazione con anticorpi monoclonali contro la proteina (PBP 2a) sono stati utilizzati. PBP 2a è una proteina della parete cellulare ed è la causa di antibiotico resistività di MRSA. Tuttavia PBP 2a anticorpo non è specifico per S. aureus da altri batteri sono proteine ​​leganti antibiotici con similarità di sequenza di PBP 2a 19,20. Di conseguenza, in questo lavoro, S. aureus batteriofago e anticorpi contro proteine ​​PBP 2a sono stati utilizzati. Per essere in grado di sviluppare un biosensore per specificamente rilevare e identificare MRSA un dispositivo con un due stadi è stato utilizzato. Il passo iniziale utilizzato un S. aureus batteriofago monostrato come sonda sensore, mentre la seconda fase impiega anticorpi specifici PBP 2a. Pertanto, passo uno riconosceranno S. aureus batteri, come l'altra saranno sensibili alla proteina antibiotico-binding. Quando i segnali ricevuti da due passi sono positivi, indica il rilevamento specifico di MRSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ponendo le basi

  1. Ottenere tipo ceppo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e di Bacillus subtilis ATCC 6051. Ceppi meticillino-resistenti di S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Il fago litico 12600.
  2. Ottenere PBP 2a anticorpi coniugati perle di lattice.
  3. Preparare NZY media come descritto 21.
  4. Ottenere Soluzione tampone fosfato (PBS).
  5. Preparare acqua deionizzata come sottofase di Langmuir-Blodgett (LB) monostrato deposizione.

2. Batteriofago Propagazione e titolazione

  1. Incubare 5 ml di coltura durante la notte di S. aureus ATCC 12600 (3.6 x 10 8 unità formanti colonie (CFU) / ml) con 500 ml di fago (3 x 10 9 </ Sup> PFU / ml) in 500 ml di mezzo NZY in 2 L Flack su agitatore-incubatore a 37 ° C durante la notte.
  2. Centrifugare coltura a 4.424 xg per 10 min a 4 ° C.
  3. Supernatante re-centrifugati a 11.325 xg per 10 min a 4 ° C.
  4. Filtrare il surnatante attraverso un filtro Millipore 0,22 micron.
  5. Centrifugare il filtrato a 75.395 xg per 1,5 ore.
  6. Sciogliere pellet in 100 ml di acqua distillata.
  7. Preparare diluizioni di 10 volte di sospensione fago in media NZY.
  8. Piastra 1 ml di una notte (ON) la cultura di S. aureus ATCC 12600 su ciascuna delle due piastre con agar NZY per assicurarsi che tutta la superficie è coperta. Rimuovere l'eccesso di cultura e di lasciare che la superficie asciutta per 30 min.
  9. Individuare un campione (10 microlitri) di diluizione appropriata fago sulla superficie della piastra e incubare a 37 ° C per 18-24 ore.
  10. Esaminare la formazione di placche e calcolare il titolo fago. Batteriofago titoli (T) viene stimato sulla base del numero di pLaques (N) formate per 10 microlitri di volume (v) di sospensione fago e il fattore di diluizione (F). Il titolo è stato calcolato con la formula:. T = N / (VXF) Ad esempio, per il numero di placche 75 alla diluizione 10 -7 e il volume 10 microlitri (10 x 10 -3 ml), il titolo è uguale 75 / (10 x 10 x 10 -3 -7) = 7,5 x 10 10 unità formanti placche (PFU) per ml di sospensione.

3. Phage Gold-immobilizzato

  1. Pezzi di quarzo oro rivestite Clean (60 mm 2) di incisione al plasma in argon per 10 minuti e poi sterilizzare per 6 ore sotto la luce UV in un armadio sterile.
  2. Aggiungere 50 microlitri di 1 x 10 9 PFU / ml sospensione fago alla superficie d'oro di ogni pezzo in una piastra di Petri sterile, e poi incubare una notte in una camera umida a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere e titolo per il restante sospensione fago.
  4. Lavare pezzi con fago rilegato 5 volte con PBS per rimuovere non legatofago.

4. Test di Immobilizzato infettività Phage su una superficie asciutta

  1. Diffondere una cultura O / N di S. Aureus ATCC 12600 su una piastra di agar NZY e lasciare asciugare.
  2. Posizionare un pezzo d'oro con fago immobilizzato sul viso piatto verso il basso.
  3. Osservare una zona di lisi dopo 12 ore di incubazione a 37 ° C che indica infettività.
  4. Utilizzare pezzi coperti d'oro senza fago in esperimenti di controllo.

5. Test di attività litica del fago libero e legato a liquido

  1. Aggiungi una cultura ON di S. aureus ATCC 12.600-10 ml di NZY in ogni dei quattro beute da 300 ml sidearm (6 x 10 6 UFC / ml in ciascun pallone).
  2. Aggiungi In due palloni 2 x 10 6 PFU / ml di fago libero.
  3. Usare gli altri due palloni come controlli.
  4. Monitorare l'andamento nel tempo di S. lisi cellulare aureus per 570 min a misura di densità ottica (OD 600) ad intervalli di 30 min per tutte le beute.
  5. Effettuare una misurazione finale a 24 hr.
  6. Ripetere i passaggi 5,1-5,5, ma utilizzare pezzi d'oro con i fagi legati invece di fagi gratuiti e monete d'oro senza fago in flaconi di controllo.

6. Perdita di fagi Bound durante l'incubazione

  1. Aggiungere 50 ml di 1 x 10 9 PFU / ml fago sulla superficie del pezzo oro sterile in una piastra di Petri che è posto in una camera umida notte a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere la sospensione con non legato fago dalla superficie d'oro e titolo.
  3. Lavare il pezzo d'oro con fago bound 5 volte con PBS e posto in 1 ml di soluzione NZY in 15 ml di tubo in agitatore-incubatore a 37 ° C per 8 ore.
  4. Determinare il titolo del fago distaccato come descritto in 2.

7. Phage Spheroids Preparazione

  1. La combinazione di 400 ml di magazzino fago 12600 sospensione (10 11 PFU / ml) con un uguale volume di cloroformio spettrofotometrica di grado in 1 ml fialaa temperatura ambiente.
  2. Delicatamente vortice della sospensione fago-cloroformio 5-6 volte (intervalli di 5 secondi), più di un minuto nella durata.
  3. Consentito la sospensione di stabilizzare per 30 sec e poi pipetta della fase superiore contenente sferoidi è stato dispensato off per la preparazione monostrato.
  4. Richiedere alcuni microlitri della sospensione sferoidi per la trasmissione e la microscopia elettronica a scansione.
  5. Utilizzare un residuo sospensione sferoide per la produzione di biosensori.

8. Preparazione biosensore

  1. Pulire i sensori QCM-D di incisione al plasma in argon per 10 minuti PDC-32G Harrick pulitore plasma.
  2. Risciacquare sensore con esano per rimuovere eventuali impurezze organiche.
  3. Preparare e pulire un trogolo del saldo pellicola come descritto in 22.
  4. Riempire LB attraverso una soluzione sottofase e pulirlo con una barriera depressione e stabilizzare la vasca a 20 ± 0,1 ° C
  5. Distribuire 300 ml un'aliquota del fago 12600 in acquosa suspension (10 11 PFU / ml) su LB sottofase.
  6. Preparare fago monostrato sulla soluzione sottofase LB permettendo 300 microlitri aliquota di fago 12600 sospensione acquosa (10 11 PFU / ml) a correre giù una bacchetta di vetro bagnabile inclinato che è parzialmente immerso nella sottofase 22,23.
  7. Stabilizzare il monostrato preparata per 10 minuti, e poi comprimerlo ad una velocità di 30 mm / min (45 cm 2 / min) fino ad una pressione costante di 19 N / m è raggiunto.
  8. Eseguire una deposizione di film sulla verticale perpendicolare realizzata sensore QCM-D ad una velocità di 4,5 mm / min in successione immersione sensore in e fuori del monostrato sette volte. Microscopia elettronica di monostrati depositati fago prima esposizione a campioni batterici mostrato che gli strati erano continui, omogeneo e uniforme (dati non mostrati).
  9. Ripetere i passaggi 4,5-4,8 con una sospensione sferoide fago che viene preparato in 3.
  10. Utilizzare biosensori fago fabbricato per MRSA rilevazione, elettronemicroscopia, e ellissometria.

9. Test biosensore, la discriminazione di meticillino resistente e batteri di stafilococco sensibili

  1. In questo protocollo, biosensori con non modificato e modificato fago e sferoidi fagi sono preparati. Un microbalance cristallo di quarzo con quattro camere di flusso del sensore è utilizzato per monitorare legame dei batteri al fago immobilizzato sulla superficie del sensore QCM. PBP 2a anticorpi coniugati perle di lattice sono utilizzati per discriminare tra resistente alla meticillina (MRSA) e batteri di stafilococco sensibili. Tutte le misurazioni sono condotte nel modo di flusso (50 microlitri / min) a 5 MHz.
  2. Stabilire una linea di base frequenza di risonanza del sensore QCM in acqua (~ 30 min).
  3. Disegnare una sospensione di live meticillina sensibili stafilococco cellule batteriche in acqua (10 9 CFU / ml) attraverso la cella di prova.
  4. Continuamente monitorare i cambiamenti nella frequenza di risonanza sensori e dissipazione di energia per la prima armonica, USIng il software Q-Soft.
  5. Quando le variazioni della frequenza di risonanza sensori e dissipazione raggiunto livelli di saturazione, aggiungere la sospensione di PBP anticorpo coniugato perle di lattice (6,77 x10 10 perline / ml) per il flusso durante il monitoraggio continuo della frequenza e dissipazione.
  6. Ripetere i passaggi 9,2-9,5 per stafilococco meticillino-resistenti cellule batteriche (MRSA).
  7. Definire una variazione di frequenza attraverso la variazione di massa dovuta a batteri cogenti del Sauerbrey equazione 24,25 Af = Δm-xn / C, dove C è la sensibilità di massa costante (C = 17,7 ng x cm x -2 -1 Hz a 5 MHz ), m è la massa ed n è il numero armonico (n = 1).
  8. Definire un cambiamento dissipazione energetica (Δ D) dalla registrazione il decadimento esponenziale di oscillazione (frequenza e ampiezza smorzamento, che ha permesso la quantificazione dell'energia dissipata e immagazzinato durante un periodo di oscillazione,E dissipata ed E memorizzati, rispettivamente: Δ D = E dissipata / 2 πE memorizzato. Δ S è misurata in unità di dissipazione (DU), uno = 10 -6 unità relative DU).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il fago dimostrato attività litica contro tutti i ceppi testati di S. aureus, compresi i ceppi di MRSA, come indicato dallo spot test fago. Dimensioni della placca in genere variavano da 5 a 15 mm. Nessuna attività è stata trovata contro altri test-culture (Tabella 1).

Una crescita normale di S. aureus ATCC 12600 in terreno NZY on-agitatore incubatore a 37 ° C è mostrata nella Figura 1A (una curva etichettato da cerchi vuoti). Il numero di batteri aumentato da 3,2 x 10 6-4,0 x 10 8 UFC / ml. Figura 1A (una curva etichettato da cerchi pieni) mostra risultati del co-coltivazione di 2,0 x 10 6 PFU / ml libero fago aggiunti contemporaneamente al stessa concentrazione di S. aureus ATCC 12600. Fago, immobilizzato sulla superficie di oro, ha dimostrato l'attività litica comparabile con l'attività di fago in sospensione (Figura 1A, curva denominata dai migliori triangoli giù). Fago rimase immobilizzato infettivo quando il pezzo oro con fago è stato impiegato a 24h esperimento crescente, poi è stata lavata 5 volte in PBS e conservato per 6 giorni a 4 ° C, ed infine riutilizzati con una sospensione batterica fresca. (Figura 1A, curva etichettata dai migliori triangoli in su). Sembra che i fagi immobilizzati iniettano il loro DNA nei batteri, lasciando capsids vuoti, che sono incapaci di infettare nuovi batteri. Ipotizziamo che fagi immobilizzati su una superficie d'oro servite come "catalizzatori" primari da infettare alcuni batteri, che generano fagi liberi quelli a sua volta infettare nuove batteri e così via. Pertanto, la maggior parte di fagi immobilizzati non servivano probabilmente in un primo 24 hr crescente esperimento e, pertanto, può essere utilizzata una seconda volta. La densità di superficie di fagi depositati da adsorbimento fisico è stato di circa 0,7 ~ fago particella / micron 2. Questa concentrazione è elevata, ma può crescere fino a 10 volte 2. Pertanto, la piastra oro potrebbe incorporare some dei fagi vitali liberi rilasciati dai batteri infetti nelle prime 24 ore in crescita esperimento.

Figura 1B mostra la zona di lisi intorno al pezzo oro, il che indica che i fagi immobilizzati erano capaci di lisare cellule batteriche. Negli esperimenti di controllo, la targa d'oro vuota non ha inibito la crescita batterica. Quindi la effettiva diminuzione della crescita batterica trovato al co-coltura di batteri e fagi immobilizzato è risultato di interazione primaria di acqua batteri in sospensione e fago rilegato come mostrato nella Figura 1C. Il fago distacco dalla superficie di oro durante la co-incubazione del fago e batteri bound era piccolo. Al fine di stimare il numero di fagi sono stati stacca dalla superficie d'oro durante l'incubazione, i campioni con fago bound sono stati immersi in soluzione NZY, agitato nello shaker-incubatore a 37 ° C per 8 ore, e una concentrazione fago gratuito in surnatante è stato valutato. Abbiamo determinato che 4,1 x 10 7 PFU erano bound per un mm 2 pezzi 60 oro (~ 0,7 fago particella / micron 2), quando solo 3 x 10 4 PFU sono state staccate (0,007% distacco).

La trasmissione e scansione micrografie elettroniche di intatta fago litico 12600 sulla superficie del substrato oro è mostrato nelle Figure 2A e 2B. Quando la sospensione fago è stato sottoposto a trattamento cloroformio, l'aspetto fisico fago è stato cambiato. La coda contratta in lunghezza e addensato. La testa poligonale divenne arrotondata (figure 2D e 2E). Abbiamo chiamato il fago litico strutturalmente modificato "sferoide" simile al nome del cloroformio trattata fago filamentoso 26. Nonostante i significativi cambiamenti strutturali provocato dal trattamento cloroformio, l'attività litica sferoide misurata dal numero di placca non è cambiata (Figure 2C e 2F). L'attività media litico del fago e sferoidi sono stati (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) e (7,5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7), PFU / ml. Al livello 0,05, le attività del fago e sferoidi non erano significativamente differenti (Figura 2C e 2F).

I sensori QCM con fagi litici immobilizzati non hanno mostrato variazioni significative nella frequenza di risonanza o di dissipazione di energia quando sono stati esposti a MRSA (Figura 3A). Questi dati indicano che l'interazione MRSA / fago ha determinato un cambiamento non di massa secondo la QCM, eppure le micrografie elettroniche di pubblicare biosensori dosati rivelato significativo legame batterica alla superficie del sensore (Figura 3B).

Quando sospensioni MRSA sono state iniettate nella cella di flusso con fagiche biosensori sferoidali, una sostanziale diminuzione della frequenza (f Δ ≈ -105 Hz) e un aumento della dissipazione (ΔD ≈ 26 DU) sono stati osservati (Figura 3C). A seguito dei fagi sferoide-batteriche (MRSA) interazioni di legame, dosati SEnsors stati esposti a PBP2a anticorpo coniugato perle di lattice sospensioni. Questi biosensori MRSA dosati risposto L'anticorpo coniugato perle sospensioni lattice PBP2a, poiché una ulteriore diminuzione della frequenza (f Δ ≈ -45 Hz) e un aumento della dissipazione (ΔD ≈ 15 DU) sono stati osservati (Figura 3C). Il legame di MRSA per fago sonde e PBP2a anticorpi coniugati perle di lattice è stata confermata mediante scansione indagini di microscopia elettronica (Figura 3D).

Quando lo sferoide biosensore fago è stato esposto a sospensioni MSSA, una sostanziale diminuzione della frequenza (f Δ ≈ -200 Hz) e un aumento della dissipazione (ΔD ≈ 55 DU) sono stati osservati (Figura 3E). A seguito dei fagi sferoide-MSSA interazioni di legame, sensori analizzati si sono sfidati con PBP2a anticorpi coniugati perle di sospensioni in lattice. Inizialmente, il MSSA dosati biosensore ha mostrato brevi transitori diaumentare in frequenza e per diminuire in dissipazione. Dopo qualche minuto di MSSA e PBP2a anticorpi coniugati perle di lattice interazioni, frequenza tornato a postare PBP2a livelli introduzione di anticorpi, ma l'energia dissipativa aumentato (Figura 3E). Il legame di MSSA di sonde fagi è stata confermata con la microscopia elettronica a scansione, ma non vincolante tra MSSA e PBP2a anticorpi coniugati perle di lattice è stato osservato (Figura 3F). Spessore profilo ellissometriche, mappa 3D dello spessore di fagi litici e batteri stafilococco sono mostrati nelle figure supplementari S1 e S2.

A seguito di contatti dei sensori con LB fagi o sferoidi immobilizzati alla sospensione di 10 9 cellule / ml di MRSA o MSSA, i batteri sono stati osservati per legare fagi o sferoidi a densità (ρ) di 9,1 x 10 7 (MRSA / fagi intatte), 7,9 x 10 7 (MRSA / sferoidi), e 7,2 x 10 7 (MSSA / sferoidi) cellule / cm 2. Intest utilizzando 5 diversi fagi litici e 2 batteri ospitanti 27, ricercatori hanno sottoposto i fagi immobilizzati con il metodo di legame covalente a 10 9 cellule / ml di batteri, e determinato l'efficienza di cattura dei fagi in una serie di (2,5-8,9) x 10 5 cellule / cm 2 . Il rendimento di cattura fago presentata in questo lavoro è ~ 100 volte superiore.

Host Scolare Dettagli Strain Sensibilità alla meticillina Sensibilità Phage
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
S. aureus 10497 IA S +
S. aureus 10686 IA S +
S. aureus MRSA 1 AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
S. aureus MRSA 5 AU R +
S. aureus MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
S. aureus MRSA 34 AU R +
S. aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis Sterne AU NA -
Salmonella typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri sconosciuto AU NA -
Yersinia enterocolitica sconosciuto AU NA -
Proteus mirabilis sconosciuto AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tabella 1. Fago 12600 sensibilità di s battericatreni IA - isolati da animali,. AU - batterica raccolta cultura della Auburn University, NA - non applicabile; una - attività litica del fago è stato definito dalla formazione di placche, +, sensibile, -, non sensibile. Culture durante la notte di ceppi testati sono stati piastrati su piastre di agar NZY. Dopo che la superficie essiccata, un campione (10 microlitri) di 10 11 PFU fago sospensione è stato avvistato sulla superficie della piastra. Piastre sono state incubate a 37 ° C per 18-24 ore. Attività litica dei fagi è stata rilevata dalla formazione di placche.

Figura 1
Figura 1. Proprietà infettive del legato e libero fago. A. La crescita batterica in assenza (cerchi vuoti) e presenza (cerchi pieni) di fago libero, in presenza di fagi legati alla superficie d'oro (alto fino triangles), e in presenza di fagi legati alla superficie d'oro dopo 6 ore a 4 ° C (top down triangoli). Inserto: La linea (1) mostra un fit lineare dei dati di crescita dei fagi non sperimentali per l'equazione (4) (R = -0.99, p <0,0001). La linea (2) mostra fit dei dati sperimentali di crescita batterica in presenza fago libero alla stessa equazione. Costante crescita batterica (k) in assenza e in presenza di fago libero, sono uguali 0.88 e 0.64, (-0,048, fase di declino). Dati rappresentativi di tre esperimenti indipendenti sono mostrate nel pannello A. A medi relativi Errore OD 600 misurazioni non superiore al 5%. B. Phage immobilizzato alla superficie d'oro è infettivo come indicato dalla zona di lisi attorno al pezzo oro. 1 - il frammento della piastra di agar con batteri; 2 - il pezzo oro con fago immobilizzato;. 3 - la zona di inibizione intorno al pezzo dell'oro C. Rappresentazione schematica del batterio lisi da fago attaccato alla superficie d'oro. 1 -oro rivestite pezzo di quarzo, 2 - fago legata alla superficie d'oro, 3 - batterio ancorato da fagi bound, 4 - fagi liberi hanno rilasciato da scoppio batterio infetta. Usato con il permesso di: Guntupalli, R., et al 2012.. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. Proprietà del fago intatto e modificato A e B - La trasmissione e la scansione al microscopio elettronico del fago intatto, rispettivamente,.. C - fago attività litica su una piastra di agar con MRSA D ed E - Trasmissione e la scansione al microscopio elettronico di sferoidi fago intatti, rispettivamente; sferoidi fagi litici a - Fctivity su una piastra di agar con MRSA. L'attività media del fago e sferoidi sono (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) e (7,5 ± 1,0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / ml. T-test: t = 0,15682, p = 0,87851. A livello di 0,05, le attività del fago e sferoidi non sono significativamente differenti. Bar: A, B, D, ed E: 200 nm. Usato con il permesso di:. Guntupalli, R., et al 2012.

Figura 3


Figura 3. Batteri combinati QCM-D e analisi EM di interazioni fago-batteri. Stati consegnati al sensore a concentrazione di 10 9 UFC / ml sospensioni in acqua ad una portata di 50 microlitri / min. 1, 2 rappresentano cambiamenti nella frequenza di risonanza e la dissipazione di energia, rispettivamente. A. Phage rivestita risposta del sensore QCM-D per MRSA. Freccia indica tegli MRSA tempo di consegna per la superficie del sensore. B. scansione al microscopio elettronico di messaggi analizzati MRSA associato a fago litico immobilizzato sul sensore QCM. M-MRSA, P-fagi sulla superficie del sensore. C. risposte successive del fago sferoidi rivestito sensori QCM-D per MRSA e poi a PBP perline anticorpo. Le frecce indicano MRSA e PBP anticorpo tempo di consegna per la superficie del sensore, rispettivamente. D. scansione al microscopio elettronico di messaggi analizzati biosensore con sferoidi fago, MRSA, e perle di anticorpi PBP. Frecce spesse e sottili spettacoli tipici delle cellule MRSA e anticorpi tallone, rispettivamente. E. risposte successive del sferoidi fago rivestito sensori QCM-D a S. aureus, quindi a PBP perline anticorpali. Le frecce indicano S. aureus e PBP anticorpo tempo di consegna per la superficie del sensore, rispettivamente. F. scansione al microscopio elettronico di messaggi analizzati biosensore con sferoidi fagi, S. aureus, e PBP perle di anticorpi. Frecce spesse e sottili spettacoli tipici S. cella aureus e anticorpi tallone, rispettivamente. Usato con il permesso di: Guntupalli, R., et al 2012.. Clicca qui per ingrandire la figura .

Dati supplementari

Figura S1
Figura S1. Complementare Figura 1. (A) e (b) sono un profilo di spessore ellissometrico e spessore mappa 3D di un fago litico, rispettivamente (indice di rifrazione effettivo = 1.05). Profili di spessore mostrano media RMS rugosità, minimo e massimo spessore del monostrato,. Una linea attraverso la mappa spessore è stato elaborato per generare il profilo di spessore.

50474/50474figs2.jpg "/>
Figura S2. Supplementare Figura 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

E 'noto che i fagi possono essere usati come sonde biosensore per patogeni batterici 28. Si dimostra in questo lavoro che fago insieme con anticorpi PBP 2a può essere utilizzata per risolvere il vecchio problema: ceppi resistenti e sensibili agli antibiotici discriminazione rapidi.

Si è riscontrato però quelle normali fagi stafilococciche non modificate non sono adatti al rilevamento batteri con i dispositivi QCM, anche se si legano batteri. La coda fago è così lunga che le onde acustiche non possono "raggiungere" i batteri legati alla fine della coda dei fagi. Questa condizione ha comportato un effetto "massa mancante" 29 e l'incapacità di registrare frequenza di risonanza e cambiamento dissipazione nonostante il legame significativo mostrato da EM immagini (Figure 3A e 3B). Questo problema è stato risolto facilmente sostituendo il fago intatta con sferoidi, il fago modificato mediante trattamento cloroformio-acqua. Questo trattamento ha determinato p pienamente funzionalehage con corto, spesso e non flessibile coda (figure 2D, 2E e 2F). Quando fagi sono stati sostituiti con sferoidi in biosensori, l'MRSA sono stati facilmente rilevato da dispositivo QCM-D.

Quando le particelle dei fagi sono stati destinati a superfici d'oro ad un corretto orientamento, i loro recettori erano accessibili ai batteri ospitanti. Se il contatto fisico diretto tra una superficie solida con fagi e uno strato batterico secca si verifica, i fagi immobilizzati sono in grado di iniettare genoma virale in batteri ospitanti (Figura 1C). Questi risultati concordano bene con quelli ottenuti con fagi litici immobilizzati alle superfici del disco di vetro da una tecnica di legame covalente 27. La capacità di rilegati fagi litici di catturare batteri ospitanti sono stati dimostrati anche utilizzando una tecnica di immobilizzazione fago biotinilato 30. Al contrario, un metodo molto semplice adsorbimento fisico per fissare fagi correttamente orientate a superfici solide è stato utilizzato 31. Tegli elevata efficienza di cattura sferoide fago può essere usato per fare superfici antimicrobiche efficaci. Un tempo alla risposta totale per il saggio proposto è di circa 16 min per campione. Questo tempo può essere ridotto drasticamente utilizzando dispositivi QCM con un gran numero di camere. La durata prevista per i sensori fago è circa di 3-4 mesi a temperatura ambiente. Con una protezione biopolimero si potrebbe prolungare fino a pochi anni 32. Il limite di rilevamento di S. aureus è stato misurato per questo fago da una spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie, ed è risultato essere 10 4 UFC / ml 18.

Una delle condizioni più importanti per utilizzare i metodi descritti in questo articolo è quello di osservare le condizioni di pulizia e sterile 33 requisiti per tutti gli esperimenti con i fagi e batteri.

Metodi comunemente utilizzati per la rilevazione di MRSA, come ad esempio la diffusione oxacillina screen test agar disco, o brodo microdiluizione prendere Normally fino a 24 ore per effettuare la prova. Tecniche rapide che includono tecniche automatizzate come il Vitek GPS-SA card, il sistema Rapid ATB stafilococco, il sistema Pannello Rapid Microscan, e il sistema di cristallo MRSA ID generano risultati dopo 3-11 ore 9-14. PCR o ibridazione DNA del gene mecA 15 è un metodo relativamente veloce e preciso ma richiede DNA purificato ed e impurità estremamente sensibili. Al contrario, il metodo descritto in questo lavoro è rapida, non necessita estrazione del DNA, e non è sensibile alla additivi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Il lavoro riportato nel presente documento è stato sostenuto da sovvenzioni da Auburn University AUDFS e USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono la politica o la posizione della United States Air Force, Dipartimento della Difesa, o il governo degli Stati Uniti ufficiale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter