Summary
Stufe spezifischen Isolierung von mittleren bis späten Drosophila Follikel ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Wie Follikel in Kultur, die für die genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen in vitro-Assays und Entwicklung die Bildgebung gekoppelt werden können. Zusätzlich kann Follikel für molekularbiologische Untersuchungen, wie Isolierung von mRNA und Protein verwendet werden.
Abstract
Drosophila Oogenese oder Follikel-Entwicklung wurde häufig verwendet, um das Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse und Zell biologischen voranzutreiben. Das Methodenpapier beschrieben, wie Sie mittleren bis späten Stadium Follikel (Stufe 10B-14) zu isolieren und zu nutzen, um neue Einblicke in die molekularen und morphologischen Ereignisse während dichte Fenster der Entwicklungs Zeit auftreten werden. Isolierte Haarfollikel kann für eine Vielzahl von experimentellen Techniken, einschließlich in vitro-Assays Entwicklung, Echtzeit-Bildgebung, mRNA-Analyse und Western-Blot-Analyse von Proteinen verwendet werden. Follikel bei Stage 10B (S10B) oder später wird die Entwicklung in Kultur zu vervollständigen, dies erlaubt es, genetische oder pharmakologische Störungen mit in-vitro-Entwicklung zu kombinieren, um die Auswirkungen dieser Manipulationen auf die Prozesse zu bestimmten Zeiten auftretenden Entwicklung zu definieren. Darüber hinaus, da diese Follikel entwickeln, in der Kultur, sind sie ideal für Live-Imaging-Studien geeignet sind, Die oft zeigen neue Mechanismen, die morphologische Ereignisse zu vermitteln. Isoliert Follikel kann auch für molekulare Analysen verwendet werden. Zum Beispiel können Veränderungen in der Genexpression, die von genetischen Störungen führen zu spezifischen Entwicklungs Fenster definiert werden. Zusätzlich können Protein-Ebene, die Stabilität und / oder posttranslationale Modifikation Zustand während einer bestimmten Stufe der Follikelentwicklung durch Western-Blot-Analysen untersucht werden. So Stufe spezifischen Isolierung von Drosophila Follikel bietet eine reiche Quelle von Informationen in stark konservierten Prozesse der Entwicklung und Morphogenese.
Introduction
Jeder Drosophila Eierstock von ~ 16 Ovariolen oder Ketten von sequentiell Reifekammern oder-Ei Follikel zusammen. Jeder Follikel besteht aus einer einzigen Eizelle, 15 Keimbahn abgeleitet Krankenschwester oder Stützzellen und ~ 650 somatischen Zellen bezeichnet Follikel-Zellen (Abbildung 1A) zusammen. Wird Drosophila Oogenese in 14 morphologisch definierten Entwicklungsstufen 1 unterteilt. Jedes Stadium der Follikelentwicklung wird viele Male innerhalb einer Fliege beobachtet, so dass es relativ einfach, eine beträchtliche Anzahl von stufenspezifischen Follikel zu isolieren.
Die mittleren bis späten Stadien der Oogenese (Stages 10B-14) sind besonders gut geeignet für die Bühne Trennung (Abbildung 1). In Stufe 10B (S10B) wird das Follikel vollständig gestreckt (dh gleich dem eines Stage-14 (S14) Follikel seine Länge, siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 H) und die Hälfte der Länge der Follikel der Krankenschwester Zellen zusammengesetztdie andere Hälfte ist die Eizelle (Abbildung 1C). In diesem Stadium die Krankenschwester Zellen durchlaufen dramatischen Aktin-Umbau, die Stärkung der kortikalen Aktin und Erzeugung parallelen Bündeln von Aktin-Filamenten 2. Zur gleichen Zeit, eine Bevölkerung von Follikel-Zellen, genannt zentripetalen Zellen wandern zwischen den Nährzellen und der Eizelle und zwei Rücken Gruppen von Follikelzellen angegebenen geworden, Migration zu unterziehen, um die Rückenanhänge, Röhrenatemgeräten für den Embryo bilden 3 . Die Zellen werden dann Krankenschwester Vertrag (S11), drückte ihre zytoplasmatische Inhalt in die Eizelle in einem Prozess namens Krankenschwester Zelle Dumping, das die Eizelle bietet mit den notwendigen Faktoren für sie Embryogenese (1D), um abzuschließen. Die Krankenschwester Zellen durchlaufen dann den Zelltod (S12-S13) 4, und die Follikel-Zellen sezernieren und die Eierschale Muster 5 (1E-G). So reich an wichtigen Entwicklungs eine ist das Ende der Oogenesed morphogenetischen Prozessen.
Isoliert mittleren bis späten Stadium Follikel (S10B, S14) für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der molekularen Analysen verwendet werden. Beispielsweise kann mRNA aus statt Follikel für RT-PCR, Microarray isoliert werden oder RNA-seq analysiert. Dies erlaubt es, bei der Genexpression in kurzer Entwicklungs Fenster schauen, mit nur wenigen Zelltypen vorhanden, und bestimmen, wie die Genexpression entweder durch pharmakologische oder genetische Störungen verändert. Stufe Isolierung kann auch verwendet werden, um auf Proteine durch Western-Blotting zu suchen. Eine solche Analyse ist wichtig, weil es erlaubt, die Höhe der Proteinexpression in Wildtyp-Mutanten gegenüber in bestimmten Phasen zu quantifizieren. Während einer Immunfluoreszenzanalysen verwenden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen, die Quantifizierung der Fluoreszenz weniger robust ist aufgrund der strengen Anforderungen, die alle Pixel innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises 6 sein. Zusätzlich können Western-Blot-Analyse von anderen Informationen, wie eins, wenn das Protein posttranslational modifiziert oder von einer bestimmten Spleiß-Isoform exprimiert. Isoliert Stufen können auch für weitere Proteinreinigung, einschließlich subzelluläre Fraktionierung oder Coimmunpräzipitation verwendet werden.
Stufe spezifischen Follikel Isolierung kann auch für die in vitro Entwicklung Assays 7 und Live-Abbildungs 8 verwendet werden. Isoliert S10B-S13 Follikel wird weiterhin auf S14 in einfachen Kulturmedien zu entwickeln (siehe unten). Es ist wichtig zu beachten, dass S10A Follikel nicht durch Dumping Krankenschwester Zelle mit Hilfe der Kulturbedingungen in diesem Manuskript diskutiert Fortschritte. Wir haben S10B in-vitro-Tests zur Entwicklung der Rolle der Prostaglandine sowohl pharmakologisch und genetisch zu definieren, bei der Regulierung der Aktin-Umbau durch die Verwendung Krankenschwester Zelle Dumping und Entwicklung Auslesen 7,9. Ebenso können die späteren Entwicklungsstadien isoliert werden, um die Wirkungen von pharmakologischen Behandlungen oder genetische Menschen bestimmenipulations auf bestimmte Prozesse wie zentripetale Zellmigration, Rücken Anhängsel Migration / Bildung 10 und Krankenschwester Zelltod. Solche Tests können verwendet werden, um dominante Wechselwirkung Bildschirmen oder Tests durchzuführen, zum Beispiel, während Heterozygotie für Mutationen in pxt oder Fascin allein haben keine Auswirkungen auf S10B in vitro Entwicklung von Follikeln Doppel Heterozygoten zeigen Krankenschwester Zelle Dumping Fehler und ein Block in der Entwicklung 9.
Darüber hinaus, da S10B-13 in Kultur entwickeln, werden alle Prozesse, die während dieser Zeit auftreten kann mit Live-Bildgebung beobachtet werden. Solche Bildgebung kann einfach mit Durchlicht (wenn man nur daran interessiert, große Änderungen in der Morphologie ist) oder mit der konfokalen Mikroskopie mit transgenen Fliegen exprimieren Fluoreszenzsonden oder Follikel mit Live-Bildfarbstoffe gefärbt durchgeführt werden. Live-Bildgebung verwendet wird, um unser Verständnis der Entwicklungsprozesse wesentlich voranzubringen. Tatsächlich leben imaging spät Follikel hat das Wissen der dorsalen Anhängsel Migration, ein Beispiel Tubulogenese 10 erweitert. Wir erwarten, dass die Live-Darstellung von zusätzlichen späten Stadium Prozesse, einschließlich der Aktin-Dynamik während Krankenschwester Zelle Dumping, werden neue Einblicke in diesen Entwicklungs Veranstaltungen. Es ist wichtig zu beachten, dass während S10A und frühen Stadien der Follikel-Entwicklung wird nicht weiter in der Kultur in eine S14 zu entwickeln, ist Live-Imaging von Veranstaltungen in diesen Stadien der Entwicklung auftreten können, die alternative Kulturbedingungen 11-14 (siehe Diskussion für mehr Information).
Hier bieten wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung spät Follikel entweder für in-vitro-Entwicklung und Live-Bildgebung, oder molekulare Analysen (mRNA-und Protein-Trennung).
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Protocol
1. Vorbereitung Drosophila Vor der Isolation Bühne
- Machen nassen Hefe-Paste durch die Kombination von 50 g Trockenhefe mit 90 ml destilliertem Wasser. Mischen Sie mit einem Spatel zu kombinieren. Lassen Sie die Mischung für ca. 30 Minuten vor der Beurteilung Konsistenz. Die Konsistenz sollte nur dick genug, um an der Seite einer Fliege Fläschchen halten, aber nicht heruntergekommen die Seite. Um die gewünschte Konsistenz zu erreichen, kann es notwendig sein, bis zu 10 ml zusätzlichem Wasser oder einer kleinen Menge von Trockenhefe hinzuzufügen. Lagerung in einem geschlossenen Behälter bei 4 ° C Die gespeicherte Hefe kann für ~ 1-2 Wochen verwendet werden.
- Sammeln <24 h alten erwachsenen Fliegen (beide Männer und Frauen) der gewünschten Genotypen und legte sie in ein Fläschchen mit Fliegen Essen und nasse Hefe-Paste auf der Seite der Fläschchen verschmiert. Die Temperatur, bei der die Fliegen gehalten wird abhängig von dem Experiment ab. Für Routineversuche werden entfernt bei Raumtemperatur gehalten. Wohingegen Versuche, in denen ein Genwobei unter Verwendung des Systems 15 UAS/GAL4 überexprimiert erfordern die Aufrechterhaltung der Fliegen bei 25 ° C oder höher ist, als angemessen.
- Geben Sie die Fliegen mit einer frischen Abstrich von Hefe-Paste täglich für 2 Tage. HINWEIS: Follikel-Entwicklung ist eng mit den Ernährungszustand des weiblichen Fliege reguliert, ist es wichtig, die Fliege mit dem nährstoffreichen Hefe-Paste für mindestens 36 Stunden vor der Präparation werden.
2. Isolieren von Mid-zu-spät Inszenierte Drosophila Follikel
- Ermöglichen, dass die Medien auf Raumtemperatur (~ 30 min) kommen. Wenn die Follikel inszeniert gehen, um für in-vitro-Entwicklungstests verwendet werden, frisch vorbereiten IVEM Medien (Grace Insekten Medien, 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1x Penicillin / Streptomycin). Wenn die Follikel inszeniert gehen, um verwendet für die mRNA-oder Proteinisolierung entweder Grace Insekt oder IVEM Medien werden. WICHTIG: Medientemperatur ist kritisch. Wenn die Medien ist kalt wird es ändernsowohl das Aktin und Mikrotubuli-Zytoskelett und Blockbebauung.
- Anesthetize die Fliegen in der yeasted Fläschchen durch die Injektion von CO 2-Gas und legen 3-5 weibliche Fliegen auf einer Fliege Lage unter CO 2. WICHTIG: mehr Frauen, als in einem 10 Minuten Zeit auf der Fliege Pad seziert Lassen Sie keine verlängerte Exposition gegenüber CO 2 verursachen können Unfruchtbarkeit und Tod.
- Füllen Sie eine Vertiefung einer 9-Punkt-Platte mit Medien und legen Sie es auf einer dunklen Fläche (ein Stück schwarzes Plexiglas funktioniert gut). Fokussieren Sie das Binokular auf dem Grund des Brunnens.
- Mit # 5 Dumont Zange holen eine einzige Frau mit einer Hand (dies wird am besten mit der dominanten Hand). Es ist oft am einfachsten zu holen die weiblichen von den Flügeln, Beinen, Bauch oder Brustkorb Übergang. Tauchen Sie die Frau in den Medien gut gefüllt. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops wie nötig.
- Mit einer zweiten Pinzette in der nicht-dominanten Hand, greifen die weibliche am vorderen Ende des Abdomensso dass das hintere Ende in Richtung auf die dominante Hand (2A) angeordnet ist. Stellen Sie sicher, die Fliege in den Medien unter Wasser zu halten.
- Mit der dominanten Hand, verwenden Sie die Zange, um die Nagelhaut bei der 2. hintersten pigmentierte Segment packen und zerreißen es vom Rest des Bauches (2B-C).
- Mit der Zange in der dominanten Hand, drücken Sie leicht die vorderen Ende des Abdomens, bis die Eierstöcke entstehen (Abb. 2D-E). Falls nötig, in die Zange zwischen den beiden Eierstöcke und ziehen sie aus der Karkasse.
- Entweder gehen die Eierstöcke zu einer neuen und mit frischem Medium (2F) oder entfernen Sie die Karkasse zu einem Kimwipe oder Papiertuch. Dies ist besonders wichtig, wenn Follikel ist für die in vitro Entwicklung isoliert.
- Wiederholen, bis 3-5 Paar Eierstöcke isoliert. HINWEIS: Jeder Eierstock ist von ~ 16 Ovariolen oder Ketten von sequentiell Reifung Follikel zusammen. Jeder Ovarioleinnerhalb einer Muskelhülle enthalten.
- Mit Stift Schraubstöcke und die mit ihnen gelieferten Nadeln vorsichtig auseinander ziehen den Eierstock, indem Sie die Nadeln zwischen den Ovariolen (2G). Dies wird manchmal lösen die einzelnen Follikel als gut.
- Individuelle Ovariolen und die leicht zu unterscheiden morphologischen Stadien der Follikel-Entwicklung sollte jetzt sichtbar (Abbildung 2G, neckte auseinander Ovar) sein. Siehe Fig. 1 und 2H morphologischen Unterschiede, die verwendet werden können, um die verschiedenen Phasen zu unterscheiden. Um Follikel, die in intakten Ovariolen sind und immer noch innerhalb einer Muskelhülle enthalten isolieren, verwenden Sie eine Nadel, über die an der vorderen Ovariole des vorangehenden Follikel und an der hinteren der Follikel unmittelbar nach der Follikel von Interesse geschnitten. Dadurch wird die Muskelhülle zu brechen und die Follikel von Interesse kann nun entfernt von den benachbarten Follikel ohne es zu beschädigen geschnitten werden. Da die einzelnen Stufen voneinander getrennt sind, bewegen Sie die Follikel von Interesse, mit einer Glaspipette, zu einem neuen und frischen Medien. Dies ist besonders wichtig bei der Isolierung von Follikeln zur in vitro-Entwicklung. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Pipette Glühbirne vor dem Eintritt in die Medien, um die Luftblasen aus Umverteilung der Follikel of Interest der auch verhindern zu quetschen. Außerdem, wenn die Follikel Verkleben mit der Glaspipette, die Pipette mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) durch Pipettieren der BSA-Lösung und mehrmals nieder und Spülen mit Sezieren Medien vorbeschichtet werden.
- Sobald genügend Follikel isoliert wurden, fahren Sie mit den nachfolgenden Experimenten.
3. In-vitro-Entwicklung von S10B Follikel
- Isolieren S10B Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) in IVEM Medien. Stellen Sie sicher, dass die Follikel schnell von Schutt bewegt. Da diese Follikel weiter zu reifen, ist es important dass S10Bs sind für 30-60 min gesammelt und dann in die Reifung Medium der Wahl gestellt. HINWEIS: S10B müssen sorgfältig von S10A Follikel (Fig. 1C im Vergleich zu 1B) unterschieden werden, wie S10A Follikel nicht im IVEM Kulturmedien reifen. In beiden S10A und S10B Follikel wird die Hälfte der Länge der Krankenschwester Zellen zusammengesetzt und die andere Hälfte ist die Eizelle, aber in S10B die Länge der Follikel gleich, dass der S14 Follikel ist.
- Mit einer Glaspipette, bewegen ~ 30 S10B Follikel in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie überprüfen, ob alle der Follikel übertragen sind S10B und nicht zu S11 gereift.
- Bereiten 1 ul der Reifung Medien pro Vertiefung, dh IVEM Medien sowie pharmakologische Reagenzien.
- Mit einer Glaspipette gezogen *, entfernen Sie so viel Medien aus dem Brunnen (Schritt 3.2), wie möglich und schnell hinzufügen Reifung Medium der Wahl. HINWEIS: Es ist wichtig, ein Glas gezogen pip verwendenette als inszeniert Follikel kann leicht entweder mit Glaspipetten oder Pipettenspitzen mit einem Pipetman genommen werden.
* Um gezogen Pipetten machen: 1) erhitzen das dünne Teil der lang, Glaspipetten in der Flamme eines Bunsenbrenners nur, bis das Glas weich zu werden beginnt, 2) die Pipette sofort zu bewegen aus der Flamme und ziehen horizontal, um die Pipette in zeichnen ein feiner Schlauch, 3) zu brechen, um eine Geldstrafe zu generieren. VORSICHT: Augenschutz wie Glasscherben können sich lösen. - Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.4 für so viele Brunnen, wie das Experiment erfordert.
- Lassen Follikel für> 10 h entwickeln und Gäste die Entwicklungsfortschritt unter einem Binokular. HINWEIS: Die Experimente werden in der Regel am nächsten Tag hat, um ausreichend Zeit für die Follikel entwickeln kann. S10B ist ~ 5 Stunden, ist S11 ~ 30 min, S12 ~ 2 h und S13 ~ 1 Stunde Dauer bei 25 ° C 1 und Entwicklung bei Raumtemperatur wird etwas länger dauern. Ähnliche Experimente wie für S10B Follikel beschrieben werden kannunter Verwendung von S11-S13 Follikel.
4. Bühnen Isolierung für die Live-Imaging
- Isolieren spät Follikel (S10B-14), in den Fluoreszenzmarker der Wahl mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) in IVEM Medien, schnell bewegt Follikel weg von Schutt.
- Bewegen Sie Follikel von Interesse in neuen Medien und dann durch Glaspipette übertragen, um einem Deckglas Boden Petrischale. Achten Sie auf Medien hinzufügen, so dass es sprudelt in der Deck unteren Bereich, aber nicht überschwappen.
- Für längere Zeitraffer-Filme, ist es manchmal notwendig, um Feuchtigkeit in der Petrischale durch Zugabe einer aufgerollt Kimwipe, mit Wasser befeuchtet, an den inneren Rand der Petrischale zu halten. Legen Sie den Deckel auf.
- Bild auf einem inversen Mikroskop. Detailauflösung wird der konfokalen Mikroskopie erforderlich. Es ist notwendig, Frequenz-Bildgebung, Beleuchtungsstärke und die Länge des Abbildungsleichen, dies muss unabhängig arbeitet werden für jedes lAbeling Werkzeug-und Entwicklungsprozess.
5. Bühnen Isolierung für die mRNA-Vorbereitung
- Isolieren Sie einzelne Stufe Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) entweder mit Grace oder IVEM Medien.
- Mit einer Glaspipette, verschieben Sie die einzelnen Stufen von Interesse in neue Brunnen mit den Medien, ist es möglich, mehrere Stufen auf einmal zu sammeln.
- Halten Abholzeiten unter 1 Stunde. Bewegen Sie die Follikel, mit einer Glaspipette auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Drehen Sie das Rohr kurz in einem Mini-Mikrozentrifuge, um alle Follikel zu pelletieren. Mit einer Glaspipette gezogen (siehe Schritt 3.4) entfernen Sie vorsichtig alle Medien. HINWEIS: Wenn Sie eine volle Größe Mikro, Spin-Down der Follikel bei niedriger Geschwindigkeit.
- 100 l Trizol und schleifen von Hand für ~ 20 sec mit einem Kunststoff-Stößel. Spin down bei voller Geschwindigkeit in einer Mikro und bewegen Trizol auf ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig, keine pelletiert d störenebris. Bei -80 ° C
- Wiederholen Sie die Schritte 5,1-5,5 bis genügend Follikel wurden für das Experiment erhalten wurde. Routinemäßig ~ 75 S10B, ~ 75 S12 und S14 ~ 100 Follikel ergeben ~ 10 ug RNA.
- Tauen Sie die Proben auf Eis. Kombinieren Proben, gegebenenfalls in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bringen die Trizol Volumen von bis zu 800 ul. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung, wie vom Hersteller gerichtet. WICHTIG: Denken Sie daran, DNase behandeln die isolierte RNA mit RNase freier DNase.
6. Bühnen Isolation für Western Blotting
- Heizen Sie einen Wärmeblock bis 100 ° C
- Isolieren Sie einzelne Stufe Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) entweder mit Grace oder IVEM Medien. HINWEIS: Es ist notwendig, empirisch festzustellen, wie viele von einer bestimmten Stufe Follikel werden benötigt, um jede spezifische Protein zu beobachten. Für stark exprimierten Proteine S10B 1-3 Follikel / gut genug, um ein starkes Signal auf einem Western-Blot zu sehen. Es ist jedoch wichtig, um einerepräsentativen Stichprobe unter Follikel aus mehreren Weibchen. Somit sind 15-20 Follikel einer bestimmten Stufe in der Regel gesammelt.
- Follikel bewegen, unter Verwendung einer Glaspipette in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Spin kurz in einem Mini-Mikrozentrifuge, um die Follikel zu pelletieren (siehe Schritt 5.4). Mit einer Glaspipette gezogen Entfernen Sie vorsichtig alle Medien (siehe Schritt 3.4) und 50 ul 1x PBS und 50 ul 2x Laemmli-Puffer.
- Schleifen von Hand für ~ 20 sec mit einer Kunststoff-Stößel. HINWEIS: Kunststoff Stößel kann zum Schleifen westlichen Proben durch Waschen und Autoklavieren sie wiederverwendet werden.
- Kochen Sie die Proben für 10 min in der Wärmeblock.
- Kühlen Sie kurz auf Eis und Spin bei voller Geschwindigkeit für 15 Sekunden in einer Mikrozentrifuge. Entweder sofort auf eine SDS-PAGE-Gel oder bei -20 ° C laden HINWEIS: Wenn die Proben gespeichert sind, denken Sie daran, die Proben vor dem Laden auf das Gel aufzukochen.
- Führen Western-Blot-Analyse nach Standardprotokollen.
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Representative Results
Bei der Isolierung von spezifischen Stadien der Follikel-Entwicklung von Drosophila ist es wichtig, in der Lage, die unterschiedlichen morphologischen Stufen präzise zu unterscheiden. Dies ist für S10A und S10B etwas schwierig, da die Krankenschwester Zellen und die Eizelle nehmen jeweils die Hälfte der Länge der Follikel in diesen Phasen (Abbildung 1B im Vergleich zu 1C). Jedoch S10A Follikel kürzer als S10B Follikel, da die S10B Follikel vollständig gedehnt und somit in der Länge gleich einem Follikel S14 (Fig. 1C Vergleich zu 1G). Zusätzlich ist eine Teilmenge der Follikel oder somatischen Zellen über die Eizelle genannt zentripetalen Follikel Zellen beginnen, um zwischen den Nährzellen und der Eizelle in S10B wandern in. Während S10B, die ~ 5 Stunden dauert, werden die Zellen durchlaufen Krankenschwester dynamischen Aktin-Umbau, so dass bei S11 die Krankenschwester Zellen Vertrag, drückte ihre zytoplasmatische Inhalt in die Eizelle. So bei S11, hat die Krankenschwester Zellbereichdeutlich zurückgegangen, während die Eizelle hat (Abbildung 1D) erweitert. Bei S12, beginnen die Zellen Krankenschwester zu Tode unterziehen und nehmen auf einem opaken Aussehen (1E), interessanterweise, in der Kultur, Krankenschwester Zellreste locken dorsal in S12 Follikel (siehe S12S in Zahlen 3c'-D '). Bei S13 wird die Krankenschwester Zellenbereich transparent Zelltod nicht abgeschlossen ist, und dorsalen Fortbildung auftritt (Fig. 1F). Mit S14 nur die Eizelle und die Follikel Zellen bleiben, und dorsalen Fortbildung abgeschlossen (1G) ist.
Die in vitro-Entwicklung Test kann verwendet werden, um die Folgen der verschiedenen pharmakologischen Behandlungen und genetische Mutationen auf S10B Entwicklung und Krankenschwester Zelle Dumping (Abbildung 3) zu beurteilen. Die Entwicklung der S10Bs in Kultur ist robust, jedoch eine Reihe von Faktoren kann zu schlechter experimentellen Ergebnissen führen. In 3Aexperimentellen Daten aus einer erfolgreichen und einem fehlgeschlagenen Versuch bereitgestellt. Ein erfolgreiches Experiment ist eines, in dem 80 bis 100% der Wildtyp-Follikel in Kontrollmedien komplett Krankenschwester Zelle Dumping und Fortschritt bis S12-14 (Abbildung 3A, Gew. 1). Gelegentlich Wildtyp-Kontrollen wird scheitern, was bedeutet, dass weniger als 80% der Follikel entwickeln (3A, wt 2). Dieser Fehler kann durch eine Reihe von Fragen, einschließlich verursacht werden: 1.) Unfähigkeit, S10A S10B von Follikeln zu unterscheiden (siehe Abbildungen 1 und 2), 2) Medien-Probleme (Temperatur, Alter, usw.) und / oder 3) Follikel waren um Schmutz zu lange ausgesetzt ist.
In-vitro-Entwicklung von S10Bs kann in Kombination mit pharmakologischen Behandlung verwendet werden. Für solche Experimente ist es wichtig, dass Drogenkontrollen, dh die Behandlung von Wildtyp-Follikel mit der Droge, mit jedem Versuch durchgeführt, weil Arzneimittelwirksamkeit und / oder konzenIon kann mit der Zeit ändern. Für pharmakologischen Experimenten, ist es zweckmäßig, das Verhältnis der prozentualen Entwicklung der Follikel in der medikamentösen Behandlung der in Kontrollmedien zu analysieren, dies steuert für leichte Unterschiede genetischen Hintergrund. Es ist oft sinnvoll, mit dem IC-50-Konzentration der Droge zu behandeln, das ist die Konzentration Blöcke, dass 50% der Wildtyp (yw) von Follikel unterziehen Krankenschwester Zelle Dumping und die weitere Entwicklung. . Somit ist das Verhältnis für die Wildtyp-Follikel voraussichtlich 0,5 (3B, Drogen 1) sein 3B ist ein Beispiel, wie ein Medikament (Aspirin) kann zu konzentriert werden (Drogen 2; wahrscheinlich auf Lösungsmittelverdampfung) und Block- mehr als 50% der Wildtyp-Follikel aus Entwicklungsländern. Um die in vitro-Assay Entwicklung weiter zu erläutern, werden die Bilder von zwei Vertiefungen Entwicklungs S10B Follikel vorgesehen. 3C und D veranschaulichen die S10B Follikel zu Beginn derAssay, in Steuer-oder Aspirin behandelt (~ 2 mM) Medien. 3C 'und D' veranschaulichen das Ende des Tests zeigte, dass die Mehrheit der bis S14 entwickelt, während die Mehrheit der Aspirin behandelt Follikel keine Kontrolle behandelt Follikel Krankenschwester abgeschlossen Zelle Dumping.
Die in vitro Entwicklung Assay kann auch verwendet werden, um genetische Hintergründe, die empfindlicher auf ein bestimmtes Medikament sind screenen. 3E enthält zwei Beispiele dafür. In dem ersten Beispiel der genetische Hintergrund (expt1, blaue Balken) nicht mit Aspirin als das Verhältnis bleibt ~ 0,5, und umgekehrt, in dem zweiten Beispiel, der genetische Hintergrund (expt2, roter Balken) verstärkt die Wirkung von Aspirin. Somit kann die in vitro Entwicklung Assay verwendet, um die Auswirkungen von Mutationen und pharmakologische Reagenzien auf die Entwicklungs-und morphologischen Ereignisse während der Oogenese spät auftretende definiert werden, zusätzlich der Assay kann verwendet werden, um sowohl die pharmakologischen und genetischen Wechselwirkungen zu beurteilen (siehe 9).
Bühnen Isolierung kann auch für die Live-Darstellung von Entwicklungsprozessen verwendet werden. 4 ist ein Beispiel für ein Zeitraffer-Film eines S10B Follikel ausdrücken Utrophin-GFP, die Aktin-Bindedomäne aus menschlichen Utrophin auf grün fluoreszierenden Protein fusioniert. Mit dieser Imaging-Tool, Aktin Bündel Bildung und Kondensation können visualisiert werden. Viele Werkzeuge sind für Live-Imaging, einschließlich Protein-Falle transgenen Linien 16,17 verfügbar, UAS angetrieben fluoreszenzmarkierten Organelle Marker (Mitochondrien, Golgi-Apparat, endoplasmatischen Retikulum, etc.), Fachhochschule gefahren fluoreszenzmarkierten Zytoskelett-Marker (Aktin und Aktin-bindenden Proteinen, Mikrotubuli und Mikrotubuli-bindende Proteine), transgenen Linien exprimiert einem fluoreszenzmarkierten Protein von Interesse und Vitalfarbstoffen (Nile Red Etiketten neutralen Lipiden, Edu Etiketten replizierende DNA, FM4-64-Etiketten-Membranen).
ove_content "> Molekulare Analysen durchgeführt unter Verwendung von isolierten Stufen Drosophila Follikel werden. zur Proteinanalyse durch Western-Blotting, ist es erforderlich, empirisch zu bestimmen, wie viele Follikel, der einem bestimmten Stadium der Entwicklung, sind erforderlich, um das Protein von Interesse zu beobachten. Fig. 5 ist ein Beispiel, wie man nacheinander Verdünnung einer konzentrierten Protein-Lysat, um die Anzahl der S10B Haarfollikel benötigt, um ein bestimmtes Protein, Fascin beobachten bestimmen. In diesem Fall einen S10B Follikel ist ausreichend, um dieses Protein durch Western-Blot zu beobachten.
Abbildung 1. Diagramm, das die zelluläre Zusammensetzung von Drosophila Follikel und Bilder, die die morphologische Differenz der mittleren bis späten Stadium Drosophila follicles. A. Diagramm, das die zelluläre Zusammensetzung eines S10A Follikel. BG. Repräsentative Bilder der S10A-S14 Drosophila Follikel genommen mit einem Stereo-Binokular. Die Drosophila Follikel aus 16 Keimbahn-Zellen abgeleitet: 1 Oozyte (rot, A) und 15 Krankenschwester oder Trägerzellen (gelb, A), die von ~ 650 somatisch abgeleiteten Epithelzellen (Weiß, Magenta und Cyan, A umgeben sind, ). Bei S10A wird die eine Hälfte der Länge der Follikel der Nährzellen (gelbe Klammer, B), die von den Dehnungs Follikelzellen (Magenta in A) abgedeckt sind zusammengesetzt ist, und die andere Hälfte wird von der Eizelle (rotes Sternchen zusammengesetzt , B), die von den Hauptkörper Follikel Zellen (weiße in A) bedeckt ist. Bei S10B, die Nährzellen (gelb Halterung, C) und Eizelle (roten Sternchen, C), die jeweils die Hälfte der zusammen length der Follikel jedoch die Gesamtlänge des Follikels ist nun gleich der eines S14 Follikel (vergleiche C bis G). Während S11, die Nährzellen (gelb Halterung, D) schnell ihre zytoplasmatische Inhalt in die Verlängerung Eizelle (roten Sternchen, D) in einer Aktin / Myosin-abhängigen Prozess Squeeze bezeichnet Krankenschwester Zelle Dumping. Mit S12 hat die Eizelle (roten Sternchen, E) vollständig als Krankenschwester Zelle Dumping länglich ist vollständig und nur Krankenschwester Zellreste bleiben (gelbe Klammer, E). Die Krankenschwester Zellreste (gelbe Klammer, F) komplett Zelltod bei S13. S14 steht für die vollständig reifen Follikel, die der Eizelle (roten Sternchen, G), somatische Zellen und Eierschale, einschließlich der Rückenanhänge (weiße Pfeile, G). B. Maßstabsbalken = 0,1 mm besteht.
Abbildung 2. Bilder einen Überblick über Eierstock Follikel Präparation und Isolation. A. Tauchen Sie die Fliege in den Medien seziert und so ausrichten, dass es gehalten wird, durch die Zange, in der nicht-dominanten Hand. B. Verwenden der dominanten Hand, greifen die Nagelhaut am hinteren des Bauches. C. Ziehen Sie die Nagelhaut ab, Aussetzen der Eierstöcke (gelber Pfeil). D. Arbeit aus der vorderen Richtung des Bauches der hinteren, drücken Sie leicht den Bauch Freigabe der Eierstöcke (gelber Pfeil). E. Trennen Sie die Eierstöcke (gelber Pfeil) von jedem verbleibenden Nagelhaut (rote Pfeilspitze) und / oder inneren Organe (weiße Pfeilspitzen). F. Übertragen Sie die Eierstöcke isoliert auf einem frischen und enthält Sezieren Medien. G. Tease abgesehen die Eierstöcke mit Sezieren Nadeln, um indi aussetzeneinzelnen Follikel (vergleiche intakten Eierstock-(oben) abgetrennt Ovar (unten). Weiß Pfeilspitze zeigt auf eine gestochen S10B Follikel ein Beispiel eines Follikels, die nicht für nachfolgende Experimente. H. auswählen morphologische Phasen von Interesse (Stufen 10a verwendet werden sollte, -14 (S10A-S14) gezeigt).
Abbildung 3. Beispiele für in-vitro-Assays Entwicklung. A. Tabelle der Prozentsatz der S10B Follikel, die komplette Entwicklung in der Kultur. Gew. 1 ist ein Beispiel der zu erwartenden Entwicklung der Wildtyp-S10B Follikel (96% Entwicklung), während Gew. 2 ist ein Beispiel für schlechte Entwicklung in der Kultur (68% Entwicklung). Wir würden in der Regel verwerfen das ganze Experiment, wenn die Entwicklung von Wildtyp-S10B Follikel in Kontrollmedien ist unter 80%. B. IC-50 für Aspirin auf den Prozentsatz Entwicklung in Steuer Medien. Der IC 50 ist die Konzentration, die Blöcke 50% der S10B Follikel aus Entwicklungs, das heißt, das Wildtyp-Wert sollte ~ 0,5 betragen. Drug 1 ist ein Beispiel des zu erwartenden Wildtyp-Verhältnis (0,52), während die Drogen 2 ist ein Beispiel dafür, was passiert, wenn die Wirkstoffkonzentration zu stark (0,37). CD '. Bilder von in-vitro-Entwicklung Brunnen. CC'. Kontrolle behandelt. DD '. Aspirin behandelt (~ 2 mm). CD. Bild des S10Bs zu Beginn des Assays. C'-D'. Bild der Follikel am Endpunkt des Assays. Kontrolle behandelt S10B Follikel entwickeln, um S14s in Kultur (C '), während die Mehrheit der Aspirin behandelt Follikel nicht, Krankenschwester Zelle Dumping (D vervollständigen').
4. Beispiel für die Verwendung von isolierten S10B Follikel für Live-Bildgebung. AF. Maximale Projektionen von drei Scheiben von Zeitraffer-z-Stacks einer S10B Follikel von Utrophin isoliert :: GFP-exprimierenden transgenen Fliegen (SQH-Utrophin :: GFP). A'-F '. Vergrößerte Einsätze markieren Sie eine einzelne Zelle von Krankenschwester A- F. AF ". F-Actin (Utrophin :: GFP), weiß. A, A 'Zeit (t). = 0 min. B, B'. T = 20 min. C, C '. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. In der Anfangszeit Punkt können kurze Aktin-Filamente, die sich nach innen von der Krankenschwester Zellmembranen (A, A ') beobachtet werden. Diese Aktinfilamente länglich in den frühen Zeitpunkten (BC 'im Vergleich zu A, A'), bis sie vollständig verlängerten (D, D ') sind. In späteren Zeitpunkten diese komplett gestreckt Aktinfilamente dann verkürzen und kondensieren in ganz Krankenschwester Zelle Dumping (EF) A. Skala bar = 50 um. A '. Skala bar = 10 um.
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.. Abbildung 5 Illustration, wie die Zahl der Follikel benötigt, um ein bestimmtes Protein durch Western-Blot-Analyse untersuchen bestimmen Dies ist eine Western-Blot-Blick auf Fascin-Expression in S10B Follikel (1:20, sn 7C, Cooley, L.; Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und von der Universität von Iowa, Fachbereich Biologie, Iowa City, IA, 52242) gehalten. Die Zahlen über die Spitze stellen die ungefähre Anzahl der S10B Follikel pro Spur geladen.
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Discussion
Die Drosophila Follikel von nur einer kleinen Anzahl von Zelltypen aufgebaut, so dass es ideal für morphologische und molekulare Analysen. Außerdem ist es aufgrund der Struktur des Eierstocks, ist es relativ einfach, eine große Zahl von spezifischen Stadien der Follikel-Entwicklung mit einem gemeinsamen Binokular und minimales Training erhalten. Wie jede Stufe stellt eine kurze Zeitfenster, können Stufen-Isolations signifikante Einblicke in die molekularen Entwicklungsprozesse während dieser Phase auftretenden bieten. Zum Beispiel haben wir im mittleren bis späten Stadium Follikel Isolierung verwendet, um die Veränderungen der Genexpression während S10B, S12, S14 und 18 auftretenden charakterisieren. Diese Analyse legt nahe, eine Reihe von bisher nicht charakterisierte Gene wahrscheinlich zu Follikel-Entwicklung beitragen und insbesondere, Eierschalenbildung sind.
Bühnen Isolation kann dramatische Einblicke in morphologische Veranstaltungen durch Live-Bildgebung. Solche Bildgebung kann auf al durchgeführt werden l Stadien der Drosophila Follikel Entwicklung. Germarium 13, Follikel-Dehnung 19 und Stufe 9 11,12,14: Während der Schwerpunkt der Arbeit ist S10B-14, werden die Leser in den folgenden Artikeln für die Live-Darstellung von früheren Stadien bezeichnet. Die in diesen Studien verwendeten Kulturbedingungen unterscheiden sich von denen in dieser Arbeit diskutiert. Insbesondere verwendet diese Studien Schneiders Insektenmedien mit variablen Mengen an FBS (2,5-15%), sowie der Zugabe von Insulin 11-13,19 und in einigen Fällen auf den weiteren Zusatz von Trehalose, Methopren, 20-Hydroxyecdyson und Adenosin Deamidase 14. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass diese Live-Imaging-Studien haben wesentlich das Verständnis der Ereignisse während dieser frühen Entwicklungsstadien auftreten fortgeschritten. Jedoch können diese frühzeitig Follikel nicht Fortschritt hin zur letzten Stufe der Follikelentwicklung, S14. Umgekehrt wird S10B-13 bis S14 in der Kultur zu entwickeln.
ove_content "> Während S10B-S14 viele morphologische Prozesse auftreten, die durch Live-Bildgebung untersucht werden. kann beispielsweise Live-Aufnahmen verwendet werden, um den Prozess der Zell Krankenschwester untersuchen Dumping, der Prozess, durch den die Krankenschwester Zellen drücken ihre zytoplasmatische Inhalt in die Eizelle , um es mit allem, was es braucht, um die Embryogenese zu vervollständigen. Krankenschwester Zelle Dumping durch Zeitraffer-Bildgebung mit Durchlicht 7 oder durch konfokale Bildgebung mit transgenen Linien ausdrückt Fluoreszenzmarker (siehe Abbildung 4). Fortsetzung Verwendung von Live-Aufnahmen beobachtet werden kann ist zu erwarten, liefern neue Einblicke in die Dynamik des Zytoskeletts für Krankenschwester Zelle Dumping erforderlich. Live-Bildgebung von späteren Stadien auch zu unserem Verständnis von Rücken Anhängsel Primordia Migration und Tubulogenese 10.In-vitro-Entwicklung von Follikeln S10B-S13 können die pharmakologischen Wirkungen der beiden Reagenzien und genetischen Manipulationen auf die Prozesse definieren auftretenRing während dieser Zeit. Wir haben in vitro Entwicklung der Follikel S10B verwendet, um die Rolle von Prostaglandinen bei der Regulierung des Zell Krankenschwester Dumping 7 etablieren. Anschließend haben wir mit Hilfe dieses Tests, um eine pharmakologisch-Interaktion Bildschirm durchzuführen; gesagt, wir haben getestet, ob der Verlust eine Kopie einer Aktin-Regler verstärkt oder unterdrückt die Krankenschwester Zelle Dumping Mängel durch den Verlust von Prostaglandinen. Dieser Bildschirm hat eine Reihe von vermeintlichen Ziele abwärts (9 und Spracklen, Meyer und Tootle, unveröffentlichte Daten) offenbart. Der Test kann auch verwendet werden, um genetische Interaktionen durch die Beurteilung Entwicklungsstörungen, wie ein Block in Krankenschwester Zelle Dumping, durch Heterozygotie für zwei verschiedene Faktoren (zum Beispiel hierzu siehe 9) zu untersuchen.
Während die Isolierung mittleren bis späten Stadium Drosophila Follikel ist ein recht einfacher Prozess, es gibt eine Reihe von kritischen Faktoren für optimalen Erfolg. Zunächst wird die Herstellung der Fliegensehr wichtig. Am besten ist es, verschiedene Genotypen von Fliegen in einer möglichst ähnlichen Zustand wie möglich zu halten, dh die Anzahl der Fliegen pro Fläschchen, das Verhältnis von Frauen zu Männern (Verhältnis 2:1 ist ideal), und für frische, feuchte Hefe konsequent. Die Fütterung (Nass Hefe) und Dissektion Zeit wird die Prävalenz der verschiedenen Stadien der Entwicklung ändern. Wir haben gefunden, dass, wenn die Fliegen konsequent morgens eingespeist, kann mehr S10Bs morgens isoliert werden, während mehr S12S nachmittags vorhanden sind. Ein zweiter wichtiger Faktor ist die Medien. Für die in vitro Entwicklung und Live-Aufnahmen ist es wichtig, frische IVEM Medien vorzubereiten. Zusätzlich müssen die Medien auf Raumtemperatur kommen als kalte Medien wird die Zytoskelett verändern, sowohl Aktin und Mikrotubuli, und deshalb stören die weitere Entwicklung. Es ist auch wichtig, um die Follikel von Ablagerungen zu halten. Manchmal, während der Präparation, der Darm wird mit den Eierstöcken kommen. Wir haben gefunden, dass, wenn der Darm zerrissenund die Follikel in der verunreinigten Medien gehalten, sind die Follikel unwahrscheinlich, dass in der Kultur zu entwickeln. Wie die Follikel weiterhin in Kultur zu entwickeln, ist es wichtig, die Inszenierung nach der Sektion mit vor entweder in vitro Entwicklung oder molekulare Analysen fortfahren erneut überprüfen. Schließlich ist es wichtig, geeignete Kontrollen für die Experimente haben. Für die in vitro-Entwicklung, ist es notwendig, Wildtyp-Follikel zu verwenden, um zu testen, dass die Medien für eine normale Entwicklung ermöglicht (80-100% abgeschlossen Krankenschwester Zelle Dumping) und zu testen, dass pharmakologische Reagenzien handeln wie erwartet (siehe Abbildung 3).
Abschließend Isolierung von mittleren bis späten Stadium Drosophila Follikel kann wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse durch eine Vielzahl von experimentellen Techniken.
Tabelle der spezifischen Reagenzien und Ausrüstungen:
| Name des Reagens | Firma | Katzealogue Nummer | Kommentare (optional) |
|---|---|---|---|
| Trockenhefe | Genesee Scientific | 62-103 | Jede Quelle der Trockenhefe ist in Ordnung |
| Grace Insektenmedien | Lonza | 04-457F | |
| Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum | Atlanta Biologicals | S11050H | Jede hitzeinaktiviertem FBS sollte funktionieren |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Schraubstöcke und Pin-Nadeln | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot-Teller, Nine Gut | Corning | 7220-85 | |
| # 5 Dumont Pinzette | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 Multiwell-Platten | Becton Dickinson | 35 3226 | Beliebig 24-Loch-Gewebekulturschale funktionieren sollte |
| Deckglas Bottom Dishes (35 mm) | MatTek Gesellschaft | P35G-1.0-14-C | Deckglasdicke auf das Mikroskop / Ziel verwendet abhängen |
| Glaspipetten | Corning | 7095B-5x (für die Übertragung von Follikel) 7095B-9 (zur Herstellung gezogen Pipetten) | |
| Beispiel Stößel (1,5 ul; RNase / DNase frei) | Forschung Products International | 199228 | Alle Kunststoff Stößel, die 1,5 ul-Mikrozentrifugenröhrchen passt kann verwendet werden, |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
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Disclosures
Es gibt nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Thomas Lecuit (SQH Utrophin :: GFP-Linie), die Bloomington Stock Center, und der Entwicklungsforschung Hybridoma Bank für Reagenzien danken. Wir danken ferner alle Mitglieder der Tootle Lab für hilfreiche Diskussionen und Kritiken des Manuskripts. Finanzierung durch die National Science Foundation MCB-1158527 und Start-up-Fonds aus der Anatomie und Zellbiologie Department, University of Iowa unterstützt diese Arbeit. National Institutes of Health Predoctoral Ausbildungsförderung in Pharmakologische Wissenschaften T32GM067795 AJS unterstützt. Datenspeicherung Unterstützung wurde von der ICTS, die durch die CTSA vom National Center for Research Resources und dem National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unterstützt durch Zuschuss UL1RR024979 finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
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