Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

Litik faj biyosensörler ve antikor boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı stafilokok bakterileri ayırt edebiliyoruz. Faj bir kuvars kristal mikro sensörünün bir yüzey üzerine Langmuir-Blodgett yöntemi ile hareketsiz ve geniş stafilokok prob olarak çalışıyordu. Antikor boncuk MRSA tanır.

Abstract

Staphylococcus aureus suşları arasında, geniş bir konak yelpazesi ve penisilin-bağlayıcı protein (PBP 2a) konjuge antikor lateks boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı (MSSA), S ayrımı için tasarlanmış bir biyosensor oluşturmak için kullanılmıştır sahip olan bir yapısal dönüştürülmüş litik bakteriyofajı . aureus türleri 1,2. Litik faj su-kloroform arayüzü ile temas ile faj parçacıklarının dönüştürülmüştür. Faj sfero mono tabakaları Langmuir-Blodgett (LB) tekniği 3 ile bir biyosensör yüzeye taşınmıştır. Oluşturulan biyosensörler bakteri-faj etkileşimleri değerlendirmek dağılımını izleme ile bir kuvars kristal mikro (QCM-D) tarafından incelenmiştir. Bakteri-sfero etkileşimleri düşük rezonans frekansı ve MRSA ve MSSA suşları hem de dağılımı enerji artmasına neden olmuştur. Bakteriyel olarak bağlandıktan sonra, bu sensörler daha penisilin bağlayıcı protein antikor lateks boncuk maruz kalmışs. MRSA ile analiz sensörleri 2a antikor boncuk PBP yanıt; MSSA ile kontrol sensörleri cevap verdi rağmen. Bu deneysel ayrım metisilin dirençli ve duyarlı S. arasında kesin bir ayrım belirler aureus suşları. Aynı şekilde bağlı ve ilişkisiz bakteriyofajlar yüzeylerde ve su süspansiyonlar bakteriyel büyüme bastırmak. Litik faj parçacıklarının dönüştürülür sonra, onlar güçlü litik aktivite korumak ve yüksek bakteri yakalama özelliği göstermektedir. Faj ve faj parçacıklarının antibiyotik dirençli mikroorganizmaların test ve sterilizasyon için kullanılabilir. Diğer uygulamalar bakteriyofaj tedavisi ve antimikrobiyal yüzeylerinde kullanılmasını içerebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Staphylococcus aureus metisilin dirençli suşlar temel enfeksiyonları ve hastane salgınları 4-8 bir faktör olarak öne sürülmüştür. Bu disk difüzyon oksasilin agar tarama testi veya sıvı mikrodilüsyon olarak metisilin direnci tanınması ortak yolları, direnç ifade geliştirmek için özel kültür koşulları güveniyor. Değişiklik oksasilin kullanımı ° C yerine 37 ° C den 30 ya da 35 de inkübasyon ve büyüme ortamı NaCl dahil bulunmaktadır. Ayrıca, bu tür teknikler ile doğru bir şekilde tespiti için, 24 saatlik uzun bir kuluçka süresi yerine, 16-18 saat arasında gereklidir. Metisilin direncinin belirlenmesi için hassasiyet uygun (>% 96) düzeyde hızlı teknikleri 3-11 saat sonra sonuçlar bu Vitek GPS-SA kart, Hızlı ATB Staph sistemi ve hızlı Microscan Panel sistemi olarak otomatik mikrodilüsyon teknikler şunlardır 9-11. Kristal MRSA ID sistemine S. büyüme tanınması üzerine dayanan, hızlı bir yöntemdir 2% NaCl ve bir oksijen-duyarlı floresan sensörlü litre başına oksasilin, 4 mg varlığında aureus. İddia hassasiyetleri kuluçka 12-14 4 saat sonra 91 ile 100 arası arası% değişir. Bu fenotipik yöntemler heterojen direnci ifade yaygın suşların etkisini kendi doğruluk sınırlıdır. Bu nedenle, metisilin direnci tanınması için en iyi yaygın olarak kabul yöntemleri mecA geninin 15 PCR veya DNA hibridizasyon olduğunu. Ancak bu teknik saflaştırılmış DNA gerektirir ve hücre artıkları 16 dahil çeşitli katkı maddeleri (yabancı madde), karşı son derece duyarlıdır.

Ayrıca, bu teknikler gerçekleştirmek için uzun zamana ihtiyacım var. MecA gen ürünü, protein PBP 2a, tanınması için stratejiler direncini belirlemek için yararlanılabilir ve standart test teknikleri 17 göre daha güvenilir olabilir.

1,2,18 sahip olanlar dahil olmak üzere, Staphylococcus aureus suşları için bir tanıma prob olarak kullanılabilir olduğu ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada bu tür gerçek zamanlı olarak MRSA uyum ile birlikte bakterilerin tanınması olarak MRSA özel tanıma ve algılama yeni bir teknik, önerdi. Bu amaç bir S. proteinine karşı bir monoklonal antikor ile birlikte barındıran çok geniş bir yelpaze (MRSA suşlar dahil) ile aureus bakteriyofaj (PBP 2a) kullanılmıştır. PBP 2a bir hücre duvarı protein ve MRSA antibiyotik direnç nedenidir. Ancak PBP 2a antikor S. için spesifik değildir diğer bazı bakterilerin bu yana aureus PBP 2a 19,20 için dizin benzerliği olan antibiyotik bağlayıcı proteinler var. Sonuç olarak bu çalışmada, S. PBP 2a proteinine karşı aureus bakteriyofaj ve antikorlar kullanılmıştır. Specifi bir biyosensör geliştirmek edebilmek için,Cally'nin iki aşamalı bir işlem kullanılmıştır olan bir cihaz tespit ve MRSA belirlemek. İlk adım, S. kullanılan bir sensör probu olarak aureus bakteriyofaj tek tabaka, ikinci adım PBP 2a spesifik antikorların istihdam ederken. Bu nedenle, S. tanır adım aureus bakteriler, diğer biri olarak antibiyotik bağlayıcı protein duyarlı olacaktır. Iki adım alınan sinyalleri olumlu olduğunda, MRSA özel algılama gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Sahne Ayarlama

  1. Tip suşu S. elde aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 ve Bacillus subtilis ATCC 6051. S. Metisiline dirençli suşlar aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; litik faj 12600.
  2. PBP 2a antikor konjuge lateks boncuk alın.
  3. 21 açıklandığı gibi NZY ortamı hazırlayın.
  4. Fosfat elde edilir tuzlu su çözeltisi (PBS).
  5. Langmuir-Blodgett (LB) tek tabaka birikimi için subphase olarak deiyonize su hazırlayın.

2. Bakteriyofaj Yayılım ve Titrasyon

  1. S. gecelik kültürü, 5 ml inkübe faj 500 ul (3 aureus ATCC 12600 (3.6 x 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / ml) x 10 9 </ 37 ° C de bir gece boyunca çalkalayıcı enkübatörde üzerinde 2 L Flack 500 mi NZY ortamı içinde)> PFU / ml 'sup.
  2. 4 10 dakika boyunca 4,424 x g'de santrifüjleyin kültür ° C
  3. 4 10 dakika için 11,325 x g'de yeniden santrifüje süpernatant ° C
  4. 0.22 um bir Millipore filtresi aracılığıyla filtre yüzer madde toplandı.
  5. 1.5 saat 75.395 xg'de süzüntü santrifüj.
  6. Damıtılmış su ve 100 ul pelet çözülür.
  7. NZY ortamı içinde faj süspansiyonunun 10-kat seyreltim dizileri hazırla.
  8. S. gece (ON) kültür plakası 1 ml Tüm yüzey kaplıdır emin olmak için NZY agar ile 2 plakaların her üzerine aureus ATCC 12600. Kültür aşırı çıkarın ve 30 dakika boyunca yüzey kurumaya bırakın.
  9. Plaka yüzeyine uygun faj seyreltme bir örnek (10 ul) Nokta ve 18-24 saat süreyle 37 o C'de inkübe edin.
  10. Plakların oluşumu inceleyin ve faj titresi hesaplar. Bakteriyofaj titresi (T) p sayısı olarak tahmin edilmiştirLaques (K), faj süspansiyon ve seyreltme faktörü (F), 10 ul hacmi (V) gerçekleştirilmelidir. . T = N / (VXF) Örneğin, 10 seyreltme -7 plakların sayısı 75 ve hacmi 10 ul (10 x 10 -3 mi), titresi 75 / eşittir: titre formül vasıtasıyla hesaplandı (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7.5 x 10 10 plak oluşturan birim (PFU) başına ml süspansiyon.

3. Altın hareketsiz Phage

  1. Sonra 10 dakika argon içinde aşındırma ve plazma ile temiz altın kaplı kuvars parçaları (60 mm 2) steril bir kabine UV ışık altında 6 saat sterilize edin.
  2. Steril bir Petri kabındaki her parçanın altın yüzeyi 1 x 10 9 PFU / ml faj süspansiyonunun 50 mikrolitre ekleyin ve daha sonra oda sıcaklığında bir gece boyunca nemli bir oda içerisinde inkübe edilir.
  3. Kalan faj süspansiyonunun çıkarın ve titreleri.
  4. Ilişkisiz kaldırmak için PBS ile bağlı faj ile adet 5 kez yıkayınfaj.

4. Bir Kuru Yüzey üzerinde İmmobilize Phage enfektivite test edilmesi

  1. Bir NZY agar plaka üzerine S. Aureus ATCC 12600 bir O / N kültürünü yaymak ve kurumasını bekleyin.
  2. Plaka yüzüne hareketsiz faj ile bir altın parçası aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
  3. 37 12 saat inkübasyondan sonra lizis bir bölge dikkat ° C olan enfeksiyon gösterir.
  4. Kontrol deneylerinde herhangi bir faj ile kaplı altın parçaları kullanır.

5. Sıvı Ücretsiz ve Bağlı Phage bir Parçalayıcı Faaliyet Test

  1. S. bir ON kültürü ekle Dört adet 300 mL'lik şişeler, her (6 x 10 6 CFU / her bir şişe içerisinde ml) içinde NZY arasında aureus ATCC 12.600-10 ml.
  2. Iki şişe 2 x 10 6 PFU / ücretsiz faj ml ekleyin.
  3. Kontrol olarak, diğer iki şişelerde.
  4. S. zaman ders izleyin Tüm şişeler için 30 dakika aralıklarla optik yoğunluk ölçümü (OD 600) ile 570 dakika aureus hücre parçalama.
  5. 24 saat bir son ölçüm yapın.
  6. Adımları 5.1-5.5 tekrarlayın, ancak kontrolü şişeler hiçbir faj ile altın bağlı faj yerine ücretsiz fajlarla parçaları ve altın parçaları kullanın.

6. Kuluçka sırasında Bağlı Fajlar kaybı

  1. Oda sıcaklığında gece boyunca nemli bir oda içine yerleştirilen bir petri steril altın parçası yüzeyi üzerine 1 x 10 9 PFU / ml faj 50 ul ekle.
  2. Altın yüzey ve titre gelen ilişkisiz faj ile süspansiyon çıkarın.
  3. 8 saat boyunca 37 ° C de 5 saat ve PBS ile bir yerde çalkalayıcı enkübatörde 15 ml tüp içinde 1 ml çözelti içinde NZY bağlı faj ile altın parçası yıkayın.
  4. 2'de tarif edildiği gibi müstakil faj titresi belirlenir.

7. Faj sferoidler Hazırlık

  1. 1 ml'lik bir şişe içinde spektrofotometrik dereceli kloroform eşit hacmi ile stok faj 12600 süspansiyonu (10 11 PFU / ml) 400 ul birleştirenoda sıcaklığında karıştırıldı.
  2. Yavaşça girdap 5-6 kez (5 sn aralıklarla) bir dakika süresi boyunca faj-kloroform süspansiyon.
  3. 30 saniye için stabilize ve daha sonra parçacıklarının tek tabaka hazırlanması için kapalı pipetlendi içeren üst faz pipetle için süspansiyon izin verdi.
  4. Iletim ve taramalı elektron mikroskobu için, söz konusu sferoidler süspansiyonu birkaç mikrolitre al.
  5. Biyosensör üretimi için bir kalan sfero süspansiyon kullanın.

8. Biyosensör Hazırlık

  1. 10 dakika PDC-32G Harrick plazma temizleyici için argon içinde aşındırma plazma tarafından temiz QCM-D sensörleri.
  2. Herhangi bir organik kirleri çıkarmak için hekzan ile sensör durulayın.
  3. Hazırlayın ve 22 olarak tarif edilen filmin bir denge çukur temizleyin.
  4. Bir subphase çözüm LB çukur doldurun ve bir çukur bariyer ile temiz ve 20 çukur stabilize ± 0.1 ° C
  5. Sulu suspensi içinde faj 12600 300 ul kısım yayınLB subphase üzerine (10 11 PFU / ml) üzerinde.
  6. Kısmen subphase 22,23 içine batık bir eğimli ıslanır cam çubuk aşağı çalıştırmak için faj 12600 sulu süspansiyon 300 ul kısım (10 11 PFU / ml) izin vererek LB subphase çözüm üzerine faj tek tabaka hazırlayın.
  7. 10 dakika süre ile hazırlanan tek katmanlı stabilize edilmesi ve daha sonra, sabit bir basınç kadar, 19 N / m elde edilir, 30 mm / dakika (45 cm 2 / dak) arasında bir hızda bunu sıkıştırmak.
  8. Arda tek tabaka yedi kez sensör daldırma ve dışarı ile 4,5 mm / dak hızında dik konumlandırılmış QCM-D sensör üzerine dikey bir film biriktirme gerçekleştirin. Bakteriyel numuneleri maruz tabakalar (veriler gösterilmemiştir), sürekli homojen ve homojen olduğunu göstermiştir önce elektron mikroskopisi faj mono tabakaları yatırılır.
  9. Tekrar 3 hazırlanmış bir faj sfero süspansiyon ile 4.5-4.8 adımları.
  10. MRSA tespit, elektron için fabrikasyon faj biyosensörler kullanınmikroskopi ve elipsometri.

9. Biyosensör Test, Metisiline Dirençli Ayrımcılığın ve Hassas Stafilokok Bakteriler

  1. Bu protokol, değiştirilmemiş ve modifiye faj ve faj parçacıklarının ile biyosensör hazırlanır. Dört sensör akış odaları olan bir kuartz kristali mikro QCM algılayıcı yüzeyi üzerinde hareketsiz faj bakteri bağlama izlemek için kullanılır. PBP 2a antikor konjuge lateks boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı stafilokok bakterileri ayırt için kullanılmaktadır. Bütün ölçümler, 5 MHz'de akış modu (50 ul / dak) yürütülmektedir.
  2. Su (~ 30 dakika) en QCM sensör bir temel çizgi rezonans frekansı kurmak.
  3. Test hücre yoluyla su canlı metisiline duyarlı stafilokok bakteri hücrelerinin (10 9 CFU / ml) bir süspansiyon çizin.
  4. Sürekli birinci aşırı ton, USI için sensörler rezonans frekans ve enerji dağılımı değişiklikleri izlemekng Q-Soft yazılım.
  5. Sensörlerin rezonans frekansı ve dağılımı değişiklikleri doyma seviyeleri ulaştığı zaman, frekans ve yayılımın sürekli izlenmesi sırasında akış PBP antikor konjuge lateks boncuk (6,77 x10 10 boncuk / ml) süspansiyonu ilave edin.
  6. Tekrar metisiline dirençli stafilokok bakteri hücrelerinin (MRSA) için 9.2-9.5 adımları.
  7. C sabiti (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 az 5 MHz kitle hassasiyeti olan Sauerbrey denklemi 24,25 mesafe kadar taşınmış =-Δm xn / C, bağlayıcı bakteriler nedeniyle kitle değişiklik yoluyla bir frekans değişimi tanımlayın ), kütle m ve n, aşırı ton sayısı (n = 1) 'dir.
  8. Kayıt bir enerji dağılımı değişimi (Δ D) tanımlayın salınım üstel çürüme (frekans ve genlik salınım biri döneminde harcanmış ve depolanan enerji miktarının izin hangi, nemlendirme,Sırasıyla, E harcanmış ve E saklanır: Δ D = E harcanmış / 2 πE saklanır. Δ D dağılımı birimi (DU), bir DU = 10 -6 göreceli adet) olarak ölçülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Faj S. test edilen tüm suşlarına karşı litik aktivite göstermiştir olarak faj spot test ile gösterilir MRSA suşları da dahil olmak üzere aureus,. Plak boyutları genellikle 5 ile 15 mm arasındadır. Aktivite diğer test-kültürler (Tablo 1) karşı bulunamadı.

S. A normal büyüme 37 çalkalayıcı-inkübatör NZY ortamda aureus ATCC 12600 ° C Şekil 1A (boş çevreler tarafından etiketli bir eğri) gösterilir. Bakteri sayısı, 4.0 x 10 6 3,2 artış x 10 8 CFU / ml idi. Şekil 1A (dolu daireler ile işaretlenmiş eğri) 2.0 x 10 Kokultivasyondan sonuçlarını gösteren 6 PFU / ml serbest faj eş zamanlı olarak ilave S. aynı konsantrasyonda aureus ATCC 12600. Altın yüzey üzerinde hareketsiz Faj, süspansiyon içinde faj aktivitesi (Şekil 1A, yukarıdan aşağı üçgenler ile etiketlenmiş eğrisi ile karşılaştırılabilir litik aktivite göstermiştir.) Faj altın parçası ilk deneme büyüyen 24 saat kullanılan zaman İmmobilize faj iltihaplı kaldı, daha sonra 4, 6 gün boyunca 5 kez yıkanmış ve PBS içinde depolanmıştır ° C ve son olarak taze bir bakteri süspansiyonu ile üretilmiştir. (Şekil 1A, kontör üçgen ile etiketli eğri). Bu hareketsiz faj yeni bakteri enfekte aciz geçersiz capsids, bırakarak, bakteriler kendi DNA enjekte gibi görünüyor. Biz bir altın yüzeyinde hareketsiz faj sırayla bu yeni bakteri ve benzeri enfekte ücretsiz faj üretmek birkaç bakteri bulaştırmak için birincil "katalizorler", olarak görev varsayımında. Bu nedenle, immobilize faj muhtemelen bir birinci 24 saatlik büyüme deneyinde kullanılan değildi ve bu nedenle, ikinci bir kez kullanılabilir. Fiziksel adsorpsiyon tarafından yatırılan faj yüzey yoğunluğu yaklaşık ~ 0.7 faj partikül / mikron 2 oldu. Bu konsantrasyon yüksek, ama 10 kat 2 kadar büyüyebilir. Bu nedenle, altın plaka s dahil olabilirİlk 24 saat büyüyen deneyde enfekte bakteri tarafından yayımlanan ücretsiz canlı faj ome.

Şekil 1B hareketsiz faj bakteri hücrelerinin parçalama yeteneğine sahip olduğunu gösteren, altın parçası etrafında parçalama bölge gösterir. Kontrol deneylerinde, boş altın kaplama bakteriyel büyümeyi inhibe etmedi. Bu nedenle bakterilerin ve immobilize faj ko-kültür bulunan bakteri büyümesini etkin bir şekilde azalma su askıya bakteri ve Şekil 1C 'de gösterildiği gibi bağlı faj, primer etkileşiminin bir sonucudur. Ve bağlı faj, bakterilerin ortak inkübasyon esnasında altın yüzeyinden faj dekolmanı küçüktü. İnkübasyon sırasında altın yüzey kopuk kaç fajlar tahmin etmek için, bağlanan faj numune, 8 saat boyunca 37 ° çalkalayıcı enkübatörde çalkalandı NZY çözeltisi ° C'ye daldırıldı ve süpernatan bir serbest faj konsantrasyonu değerlendirildi. Biz 4,1 x 10 7 PFU Boun olduğu tespitsadece 3 x 10 4 PFU müstakil olduğu bir 60 mm 2 altın parçası (~ 0.7 faj partikül / mikron 2), (0.007% dekolmanı) d.

Iletim ve altın substrat yüzeyi üzerinde sağlam faj litik 12600 tarama elektron mikro Şekiller 2A ve 2B 'de gösterilmiştir. Faj süspansiyonunun işleme tabi tutuldu ve kloroform zaman, faj fiziksel görünümünü değiştirilmiştir. Kuyruk uzunluğu sözleşmeli ve kalınlaşmış. Çokgen başlığı (Şekil 2D ve 2E) yuvarlak oldu. Biz ipliksi faj 26 tedavi kloroform adına "sfero" yapısal olarak değiştirilmiş litik faj benzer adlandırılır. Kloroform tedavi sonucu önemli yapısal değişiklikler rağmen, plak numaraları ile ölçülen sfero litik aktivite (Şekil 2C ve 2F) değişmedi. Faj ve parçacıklarının ortalama litik aktivite vardı (7.4 ± 1.5 (SD)) x 10 10 (N = 4) ve (7.5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (n = 7), pfu / ml idi. 0.05 düzeyinde, faj ve parçacıklarının faaliyetleri (Şekil 2C ve 2F) anlamlı bir fark saptanmadı.

Onlar MRSA (Şekil 3A) maruz zaman hareketsiz litik faj ile QCM sensörler rezonans frekansı veya enerji dağılımı önemli bir değişiklik gösterdi. Bu veriler MRSA / faj etkileşimi QCM göre bir kitle değişikliğin neden olduğunu göstermektedir, ve henüz sonrası test biyosensör elektron mikroskop sensör yüzeyi (Şekil 3B) anlamlı bakteriyel bağlayıcı saptandı.

MRSA süspansiyonlar faj sfero biyosensör, sıklığında önemli bir azalma ile akış hücresi enjekte edildiğinde (Δ f ≈ -105 Hz) ve dağılımı artış (ΔD ≈ 26 DU) gözlendi (Şekil 3C). Faj sfero-bakteriyel (MRSA) bağlama etkileşimleri ardından, se testnsors PBP2a antikor konjuge lateks boncuk süspansiyonlar maruz bırakıldı. Bu MRSA biyosensörler sıklığında bir başka düşüş yana, PBP2a antikor konjuge lateks boncuk süspansiyonlar cevap (Δ f ≈ -45 Hz) ve dağılımı artış (ΔD ≈ 15 DU) gözlendi (Şekil 3C) test. Prob ve PBP2a antikor konjuge lateks boncuk faj MRSA Bağlama taramalı elektron mikroskobu incelemeleri (Şekil 3D) kullanılarak doğrulandı.

Faj sfero biyosensör MSSA süspansiyonlar, sıklığında önemli bir azalma maruz iken (Δ f ≈ -200 Hz) ve dağılımı artış (ΔD ≈ 55 DU) gözlendi (Şekil 3E). Faj sfero-MSSA bağlama etkileşimleri ardından, test sensörler PBP2a antikor konjuge lateks boncuk süspansiyonları ile meydan. Başlangıçta, MSSA test biyosensör kısa geçici gösterdisıklığında artış ve dağılımı azalma. MSSA ve PBP2a antikor konjuge lateks boncuk etkileşimlerin bir kaç dakika sonra, frekans PBP2a antikor giriş seviyeleri göndermek için döndü, ama enerji tüketen enerji (Şekil 3E) arttı. Faj sensörler için de MSSA bağlanması taramalı elektron mikroskobu ile doğruladı, ama MSSA ve PBP2a antikor konjuge lateks boncuk (Şekil 3F) gözlendi arasında bağlayıcı edildi. Ellipsometric kalınlığı profil, litik faj ve stafilokok bakteri 3D kalınlığı haritası S1 ve S2 Ek Şekil gösterilmiştir.

10 9 hücre / MRSA veya MSSA bir ml süspansiyon LB hareketsiz faj veya parçacıklarının ile sensörlerin temas sonrasında, bakteri, 9,1 x 10 7 (MRSA / sağlam faj) yoğunluğu (ρ) de faj veya parçacıklarının bağlamak gözlendi 7,9 x 10 7 (MRSA / parçacıklarının) ve 7,2 x 10 7 (MSSA / parçacıklarının) hücre / cm 2. Içinde5 farklı litik faj ve 2 ana bakteri 27 kullanılarak testler, araştırmacılar 10 9 hücre / ml bakteri kovalent bağlanma yöntemi ile immobilize faj tabi, ve (2,5-8,9) x 10 5 hücre / cm 2 aralığında faj yakalama verimliliği tespit . Bu çalışmada sunulan faj yakalama verimliliği ~ 100 kat daha fazladır.

Evsahibi Zorlanma Gerilme ayrıntıları Metisiline hassasiyeti Faj duyarlılık
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
S. aureus 10497 IA S +
S. aureus 10686 IA S +
S. aureus MRSA 1 AU R +
S. aureus MRSA 2 AU R +
S. aureus MRSA 5 AU R +
S. aureus MRSA 13 AU R +
S. aureus MRSA 26 AU R +
S. aureus MRSA 34 AU R +
S. aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis Sterne AU NA -
Salmonella typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri bilinmeyen AU NA -
Yersinia enterocolitica bilinmeyen AU NA -
Proteus mirabilis bilinmeyen AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tablo 1. Bakteriyel s faj 12600 hassasiyetitrenler IA - hayvanlardan izole;. AU - Auburn Üniversitesi bakteri kültürü koleksiyonu, NA - uygulanmıyor, bir - faj litik aktivite hassas plaklar oluşumu, +,, tarafından kabul edildi -, duyarlı değildir. Test edilen suşların gecelik kültürleri NZY agar ile plakalar üzerine kaplandı. Yüzey kuruduktan sonra, 10 11 PFU faj süspansiyonunun bir numune (10 ul), plaka yüzeyinde fark edildi. Plakalar 18-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Faj litik aktivitesi plak oluşumu ile tespit edildi.

Şekil 1
Şekil 1. Bağlı ve serbest faj enfektif özellikleri. Serbest faj A. Bakteriyel yokluğunda büyüme (boş daireler) ve varlığında (dolu daireler), faj varlığında (tr kadar üst altın yüzeye bağlıiangles) ve 4 de 6 saat sonra altın yüzeye bağlı faj varlığında ° C (üçgenler yukarıdan aşağıya). Ekle: hattı (1) denklem (4) (R = -0.99, p <0.0001) için faj büyüme deneysel veriler hiçbir doğrusal bir uyum gösterir. Hattı (2) aynı denkleme ücretsiz faj huzurunda bakteriyel büyüme deneysel verilerin bir uyum gösterir. Ücretsiz faj yokluğunda ve varlığında bakteriyel büyüme sabiti (k), eşit 0.88 ve 0.64, (-0,048, düşüş faz) vardır. Üç bağımsız deney için temsili veriler bir ortalama bağıl hata OD 600 ölçümleri% 5 aşmadı paneli A. gösterilmiştir. B. Faj altın yüzeyinde sabit hale altın parçası etrafında parçalama bölgesi tarafından belirtildiği gibi enfektif. 1 - parçası bakteri ile agar plaka, 2 - hareketsiz faj ile altın parçası,. 3 - altın parçası etrafında inhibisyon zonu altın yüzeye bağlı faj tarafından bakteri parçalama C. şematik. 1 -altın kaplı kuvars parça, 2 - faj altın yüzey, 3 bağlı - bağlı faj, 4 tarafından demirlemiş bakteri - ücretsiz faj enfekte bakteri patlama tarafından yayımlandı. Izni ile kullanılır: Guntupalli, R., ve diğerleri 2012.. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Sağlam ve modifiye faj özellikleri A ve B - İletim ve sırasıyla sağlam faj elektron mikroskop, tarama,.. C - MRSA D ve E ile bir Agar yüzeyindeki faj litik aktivite - İletim ve sırasıyla sağlam faj parçacıklarının, elektron mikroskop tarama; F - faj parçacıklarının bir litikMRSA ile bir agar plaka üzerinde ctivity. Ve faj parçacıklarının ortalama aktivitesi olan (7.4 ± 1.5 (SD)) x 10 10 (n = 4) ve (7.5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (n = 7) PFU / ml arasındadır. T-testi: t = 0,15682, p = 0,87851. 0.05 düzeyinde, faj ve parçacıklarının faaliyetlerini önemli ölçüde farklıdır DEĞİLDİR. Barlar: A, B, D ve E: 200 Nm. Izni ile kullanılır:. Guntupalli, R., ve ark 2012.

Şekil 3,


Şekil 3,. QCM-D ve faj bakteri etkileşimleri EM analizi birleştirilmiştir. Bakteriler 50 ul / dak 'lık bir akış hızında 10 9 CFU / ml su içinde süspansiyonlar konsantrasyonda sensör teslim edilmiştir. 1, 2, sırasıyla, rezonans frekansı ve enerji kaybı değişiklikleri temsil etmektedir. MRSA A. Faj kaplama QCM-B algılayıcı tepkisi. Ok t gösteriro sensör yüzeyine MRSA teslim süresi. sonrası B. Tarama elektron mikroskobu MRSA QCM sensör üzerinde hareketsiz litik faj bağlı test. Faj parçacıklarının M-MRSA, sensör yüzeyinde P-faj. C. arda tepkiler antikor boncuk PBP sonra MRSA ilk ve kaplamalı QCM-D sensörü. Oklar sırasıyla, MRSA ve sensör yüzeyine PBP antikor teslim süresi gösterir. Yazılan D. Tarama elektron mikroskobu faj parçacıklarının, MRSA ve PBP antikor boncuk ile biyosensör test. Kalın ve ince oklar sırasıyla tipik MRSA hücre ve antikor boncuk, gösterir. Faj parçacıklarının E. Ardışık yanıtları S. kaplı QCM-D sensörü PBP antikor boncuklar daha sonra aureus birinci ve. Oklar S. göstermektedir sonrası sırasıyla sensör yüzeyine aureus ve PBP antikor teslim süresi,. F. Tarama elektron mikroskobu faj parçacıklarının, S ile biyosensör test aureus ve Antikor boncuk PBP. Kalın ve ince oklar tipik S. gösterir aureus hücre ve antikor boncuk, sırasıyla. Izni ile kullanılır: Guntupalli, R., ve diğerleri 2012.. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Ek Şekil

Şekil S1
Şekil S1. Ek Şekil 1. (A) ve (b) bir ellipsometric kalınlık profili, sırasıyla, bir faj litik 3D kalınlık haritası, (etkin kırılma indeksi = 1.05) vardır. Kalınlığı profilleri tek tabaka ortalama, RMS pürüzlülüğü, minimum ve maksimum kalınlık göstermektedir. Kalınlığı harita üzerinde bir çizgi kalınlığı profili oluşturmak çizilmiş oldu.

50474/50474figs2.jpg "/>
S2 Şekil. Ek Şekil 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu fajlar de bakteriyel patojenler için 28 biyosensör problar olarak kullanılabilir bilinmektedir. Hızlı ayrımcılık antibiyotik dirençli ve duyarlı suşlar: Bu PBP 2a antikorlar ile birlikte faj eski sorunu çözmek için kullanılabilir bu çalışmada gösterilmiştir.

Ancak, bu normal bir değiştirilmemiş stafilokok fajlar bakteri bağlama bile, QCM cihazlarla bakteri tespiti için uygun değildir bulunmuştur. Faj kuyruk akustik dalgaların faj kuyrukları sonuna kadar bağlı bakteri "ulaşmak" değil, böylece uzun. Bu durum (Şekil 3A ve 3B) EM görüntüleri gösterdi önemli bağlayıcı rağmen rezonans frekansı ve dağılımı değişikliği kaydetmek için bir "kayıp kitle" etkisi 29 ve yetersizlik sonuçlandı. Bu sorun kolayca sferoidlerle sağlam faj değiştirerek çözüldü, faj, kloroform-su muamele ile değiştirilebilir. Bu tedavi, tam olarak işlevsel s sonuçlandı, kısa kalın ve esnek olmayan kuyruk (Şekil, 2D 2E, 2F ve) ile hage. Faj biyosensörler parçacıklarının yerini almasıyla, MRSA kolayca QCM-D cihazı ile tespit edilmiştir.

Faj parçacıkları düzgün bir doğrultuda altın yüzeylere bağlı idi, onların reseptörleri ana bakterilere erişilebilir. Fajlarla katı bir yüzey ve bir kurutulmuş bakteri tabaka arasında doğrudan fiziksel bir temas meydana gelirse, hareketsizleştirilmiş fajlar ana bakteriler (Şekil 1C) içine viral genomun enjekte etme yeteneğine sahiptir. Bu sonuçlar, bir kovalent bağlama tekniği 27 ile cam disk yüzeyine immobilize litik fajlar ile elde edilen iyi uyuşmaktadır. Ana bakteri yakalamak için bağlı litik faj yeteneği de biotinlenmiş faj immobilizasyon tekniği 30 kullanılarak gösterildi. Bunun aksine, katı yüzeyler için uygun bir yönelime fajlar bağlanması için çok basit bir fiziksel adsorpsiyon yöntemi 31 kullanılmıştır. To yüksek faj sfero yakalama verimliliği etkili antimikrobiyal yüzey yapmak için kullanılabilir. Toplam zaman-cevap için önerilen test için numune başına yaklaşık 16 dk. Bu kez önemli ölçüde odaları çok sayıda QCM cihazlar kullanılarak kısaltılabilir. Faj sensör için öngörülen raf ömrü, oda sıcaklığında 3-4 aylık ilgilidir. Bir biopolimer koruma ile birkaç yıl 32 kadar uzatmak olabilir. S. tespit sınırı aureus, bir yüzey plazmon rezonans spektroskopisi ile, bu faj için ölçülmüştür ve 10 4 CFU / mL '18 olarak bulunmuştur.

Bu makalede açıklanan yöntemleri kullanarak için en önemli koşullardan biri temiz ve steril koşullar faj ve bakteri ile tüm deneyler için 33 gereklerine uymaktır.

Yaygın olarak kullanılan bu disk difüzyon oksasilin agar ekran testi olarak MRSA tespit yöntemleri, ya da sıvı mikrodilüsyon norma almakLly en fazla 24 saat test yürütmek için. Bu Vitek GPS-SA kart, Hızlı ATB Staph sistemi, hızlı Microscan Panel sistemi, ve Kristal MRSA ID sistemi olarak otomatik teknikler şunlardır hızlı teknikleri de 3-11 saat 9-14 sonra sonuçlar. MecA geninin 15 PCR veya DNA hibridizasyon nispeten hızlı ve doğru bir yöntemdir ama saflaştırılmış DNA gerektirir ve son derece hassas kirleri olduğunu. Bunun aksine, bu çalışmada tarif edilen yönteme hızlıdır, çünkü DNA ekstraksiyon gerek yoktur ve bu katkı maddeleri duyarlı değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Burada bildirilen çalışma Auburn University AUDFS ve USAF CRADA 07-277-60MDG-01 hibe ile desteklenmiştir. Bu makalede ifade edilen görüşler yazarlara aittir ve resmi politika ya da Amerika Birleşik Devletleri Hava Kuvvetleri, Savunma Bakanlığı, ya da ABD Hükümetinin yansıtmaz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter