JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

Published: May 08, 2013
doi:
10.3791/50474
, , , , ,
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine,Auburn University , 2Clinical Research Laboratory, 81st Medical Group,Keesler Air Force Base

Summary

Litik faj biyosensörler ve antikor boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı stafilokok bakterileri ayırt edebiliyoruz. Faj bir kuvars kristal mikro sensörünün bir yüzey üzerine Langmuir-Blodgett yöntemi ile hareketsiz ve geniş stafilokok prob olarak çalışıyordu. Antikor boncuk MRSA tanır.

Abstract

Staphylococcus aureus suşları arasında, geniş bir konak yelpazesi ve penisilin-bağlayıcı protein (PBP 2a) konjuge antikor lateks boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı (MSSA), S ayrımı için tasarlanmış bir biyosensor oluşturmak için kullanılmıştır sahip olan bir yapısal dönüştürülmüş litik bakteriyofajı . aureus türleri 1,2. Litik faj su-kloroform arayüzü ile temas ile faj parçacıklarının dönüştürülmüştür. Faj sfero mono tabakaları Langmuir-Blodgett (LB) tekniği 3 ile bir biyosensör yüzeye taşınmıştır. Oluşturulan biyosensörler bakteri-faj etkileşimleri değerlendirmek dağılımını izleme ile bir kuvars kristal mikro (QCM-D) tarafından incelenmiştir. Bakteri-sfero etkileşimleri düşük rezonans frekansı ve MRSA ve MSSA suşları hem de dağılımı enerji artmasına neden olmuştur. Bakteriyel olarak bağlandıktan sonra, bu sensörler daha penisilin bağlayıcı protein antikor lateks boncuk maruz kalmışs. MRSA ile analiz sensörleri 2a antikor boncuk PBP yanıt; MSSA ile kontrol sensörleri cevap verdi rağmen. Bu deneysel ayrım metisilin dirençli ve duyarlı S. arasında kesin bir ayrım belirler aureus suşları. Aynı şekilde bağlı ve ilişkisiz bakteriyofajlar yüzeylerde ve su süspansiyonlar bakteriyel büyüme bastırmak. Litik faj parçacıklarının dönüştürülür sonra, onlar güçlü litik aktivite korumak ve yüksek bakteri yakalama özelliği göstermektedir. Faj ve faj parçacıklarının antibiyotik dirençli mikroorganizmaların test ve sterilizasyon için kullanılabilir. Diğer uygulamalar bakteriyofaj tedavisi ve antimikrobiyal yüzeylerinde kullanılmasını içerebilir.

Introduction

Staphylococcus aureus metisilin dirençli suşlar temel enfeksiyonları ve hastane salgınları 4-8 bir faktör olarak öne sürülmüştür. Bu disk difüzyon oksasilin agar tarama testi veya sıvı mikrodilüsyon olarak metisilin direnci tanınması ortak yolları, direnç ifade geliştirmek için özel kültür koşulları güveniyor. Değişiklik oksasilin kullanımı ° C yerine 37 ° C den 30 ya da 35 de inkübasyon ve büyüme ortamı NaCl dahil bulunmaktadır. Ayrıca, bu tür teknikler ile doğru bir şekilde tespiti için, 24 saatlik uzun bir kuluçka süresi yerine, 16-18 saat arasında gereklidir. Metisilin direncinin belirlenmesi için hassasiyet uygun (>% 96) düzeyde hızlı teknikleri 3-11 saat sonra sonuçlar bu Vitek GPS-SA kart, Hızlı ATB Staph sistemi ve hızlı Microscan Panel sistemi olarak otomatik mikrodilüsyon teknikler şunlardır 9-11. Kristal MRSA ID sistemine S. büyüme tanınması üzerine dayanan, hızlı bir yöntemdir 2% NaCl ve bir oksijen-duyarlı floresan sensörlü litre başına oksasilin, 4 mg varlığında aureus. İddia hassasiyetleri kuluçka 12-14 4 saat sonra 91 ile 100 arası arası% değişir. Bu fenotipik yöntemler heterojen direnci ifade yaygın suşların etkisini kendi doğruluk sınırlıdır. Bu nedenle, metisilin direnci tanınması için en iyi yaygın olarak kabul yöntemleri mecA geninin 15 PCR veya DNA hibridizasyon olduğunu. Ancak bu teknik saflaştırılmış DNA gerektirir ve hücre artıkları 16 dahil çeşitli katkı maddeleri (yabancı madde), karşı son derece duyarlıdır.

Ayrıca, bu teknikler gerçekleştirmek için uzun zamana ihtiyacım var. MecA gen ürünü, protein PBP 2a, tanınması için stratejiler direncini belirlemek için yararlanılabilir ve standart test teknikleri 17 göre daha güvenilir olabilir.

<p class = "jove_content"> Daha önce bakteriyofaj 12600 metisilin direnci 1,2,18 sahip olanlar dahil olmak üzere, Staphylococcus aureus suşları için bir tanıma prob olarak kullanılabilir olduğu ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada bu tür gerçek zamanlı olarak MRSA uyum ile birlikte bakterilerin tanınması olarak MRSA özel tanıma ve algılama yeni bir teknik, önerdi. Bu amaç bir S. proteinine karşı bir monoklonal antikor ile birlikte barındıran çok geniş bir yelpaze (MRSA suşlar dahil) ile aureus bakteriyofaj (PBP 2a) kullanılmıştır. PBP 2a bir hücre duvarı protein ve MRSA antibiyotik direnç nedenidir. Ancak PBP 2a antikor S. için spesifik değildir diğer bazı bakterilerin bu yana aureus PBP 2a 19,20 için dizin benzerliği olan antibiyotik bağlayıcı proteinler var. Sonuç olarak bu çalışmada, S. PBP 2a proteinine karşı aureus bakteriyofaj ve antikorlar kullanılmıştır. Specifi bir biyosensör geliştirmek edebilmek için,Cally'nin iki aşamalı bir işlem kullanılmıştır olan bir cihaz tespit ve MRSA belirlemek. İlk adım, S. kullanılan bir sensör probu olarak aureus bakteriyofaj tek tabaka, ikinci adım PBP 2a spesifik antikorların istihdam ederken. Bu nedenle, S. tanır adım aureus bakteriler, diğer biri olarak antibiyotik bağlayıcı protein duyarlı olacaktır. Iki adım alınan sinyalleri olumlu olduğunda, MRSA özel algılama gösterir.

Protocol

1. Sahne Ayarlama Tip suşu S. elde aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 ve Bacillus subtilis ATCC 6051. S. Metisiline dirençli suşlar aureus – MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; litik faj 12600. PBP 2a antikor konjuge lateks boncuk alın. <su…

Representative Results

Faj S. test edilen tüm suşlarına karşı litik aktivite göstermiştir olarak faj spot test ile gösterilir MRSA suşları da dahil olmak üzere aureus,. Plak boyutları genellikle 5 ile 15 mm arasındadır. Aktivite diğer test-kültürler (Tablo 1) karşı bulunamadı. S. A normal büyüme 37 çalkalayıcı-inkübatör NZY ortamda aureus ATCC 12600 ° C Şekil 1A (boş çevreler tarafından etiketli bir eğri) göster…

Discussion

Bu fajlar de bakteriyel patojenler için 28 biyosensör problar olarak kullanılabilir bilinmektedir. Hızlı ayrımcılık antibiyotik dirençli ve duyarlı suşlar: Bu PBP 2a antikorlar ile birlikte faj eski sorunu çözmek için kullanılabilir bu çalışmada gösterilmiştir.

Ancak, bu normal bir değiştirilmemiş stafilokok fajlar bakteri bağlama bile, QCM cihazlarla bakteri tespiti için uygun değildir bulunmuştur. Faj kuyruk akustik dalgaların faj kuyrukları sonuna k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Burada bildirilen çalışma Auburn University AUDFS ve USAF CRADA 07-277-60MDG-01 hibe ile desteklenmiştir. Bu makalede ifade edilen görüşler yazarlara aittir ve resmi politika ya da Amerika Birleşik Devletleri Hava Kuvvetleri, Savunma Bakanlığı, ya da ABD Hükümetinin yansıtmaz.

Materials

Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant’ Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent’ Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass” effect in biosensor’s QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).

Tags

BiosensorAntibiotic ResistantStaphylococcusBacteriophagePhage SpheroidsLangmuir-BlodgettQuartz Crystal MicrobalancePenicillin-binding ProteinMRSAMSSABacterial CaptureAntimicrobial SurfacesBacteriophage Therapy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image