Summary
في هذا المنشور، نحن تصف الإجراء السريع ومريحة للعزل وزراعة الخلايا الأولية عنيبي البنكرياس من البنكرياس الفئران. يشكل هذا الأسلوب نهجا قيما لدراسة علم وظائف الأعضاء من خلايا البنكرياس الطازجة الأولية العادي / هو دون تغيير إفرازات.
Abstract
يسمح هذا البروتوكول العزلة السريع (في أقل من 1 ساعة) من عنيبات البنكرياس الفئران، مما يجعل من الممكن للحفاظ عليها في الثقافة لمدة أسبوع واحد أو أكثر. ويمكن الحصول على أكثر من 20 × 10 6 خلايا البنكرياس عنيبية من الفئران واحدة. يوفر هذا البروتوكول إمكانية لمعالجة بشكل مستقل ما يصل الى 10 البنكرياس في نفس الوقت. لأنه يحفظ العمارة عنيبي، وهذا نموذج مناسبة تماما لدراسة علم وظائف الأعضاء من إفرازات البنكرياس في المختبر وعلى النقيض من خطوط الخلايا التي أنشئت من أورام البنكرياس، والذي عرض العديد من التعديلات الوراثية مما يؤدي إلى فقدان جزئي أو كلي للتمايز عنيبي بهم.
Introduction
وثمة مشكلة واجهت كثير من الأحيان لمختبرات البحوث تعمل على أنسجة البنكرياس الإفرازية هو صعوبة زراعة خلايا عنيبية في المختبر لفترة من الزمن طويلة بما فيه الكفاية للسماح لتجربة طويلة الأجل.
أحد العوامل التي تعوق تطوير نظم الاستزراع هذه هي حساسية لا يتجزأ من نسيج البنكرياس للتلاعب التجريبية ويرجع ذلك إلى نسبة عالية في الانزيمات حال السكر، بروتين، دهون و، الذي هضم حرفيا نسيج البنكرياس عندما يتم اطلاق سراحهم خلال عزل خلايا البنكرياس.
والعامل الثاني هو ملحوظ في اللدونة المختبر من خلايا عنيبية، والتي تميل الى فقدان الخصائص الإفرازية وtransdifferentiate إلى الخلايا الناضجة الأخرى، مثل خلايا البنكرياس القنوي أو الخلايا الكبدية، مثل 1. في المختبر، هذه اللدونة الخلية يختلف مع الظروف التجريبية (مثل ثقافة تكوين متوسطة) 2 1.
وقد وضعت عدة طرق للعزلة وثقافة من الخلايا عنيبي، أول من خنزير غينيا 3-5 البنكرياس. في البداية، تلك البروتوكولات المعنية هضم أنسجة البنكرياس مع كولاجيناز، كيموتربسين، وكوكتيل البروتيني، مع العزلة في نهاية المطاف من قبل تفارق الميكانيكية قوية. خلايا البنكرياس معزولة بهذه الطريقة عرض الخصائص الهيكلية والوظيفية غير طبيعي، لا سيما فقدان الهياكل قمية وأضرار كبيرة لمستقبلات الغشاء. ظلت الخلايا المعزولة قابلة للحياة فقط 1 أو 2 أيام.
فرقت إعداد يحافظ عنيبات داخل وبين الخلايا الهندسة المعمارية الخاصة بهم، والحفاظ على أغشية الخلايا، مما يحد من الأضرار التي لحقت المستقبلات السطحية، وبالتالي تحسين إفراز إفرازات ردا على secretagogues 6-8. باعتبارها دورة الفتشوبLT، وهذه الطريقة توفر الميزة الرئيسية لتمديد عنيبي بقاء الخلية إلى 7-10 أيام في المختبر. وعلاوة على ذلك، ويفضل هذا الأسلوب حاليا إلى العزلة خلية عنيبية 9-12 لأن صيانة من الاتصالات بين الخلايا، بما في ذلك اقتران الخلية عن طريق تقاطعات الفجوة، هو من العوامل الأساسية لإفرازات البنكرياس عنيبية الخلية النمط الظاهري 13.
كما فقد التمايز للخلايا عنيبية وtransdifferentiation على خلايا الأقنية هي واحدة من الآليات المقترحة لنشأة العدوانية سرطانات البنكرياس الإفرازية 14، وعنيبات نموذج فرقت هو أيضا نظام ملائم لدراسة اللدونة البنكرياس وآلياته الجزيئية لاحقة. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا 15،16 وتطوير تقنيات نقل الجينات (الغدانية 2 أو تنبيغ lentiviral، واستخدام الجسيمات النانوية، الخ)، وهذا في المختبر نموذج خلية عنيبية الأولية يمكن أنأن تكون مفيدة جدا في تحديد كيفية تأثير مختلف الاختلالات الجينية تنظيم عنيبي تمايز الخلايا أو فقد التمايز وينبغي توفير فهم أفضل للأحداث الجزيئية المسؤولة عن ظهور التهاب البنكرياس، الآفات السابقة للتسرطن، والتغيرات في اللدونة الخلية.
عزل فرقت عنيبات هو النهج التي نستخدمها في مختبرنا لخلايا البنكرياس عنيبية الثقافة. نحن هنا وصف ومناقشة الطريقة المستخدمة. أنها تنطوي تفارق الأنزيمية من نسيج البنكرياس (مع كولاجيناز البكتيرية) بالإضافة إلى اضطراب الميكانيكية دون تفكك خلايا عنيبية. في حين أن معظم بروتوكولات تشمل استزراع عنيبات، سواء في التعليق أو على ركائز من البلاستيك معاملة خاصة، ونحن تنمو لهم في التعليق لفترة وجيزة فقط (لمدة 24 ساعة)، بذر منهم بعد ذلك على السقالات مصفوفة إذا كان المطلوب زراعة الخلايا لفترات طويلة.
هذا البروتوكول يسمح العزلة السريع (في أقل من 1 ساعة) من فرقت البنكرياس ACINI ومستدامة لمدة أسبوع واحد أو أكثر في الثقافة. لأنها تتيح عزل أكثر من 20 × 10 6 خلايا البنكرياس عنيبية في الماوس. بساطته يجعل من الممكن لمعالجة بشكل مستقل ما يصل الى 10 البنكرياس في نفس الوقت. عن طريق الحفاظ على الهندسة المعمارية داخل وبين الخلايا من عنيبات وبالتالي النمط الظاهري عنيبي من الخلايا الأولية معزولة، وهذا النموذج يشكل النظام خيارا بالنسبة للدراسة آليات transdifferentiation، كما تستمد جميع الموديلات البنكرياس الإفرازية الأخرى المتاحة حاليا من أورام البنكرياس عرض الوراثية العديد من التعديلات التي تؤدي إلى التحول الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات تحت التنظيمية للسلطة الحكومية ("Comité D'التقييم COMMUN الاتحاد الافريقي ليون بيرار مركز، à L'Animalerie دي العبور DE L'ENS، والاتحاد الافريقي وآخرون PBES الاتحاد الافريقي مختبر P4" (CECCAPP)). واستمرت الفئران في منشأة معينة خالية من مسببات الأمراض الحيوانية في "Plateforme AniCan، مركز ليون بيرار" (ليون، فرنسا) والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
ويرد التمثيل التخطيطي الإجراء في الشكل 1.
1. تشريح البنكرياس وتفتيت (يوم 0)
A تشريح السريع جدا هو أمر حاسم لعائد الأمثل لاستخراج ولتأمين استمرارية جيدة من الخلايا في الثقافة. من أجل تقليل الوقت اللازم لعزل البنكرياس، يجب على جميع الأجهزة و المعدات لتكون جاهزة قبل القتل الرحيم الماوس.
- الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق أو خلع عنق الرحم.
من هذه الخطوة، وجميع الإجراءات يجب أن تؤديها في إطار جو معقم (الميكروبيولوجية مجلس الوزراء السلامة، من المستوى الثاني) مع معدات تشريح العقيمة.
- إصلاح الماوس ورش البطن الفأر مع الايثانول 70٪. مع أي مقص تشريح وملقط، وجعل شق على شكل حرف V في المنطقة التناسلية وتستمر ليصل إلى الحجاب الحاجز لفتح تماما تجويف البطن.
- ضع فصوص الكبد ضد الحجاب الحاجز، بل ينبغي أن تظل هناك إذا تجويف الجسم مفتوح بعيدا بما فيه الكفاية. سحب الأمعاء والقولون خارج تجويف البطن إلى يسارك، والعثور على المستقيم. مع زوج من ملقط المنحني وتشريح مقص، والاستيلاء على القسم المستقيم.
- مع نفس زوج من ملقط، انبسط بعناية تماما الأمعاء من المستقيم إلى المعدة عن طريق سحب الأمعاء على يسارك.
- باستخدام مقص نويس وزوج من ملقط، وقطع بعناية البنكرياس على طول الأمعاء وتحريرها مع الطحال من بقية الجهاز الهضمي.
- الاستيلاء على الطحال والبنكرياس قسم مرفقة به (الشكل 2).
في هذه الخطوة، تأكد من أن لا الأنسجة الدهنية المساريقي و / أو الأنسجة المجاورة الأخرى (الطحال والأمعاء، إلخ) يمكن جمعها مع البنكرياس، لتجنب التلوث الخلوية.
لبقية الإجراء، يجب أن يكون مستعدا جميع مخازن الكالسيوم دون أيون الكالسيوم 2 + chelators لتجنب التفكك الكامل للأنسجة البنكرياس الإفرازية في خلايا عنيبية واحد.
- شطف البنكرياس مرتين في محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) 1X.
في هذه الخطوة، سوف تطفو والأنسجة الدهنية على عكس البنكرياس التي من شأنها أن تغرق، فمن الممكن بسهولة لتصور وبسرعة ازالة الملوثات أبيض الأنسجة الدهنية لا تزال تعلق على البنكرياس.
إذا يحتاج البنكرياس ليتم نقلها إلى مرفق خلية ثقافة، يجب أن يوضع على الجليد في HBSS 1X.
- نقل البنكرياس في طبق بتري معقمة تحتوي على 5 مل من HBSS 1X. باستخدام مقص نويس ومشرط، شريحة البنكرياس في قطع صغيرة من 1-3 مم 3 (الشكل 3A).
2. Dissociations الأنزيمية والميكانيكية للبنكرياس (يوم 0)
- نقلها إلى العقيمة 50 مل أنبوب البولي بروبلين.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 450 XG و 4 ° C. نضح وتجاهل طاف لإزالة شظايا الخلية وخلايا الدم.
- إضافة 10 مل من كولاجيناز حل IA (HBSS 1X تحتوي على 10 ملي HEPES، 200 U / مل من collagenaSE IA، و 0.25 ملغ / مل من التربسين المانع) إلى أقسام البنكرياس. باستخدام 25 مل ماصة المصلية، نقلها إلى 25 سم 2 قارورة. احتضان لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. خلال هذا الوقت (كل 5 دقائق)، إجراء تفارق الميكانيكية عن طريق تحريك بقوة ذهابا وإيابا شظايا البنكرياس حوالي عشر مرات، في ماصات معقمة من تناقص حجمها (25، 10، و 5 ماصات المصلية مل).
في هذه الخطوة، فمن الضروري لرصد كثير من الأحيان مدى تفارق الأنزيمية من أقسام البنكرياس.
- عندما يبدو أن نسيج البنكرياس ليكون جيدا فصلها (وفقا لاختفاء أجزاء البنكرياس وزيادة العكارة من الحل) (الشكل 3B)، ووقف رد الفعل الأنزيمية وذلك بإضافة 10 مل من البرد مخزنة غسل حل (HBSS 1X تحتوي على 5 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10 HEPES ملم).
- تحويلها إلى العقيمة 50 مل أنبوب البولي بروبلين والمركifuge لمدة 2 دقيقة في 450 XG و 4 ° C. نضح بعناية وتجاهل طاف لإزالة الحل IA كولاجيناز.
- Resuspend وغسل بيليه مع 10 مل من محلول الغسيل مخزنة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 450 XG و 4 ° C. نضح بعناية وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
3. الترشيح والبذر من تفرقوا عنيبات (يوم 0)
- Resuspend وبيليه الخلية في 7 مل من المتوسط Waymouth التي تحتوي على FBS 2.5٪، 1٪ البنسلين، الستربتوميسين خليط (PS)، 0.25 ملغ / مل من التربسين المانع، و 25 نانوغرام / مل من المؤتلف عامل نمو البشرة الإنسان (صندوق تعديل العولمة الأوروبي).
- رشح الخليط الخلية عن طريق السماح لها بالمرور من خلال 100 ميكرون مرشح للاحتفاظ شظايا غير المهضوم (القنوات، والأوعية الدموية، وانجرهانز الجزر). هياكل عنيبي البنكرياس (عنيبة من 10-15 الخلايا) بالمرور.
- شطف تصفية مع 6 مل من المتوسط تحتوي على FBS Waymouth، وتبسيط العمليات، والتربسين INHibitor، وصندوق تعديل العولمة الأوروبي.
بعد هذه الخطوة، فإن الخلايا يجب أن تعامل بعناية فائقة، لتجنب أي عنيبات التفكك.
- البذور عنيبات معزولة في طبق ثقافة 6 جيدا (2 مل لكل بئر) (الشكل 3C). ثقافة لهم عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ (V / V) CO 2 الغلاف الجوي.
بعد هذه الخطوة، يتم استزراع الخلايا عنيبي في التعليق.
4. عنيبي خلية ثقافة (اليوم 1-10)
- بعد أربع وعشرين ساعة، ونقل عنيبات (في التعليق) في طبق ثقافة جديدة 6 جيدا، للقضاء على الخلايا الملوثة وبقايا الخلوية التي انضمت ليلة وضحاها (الشكل 4).
إذا احتاج ثقافة الخلية إلى أن تمتد لعدة أيام أو إذا اقتضت الظروف التجريبية الخلايا المزروعة في أحادي الطبقة، فمن المستحسن لنقل والبذور عنيبات على السقالات المصفوفة.
- قبل يوم ونرىقرع على دعم مصفوفة (يوم 0)، ومعطف طبق ثقافة 6 جيدا مع النوع الأول من الكولاجين (5 ميكروغرام / سم 2). إضافة 1 مل من النوع الأول حل الكولاجين (50 ميكروغرام / مل في 0.02 M حمض الخليك، 0.2 ميكرون تصفية) إلى كل بئر والسماح لها كثف بشكل سلبي على البلاستيك، خلال 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ).
- نضح نوع أنا الكولاجين الحل وشطف مرتين المغلفة بشكل جيد مع الفوسفات مخزنة المالحة 1X.
- تسمح المغلفة جيدا لتجف (في إطار مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية) لا يقل عن 12 ساعة قبل الاستخدام.
- نقل عنيبات الأولية المعزولة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1) في النوع الأول من الكولاجين المغلفة طبق ثقافة 6 جيدا وثقافة لهم في نفس الظروف كما هو موضح سابقا (عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ (V / V) CO 2 الغلاف الجوي) . الخلايا التمسك النوع الأول الركيزة الكولاجين لمدة 2 ايام.
- في يوم 3، وتغيير ثقافة المتوسط للقضاء على الخلايا غير قابلة للحياة التي لم تنضم. مع الوقت في الثقافة، فإن الخلايا SP تدريجياقراءة على الدعم المحتوية على الكولاجين. تغيير ثقافة المتوسط كل 3 أيام (الشكل 5).
الخلايا عنيبي المعزولة التي تم الحصول عليها يمكن عدها، بعد التفكك الميكانيكية كاملة باستخدام خلية العد غرفة توما. لاحظ أن الخلايا عنيبي معزولة لا يمكن الحفاظ عليها في ثقافة بعد ذلك.
يمكن التحكم في نوعية الثقافة عنيبي الحصول عليها عن طريق التحقق من التعبير عن علامات محددة عنيبي مثل مولد التريبسين والبنكرياس عامل النسخ 1 الوحيدات ألفا، أو A1 كربوكسي ببتيداز (بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية أو التجارب المناعي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 schematizes على "فرقت" طريقة عنيبات للتعليم الابتدائي عنيبي زنازين العزل. يتم وصف الخطوات الحاسمة التي يجب أن تحترم بدقة خلال البروتوكول، في جزء المناقشة.
لتسهيل زواله، البنكرياس لابد من جمعها من البطن جنبا إلى جنب مع الطحال المرفقة (الشكل 2). تحتاج كلا الجهازين لا بد من تخفيض حدة، ويجب إزالة الأنسجة الدهنية المتبقية يمكن أن تزال تعلق على البنكرياس (الخطوة 1.6).
الكلي والصور المجهرية، التي تظهر في الشكل (3)، وتمثل النتيجة بعد كل خطوة واحدة من dissociations الأنزيمية والميكانيكية في البنكرياس. بعد تشريح، يتم تقسيم البنكرياس إلى أجزاء صغيرة (الشكل 3A؛ الخطوة 1.8). ويبين الشكل 3B الجانب من البنكرياس بعد تفكك الأنزيمية ناجحة الاعتماد على tempor حذراآل رصد عملية الهضم الجارية (الخطوة 2.4). هذه الخطوة هي خطوة حاسمة لتحديد الوقت بالضبط ما هو مطلوب. الشكل 3C يبين المواد التي تم الحصول عليها بعد الترشيح من خليط البنكرياس (الخطوة 3.4). يتم الاحتفاظ عنيبات جيدا يفصل بينهما سوى بعد هذه الخطوة.
الشكل 4 هو نموذجي يوم 1 التوضيح من البنكرياس معزولة عنيبات باستخدام بروتوكول لدينا. نقل خلايا عنيبية في طبق ثقافة جديدة تسمح للقضاء على شظايا الخلوية والخلايا الملوثة ملتصق (الخطوة 4.1).
كما هو مبين في الشكل (5)، عندما مثقف على النوع الأول من الكولاجين، والخلايا عنيبي نشر وتفقد التمايز عنيبي الخاصة بهم (التشكل وتنظيم 3D)، مما أدى إلى أحادي الطبقة من المغزل على شكل خلايا (الخطوة 4.6).
الشكل 1. التمثيل التخطيطي للبروتوكول يسمح عزلة الماوس الأساسي فرقت عنيبات.
الشكل 2. علم التشريح الإجمالي من البنكرياس بعد تشريح. السهام الحمراء والصفراء تشير على التوالي الاتصالات التشريحية المتبقية مع الطحال والأنسجة الدهنية المساريقي التي تحتاج إلى أن تقطع لجمع البنكرياس.
الشكل (3). فرقت عنيبات العزلة (يوم 0) تصور عن طريق الملاحظة العيانية (اللوحة اليسرى) وعلى النقيض من المرحلة المجهري (اللوحة اليمنى، التكبير 40X). A) بعد تفتيت (كما هو موضح في 25 سم 2 قارورة). B) بعد كولاجيناز IA الهضم وقوية الميكانيكية dissociatiعلى. C) وبعد الترشيح ونقل في طبق ثقافة 6 جيدا.
الشكل 4. فرقت عنيبات ثقافة، 24 ساعة بعد البذر (يوم 1)، تصور بواسطة المجهر على النقيض من المرحلة (التكبير 40X).
الشكل 5. فرقت ثقافة عنيبات على النوع الأول من الكولاجين طبق المغلفة في أيام 2 و 4 و 7 تصور بواسطة المجهر على النقيض من المرحلة (40X، 120X، 240X وتكبير).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن تصف الإجراء لعزل خلايا البنكرياس عنيبية. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لعزل أكثر من 20 × 10 6 خلايا عنيبية لكل حيوان في أقل من 1 ساعة. بفضل التنفيذ السريع وبسيط والخمسين (ما يصل الى 10 البنكرياس يمكن معالجتها بشكل مستقل في التجربة بالتوازي)، يظهر هذا البروتوكول، بوصفها حلا توفيقيا بين أساليب العزلة القائمة 3-5،9-12،17.
الخطوات الحاسمة / حل المشاكل
تعتمد كفاءة هذا الأسلوب على الاحتياطات التي اتخذت في بعض النقاط الحرجة. الخطوة الأولى من تفتيت البنكرياس (الخطوة 1.8) أمر ضروري لاحقة البنكرياس الهضم الأنزيمية. عدم كفاية القطع المتابعة سيقلل من محصول تفارق الأنزيمية وعدد من خلايا عنيبية الحصول عليها. هذا يجعل من الضروري إطالة فترة الحضانة مع كولاجيناز IA، مما تسبب حتما التفكك المفرط للخلايا عنيبية وconsecuزيادة أيدي العاملة موت الخلية.
كما حذر أعلاه، فإن الخطوة الحاسمة الثانية هي عملية الهضم من خلال كولاجيناز IA (الخطوة 2.3). كثيرا تفارق الأنزيمية يؤدي إلى ارتفاع معدل موت الخلايا. يجب رصدها في كثير من الأحيان مدى هضم البنكرياس خلال هذه الخطوة الحرجة (الشكل 3B). بعد dissociations الميكانيكية والأنزيمية، يحتاج إلى عناية خاصة ويجب أن يدفع من أجل التعامل مع بلطف جدا عنيبات فرقت من أجل الحفاظ على هياكلها بين الخلايا.
القيود
حتى لو بإضافة عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) إلى ثقافة Waymouth قد يعجل transdifferentiation عنيبي إلى الأقنية التدريجي، فمن الضروري للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة.
كما هو موضح في البروتوكول وإذا لزم الأمر، ويمكن تمديد الفترة الثقافة في المختبر من خلايا عنيبية لتصل إلى 10 أيام من قبل البذر الخلايا على مصفوفة سكافالذين تتراوح أعمارهم بين مثل النوع الأول الكولاجين. بعد الأهم من ذلك، وكما هو موضح من قبل الآخرين 1، زراعة الخلايا على النوع الأول من الكولاجين من شأنها أن تحفز على transdifferentiation التدريجي للخلايا عنيبية إلى خلايا الأقنية. تبدأ هذه العملية بعد 4 أيام من الثقافة على الكولاجين ويمكن أن يكون كاملا بعد 7 أيام. ولذا قد يكون من الضروري للتحقق من وجود علامة الأقنية محددة مثل عبر الغشاء التليف الكيسي منظم المواصلة أو Cytokeratin-19 (بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية أو التجارب المناعي) إذا احتاج ثقافة خلية عنيبية أن يمتد إلى 1 في الاسبوع. لاستخدام البديل من Matrigel بمثابة سقالة المصفوفة، عن طريق الحد من تمسك فرقت عنيبات، يجعل من الممكن تمديد صيانة النمط الظاهري على عنيبي لمدة 2 ايام.
التعديلات الممكنة
باجتزاء المستقيم أثناء الخطوة تشريح يزيد من خطر التلوث الجرثومي. ونحن لم يشهد مثل هذا الموقعأوجه. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، وهناك إجراء آخر للتحايل على هذه المشكلة ممكن. وهو يتألف من العثور على المعدة والطحال والجزء الأول من الاثني عشر، وباجتزاء البنكرياس المرفقة. لاحظ أن هذا الإجراء البديل يحتاج إلى أن يتقن تماما. وإلا، فإن مدة تشريح الحصول على أطول، مما يهدد ثم نوعية المواد البيولوجية إزالتها.
ثقافة أحادي الطبقة على المدى الطويل من الخلايا عنيبي يمكن أن يكون الأمثل، لا سيما عن طريق تعديل مصفوفة الدعم. إذا كان ذلك مطلوبا من قبل الظروف التجريبية، النوع الأول الكولاجين يمكن استبدالها مع سقالة أخرى، مثل Matrigel. في هذه الحالة، يجب أن يكون مستعدا Matrigel الطازجة في 400 ميكروغرام / مل تركيز في البرد الفوسفات مخزنة المالحة 1X. بعد ذلك، يتم تحضين الآبار مع Matrigel (40 ميكروغرام / سم 2) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. هذه النقطة يجب أن تحترم بدقة. يبقى الإجراء الثقافة نفسها كما هو موضح في الخطوة 4.
طريقة CAن مزيد من يكون الأمثل تجريبيا. على سبيل المثال، يمكن أن كمية الأحماض الأمينية في مستنبت من خلايا البنكرياس الإفرازية تنظيم تخليق البروتين بواسطة هذه الخلايا 18. Sphyris وآخرون. 2 وBläuer وآخرون. 19 قد أعد مستنبت كاملة تحتوي على كمية أعلى من الأحماض الأمينية (أساسية وغير أساسية)، وتعزيز صيانة خلايا عنيبية في ولاية متباينة. قد تكون هذه الوسيلة مفيدة جدا إذا كان أحد يرغب خلايا عنيبية ثقافة معزولة بواسطة هذه الطريقة لأكثر من 10 أيام.
مقياس آخر التي يمكن تعديلها إذا كان مطلوبا الثقافة على المدى الطويل، هو الرقم الهيدروجيني للثقافة المتوسط. من الناحية الفسيولوجية، القطب القمي للخلايا عنيبية هو في اتصال دائم مع الغنية بيكربونات، سائلة قلوية قليلا مما أدى إلى عصير البنكرياس. ومن المغري إلى التكهن بأن الرقم الهيدروجيني للبيئة خلية عنيبية قد يكون مهما في الحفاظ على التمايز عنيبيالدولة ن. بعض البروتوكولات ذكرت سابقا استخدام مستنبت مع درجة الحموضة تعديلها إلى 7.8 لتقليد علم وظائف الأعضاء "الأولي" من خلايا عنيبية 19.
أهمية تقنية
ومن المهم أن نذكر أن هناك وجود البروتوكولات الأخرى للخلايا عنيبية زراعة، وذلك باستخدام إإكسبلنتس البنكرياس والثقافات عضوي النمط 19. تطبيقها، استنادا إلى الهجرة خلية البنكرياس من يزدرع إلى الغشاء الذي يتم تربيتها هم، هو أكثر صعوبة. عزل هذه الخلايا البنكرياس يتطلب خصوصا في الأسبوع الأول من ثقافة يزدرع البنكرياس. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه ليس هناك حاجة إلى تفارق الأنزيمية، بحيث أن كلا الخلية سلامة غشاء الخلية والتفاعلات الى خلية يتم الاحتفاظ. في ظل هذه الظروف، يمكن الحفاظ على بعض الخلايا الحويصلية في المختبر لمدة تصل إلى 14 يوما. بعد زراعة الخلايا عنيبي الحصول عليها ليست نقية، والخلايا الليفية الملوثة، الأقنية جells، والخلايا البطانية موجودة حتما، والتي يمكن أن تكون غير متوافقة مع بعض أنواع التجارب. في المقابل، لدينا الإجراء ينتج بسرعة عدد السكان نقية من خلايا عنيبية، والمحافظة على العمارة الأولية للعنيبات.
Dorrell وآخرون. وصف طريقة أخرى من أجل عزل الماوس أنواع الخلايا البنكرياسية مختلفة (بما في ذلك عنيبي، لاصق، وخلايا الغدد الصماء)، وذلك باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) 17. هذا الأسلوب هو فعالة جدا للحصول على النقي (أو محددة) السكان من الخلايا عنيبي. ومع ذلك، فإنه يتطلب وضع العلامات الفلورية مع الأجسام المضادة المحددة، والفرز قبل. وعلاوة على ذلك، يتطلب هذا الإجراء أيضا خبرة في نظام مراقبة الأصول الميدانية وتدفق عداد الكريات. الى جانب ذلك، هذه التقنية لا تسمح ثقافة ممتدة من خلايا عنيبية، ويرجع ذلك إلى فقدان العمارة الأولية للعنيبات. لدينا طريقة سريعة تسمح موسعة في الثقافة المختبر من خلايا عنيبية فرقت مع جودة ونقاء أنإعادة متوافقة مع معظم تطبيقات روتينية أخرى.
التطبيقات المستقبلية
يتقن مرة واحدة، يجب أن هذا الأسلوب لعزل خلايا عنيبية / زراعة أن تكون مفيدة جدا في معالجة مجموعة من الأسئلة وخاصة للتحقيق في الآليات التي تشارك في اللدونة البنكرياس وtransdifferentiation، وهي معروفة جيدا ولكن غير مفهومة. من خلال الحفاظ على بعض الاتصالات بين وداخل الخلايا، وهذا فرقت عنيبات نموذج لا يزال أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة من خطوط الخلايا خلده.
في مجال تكون الأورام البنكرياس، كما يوفر هذا الطراز الخلية الأولية إلى نظام ملائم لدراسة transdifferentiation خلية عنيبية، واحدة من الآليات المقترحة لتوليد سرطانات البنكرياس العدوانية. على الرغم من خطوط الخلايا البشرية أو الفئران خلدت (مثل Colo357، بانكايك ه-1، أو BxPC3) قد تكون أكثر مرونة في الاستخدام من خلايا عنيبية الأولية، سواء أصلهم وشركات بهمليكس حالة وراثية (خطوط الخلايا كما حولت معزولة في البداية من أورام البنكرياس أو حتى الانبثاث البنكرياس) تشكل العوائق الرئيسية في دراسة مثل هذه الآليات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر موظفي AniCan (CRCL، ليون) للحصول على المساعدة الفنية مع رعاية الحيوان. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسانتيه إت دي لا بحوث ميديكال (برنامج أفينير INSERM)، الرابطة الوطنية من كونتر جنيه السرطان، من قبل الرابطة من أجل الديمقراطية بحوث السرطان سور جنيه، من قبل المعهد الوطني للسرطان، وزمالة من الرابطة الوطنية من كونتر جنيه السرطان (JG)، من المعهد الوطني للسرطان (JG)، من MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT العالي للبحوث وآخرون دي لا من فرنسا (RMP وDFV) ومن جمعية من أجل الديمقراطية بحوث سور جنيه السرطان ( DFV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L.
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
