Summary
Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt erzeugen
Abstract
Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt S. generieren typhimurium wachsenden Bakterienkolonien in den Tumoren.
Wir generierte Modell Xenograft Tumoren in Mäusen durch subkutane Injektion eines menschlichen Ovarialkarzinom-Zelllinie, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).
Wir verwandelt abgeschwächte Stämme von S. typhimurium Bakterien (ELH430: SL1344 phoPQ-1) mit einem konstitutiv exprimierten Luciferase (luxCDABE) Plasmid zur Visualisierung 2. Diese Stämme besiedeln speziell Tumoren während verbleibenden wesentlichen nicht-virulenten der Maus 1.
Sobald messbare Tumore wurden hergestellt wurden Bakterien intravenös über die Schwanzvene mit unterschiedlicher Dosierung injiziert. Tumor-lokalisiert wurde bakterielle Genexpression in Echtzeit im Laufe von 60 Stunden unter Verwendung eines überwachtenin vivo Imaging System (IVIS). Zu jedem Zeitpunkt wurden Tumore herausgeschnitten, homogenisiert und ausplattiert, um Bakterienkolonien Korrelation mit Genexpressionsdaten quantifizieren.
Zusammen ergibt sich daraus Daten ein quantitatives Maß für die in vivo-Wachstum und die Genexpression Dynamik der wachsenden Bakterien in den Tumoren.
Introduction
Synthetische Biologie hat sich in den letzten zehn Jahren Fortschritte gemacht und ist nun positioniert, um wichtige Probleme in den Bereichen Energie und Gesundheit auswirken. Allerdings hat die Expansion in den klinischen Bereich von Sicherheitsbedenken und einer Abwesenheit von der Entwicklung Design-Kriterien für in vivo genetische Schaltkreise verlangsamt worden. Beschleunigung hohe Schlagzähigkeit medizinische Anwendungen erfordern Methoden verwenden, die eine direkte Schnittstelle mit medizinischen Einrichtung Genetische Schaltkreise, die außerhalb des gesteuerten Testumgebung funktionieren, zu regeln und klinisch akzeptierten mikrobiellen Wirten.
Eine Reihe von Stämmen sind zur Krebstherapie aufgrund ihrer Fähigkeit, vorzugsweise wachsen in Tumoren untersucht. Diese haben C enthalten novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, und S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ist besonderem Interesse erzeugt, wie sie Sicherheit und Verträglichkeit in einer Reihe von klinischen Studien am Menschen haben gezeigt 9-12. Diese bacteri A wurden gezeigt, Anti-Tumor-Wirkung durch Stimulation des Immunsystems des Wirts und von Nährstoffmangel für Krebs Zellstoffwechsel erforderlich erstellen. Produktion von therapeutischen Ladung wurde später durch genetische Modifikationen aufgenommen. Während diese Studien wichtige Fortschritte bei der Verwendung von Bakterien für die Tumor-Therapien dar, die Mehrheit der bestehenden Bemühungen auf hoher Ebene Ausdruck, führt in der Regel die Lieferung von hohen Dosierungen, Off-Target-Effekte, und die Entwicklung von Host-Widerstand 13-16 berufen .
Jetzt können synthetische Biologie programmierbare Ladung Produktion durch den Einsatz rechnerisch ausgelegt genetischer Schaltkreise, die erweiterte Erfassung und Lieferung 17-20 durchführen hinzufügen können. Diese Schaltungen können entworfen, um als Delivery-Systeme, die Tumor-spezifische Stimuli und selbst regulieren Fracht Produktion notwendigen Sinn zu handeln. Allerdings hat die Untersuchung der Funktion dieser Schaltungen in vivo bisher schwierig gewesen.
ve_content "> Da Plasmide der gemeinsame Rahmen für synthetische Schaltungen sind, beschreiben wir eine Methode, um die Dynamik von Plasmid-basierte Genexpression in vivo mit einem Maus-Modell zu charakterisieren. Diese Methoden nutzen Zeitraffer Lumineszenz Bildgebung und quantitative Messung der Biodistribution. Gemeinsam Diese Ansätze bieten einen Rahmen für die Untersuchung Plasmid-basierte Netze in vivo für klinische Anwendungen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zellpräparation
- Passage Zelllinien unter Verwendung von Standard-Zellkultur-Techniken. In diesem Experiment verwendeten wir OVCAR-8-Zellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Wachsen Zellen zu einem Ziel Konfluenz von 80 - 100%.
- Inkubieren Zellen mit 5 ml Trypsin für 5 min, dann 5 ml RPMI-Medium + FBS Trypsin zu inaktivieren.
- Ernte und Anzahl Zellen auf einer Zählkammer. Resuspendieren in Phenolrot-freiem DMEM auf ein Ziel Konzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml oder etwa 200 ul pro Kolben.
- In 15% reduzierten Wachstumsfaktor Matrigel (BD Biosciences) und halten Sie die Zellsuspension auf Eis bis zur Implantation.
2. Tumorimplantation
- Anesthetize 4 Wochen alten weiblichen Ncr / Nu-Mäusen unter Verwendung von 3% Isofluran und warten etwa 5 min zu tiefe Narkose zu gewährleisten. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Legen Sie die Zellen (100 ul pro Tumor) in einer 1 ml Spritze eine 27 1/ 2-Gauge-Nadel.
- Für jede der beiden bilateralen hinteren Flanke Injektionsstellen, heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette, um ein Zelt zu machen und injizieren Zellen an der Basis. Achten Sie darauf, nicht zu durchdringen zu tief, wodurch Blut. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Spritze ohne Spritzer.
- Überwachen Tumorwachstum täglich für 10 - 20 Tage, bis ein Tumor Durchmesser von 2 - 4 mm erreicht ist.
3. Bakterien Vorbereitung
- Starten Sie eine Übernacht-Kultur von Bakterien in 3 ml LB-Medium + Ampicillin aus einer -80 C Gefrierschrank Lager oder gekühlten Teller. Bei diesem Experiment haben wir S. typhimurium Stamm ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
- In der Früh, verdünnen die Kultur 1:100 in LB gefiltert und wachsen, um OD600 0.4 - 0.6.
- Abzentrifugieren und wäscht 3 mal in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und in einer endgültigen OD 600 von 0,1 (etwa 1 x 10 7 Zellen / ml).
4. Bakterien Injection
- Anesthetize das Tier eind Position auf seiner Seite mit der Schwanz zeigte auf Ihrer dominanten Hand. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Dilate die Schwanzvene mit warmem Wasser oder eine Wärmelampe.
- Legen Sie die Bakterien (100 ul pro Maus) in einer 1 ml Spritze und biegen Sie die Spitze etwas weniger als 90 Grad.
- Richten Sie die Spitze der Spritze mit der Schwanzvene, in geringer Tiefe (sollte kein Widerstand zu spüren ist) eindringen, und injizieren Bakterien. Beachten bloodflow Verschiebung für eine erfolgreiche Injektion.
5. Mouse Imaging
- Anesthetize Tiere in der Induktion Kammer dann platzieren Sie jede Maus auf dem Imaging-Plattform. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Pflegen präzise Positionierung auf quantitative Ergebnisse zwischen den Zeitpunkten zu gewährleisten.
- Bild Tiere mit dem IVIS Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences). Wenn Bildgebung mehr als 1 Tier, Ort Lichtschranken zwischen ihnen zu verhindern Cross-illumung. Tiere zunächst auf der Bauchseite abzubildenden Lokalisierung von Bakterien zu bestätigen.
- Bild Tieren dorsal mit IVIS alle 2 Stunden für die Dauer des Experiments (36 Stunden). Generieren Sie einen zeitlichen Verlauf für einen bestimmten ROI.
6. Quantifizierung Bakterielle Biodistribution
- Euthanize Tiere mit CO 2 und Platz auf der Rückseite auf einem saugfähigen Windel.
- Schalten Sie das Tier, die beiden hinteren Flanke subkutanen Tumoren freizulegen. Schneiden Sie das umliegende Hautgewebe zu trennen und entfernen Sie die Tumoren. Halten Sie den Tumor mit einer Pinzette aus der Haut mit einer Schere umgekehrte Bewegung. Wenn die Mehrheit der Haut abgetrennt wurde, vollständig zu entfernen den Tumor mit einer Pinzette.
- Legen Sie die Organe in vorgewogenen Mikrozentrifugenröhrchen. Da die Masse dieser Rohre erheblich variieren können, ist es wichtig, vor der gewogen für quantitative Ergebnisse.
7. Quantifizierung Bakterielle Biodistribution
- Für jeden Zeitpunkt, Verbrauchsteuern und wiegen die Tumoren.
- In 500 ul PBS + 15% Glycerin und homogenisieren mit einem Tissue-Tearor (BioSpec). Spülen Sie die Homogenisator 3 mal mit Ethanol zwischen den Proben.
- Generieren serielle Verdünnungen und Platte für bakterielle Koloniezahlbestimmung. Um Platte mehrere Verdünnungen auf einer einzigen Platte Verwendung pre-geschnittene Platten.
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Representative Results
Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, Daten über die in vivo-Wachstum und Genexpression Dynamik der Tumor gezielt Bakterien erzeugen. Der gesamte Workflow wird in Abbildung 1 zusammengefasst.
In der ersten Stufe injizieren wir Bakterien (grün) und Bild des Tieres mit IVIS die Genexpression mit Lumineszenz-(Blau) als Reporter zu messen.
Dann, in der zweiten Stufe, wir Verbrauchssteuern, zu homogenisieren und die Platte für Tumoren Koloniezahlen um die Anzahl der Bakterien wachsen in den Tumor zu bestimmen.
Biolumineszenz von Bakterienstämmen erzeugt wird visualisiert mit IVIS (Abbildung 2). Signal steigt mit injizierten Dosis, mit einem Minimum kolonisierenden Dosierung etwa 5 x 10 5 (Abbildung 2A). In allen Fällen sind die abgeschwächten Bakterien nur in der Lage, entweder spezifisch besiedeln Tumoren oder nicht in den Mäusen zu wachsen. Signal wird unter Verwendung Ausstrahlung Einheiten Normalisierungze für Belichtungszeit, wo typische Werte von 10 ^ 6 oder größer sind indikativ für Besiedelung.
Für eine gegebene Infektion Signal mit der Zeit ansteigt über 24-48 h (Abb. 2B). Der Peak Beginn ist etwa 36 Stunden nach der Injektion, aber der Zeitpunkt je nach der Belastung und Plasmid verwendet. Achten Sie darauf, Positionieren Sie den Mauszeiger genau die gleiche Weise jedes Mal um quantitative Ergebnisse zu gewährleisten.
In der nächsten Reihe von Experimenten wird bakteriellen biodistrution quantifiziert, um das Wachstum von Bakterien über die Zeit (Abbildung 3) zu messen. Lebensfähigen Bakterien in Tumoren durch Ausschneiden und Homogenisieren des Tumors und Plattieren auf serielle Verdünnungen (3A) quantifiziert. Andere Organe können ebenfalls in ähnlicher Weise quantifiziert werden. Hier haben wir die Milz verwendet, da der Tumor-Milz-Verhältnis ist ein typisches Maß für bakterielle Spezifität 21, 22.
Diese zählt es uns ermöglichen, die bakterielle Bevölkerung messention über die Zeit (3B). Auf der linken Seite können wir sehen, dass die Zahl der Bakterien wachsen stetig in den Tumor während der gesamten Dauer des Experiments mit einer Verdoppelung Zeit von 1-3 Stunden, wesentlich langsamer als im Batch-Kultur-Experimente. Dieser ermäßigte Steuersatz wird voraussichtlich aufgrund der schlechten Bedingungen in der Nährstoff Tumorumgebung. Auf der rechten Seite haben wir die Tumor-Milz-Verhältnis quantifiziert und zu beobachten, dass es während des gesamten Experiments erhöht. Dieser Befund zeigt, Spezifität, dass die Milz zählt im Wesentlichen konstant sind, während Bakterien im Tumor wachsen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der gesamten experimentellen Verfahrens. (A) Bakterien werden in der Schwanzvene injiziert und speziell besiedeln Tumoren. (B) Zu jedem Zeitpunkt, Tumoren herausgeschnitten,homogenisiert und ausplattiert für Kolonie zählt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Abbildung 2. Whole-Tier-Lumineszenz Imaging mit IVIS. (A)-Signal steigt mit Injektionsdosis und (b) Zeit. Adaptiert mit Erlaubnis 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Abbildung 3. Plating and Koloniezahlen Wachstumsdynamik zu messen. (A) Serielle Verdünnungen ermöglichen einzelnen Kolonien, um ein repräsentatives Milzprobe (unten) gezählt werden. (B) Durch die folgenden zählt, können wir in vivo Bevölkerung Maßnahmen von Bakterien in den Tumoren zu erstellen ( wie in b </ B>) Anzahl der Zellen mit und ohne dem Plasmid (wie in c) und der Tumor Milz-Verhältnis (wie in d). Adaptiert mit Erlaubnis 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
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Discussion
Mit diesem Verfahren sind wir in der Lage, Zeit-Verläufe für das Wachstum und die Genexpression Dynamik von Bakterien besiedeln Tumoren zu erzeugen. Während diese Messungen routinemäßig in vitro in Batch-Kultur oder Mikrofluidik-Geräte ausgeführt, sind sie viel schwieriger in vivo durchzuführen.
Es gibt verschiedene Modifikationen zu diesen Methoden angewendet werden können. Während wir die OVCAR-8-Zelllinie verwendet, um unsere Mausmodellen zu erzeugen, kann eine Anzahl von anderen Zelllinien äquivalent verwendet werden. Zum Beispiel kann luciferized Zelllinien verwendet werden, die für 3D-Co-Lokalisation von Tumoren und bakteriellen Luciferase-Kanäle zu ermöglichen. Zusätzlich kann, während wir eine bilaterale hinteren Flanke Modell eine unterschiedliche Anzahl und Positionen der Injektionsstelle verwendet, um Modelle zu erzeugen, um verschiedene Phänomene zu untersuchen. Zum Beispiel ist, wenn die Tumorgröße eine wichtige Variable, kann Reihenverdünnungen von Zellen hergestellt und injiziert werden auf verschiedene Seiten gleichzeitig Erzeugen Smaller-und größer dimensionierte Tumoren. Schließlich, während wir früher S. typhimurium Stamm ELH430, andere Stämme von S. typhimurium oder andere Bakterien wie C. novyi, E. coli, V. cholorae kann B. longum äquivalent mit diesen Methoden verwendet werden, obwohl die Keimzahlen zur Injektion muss unter Umständen angepasst werden.
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll beinhalten die Schaffung der Maus Krebs-Modell, und die Vorbereitung und Injektion von Bakterien. Für die Erstellung der Krebs-Modell, wird Präzision in der Zellzahl und Konzentration, Einspritzmenge, der Einstichstelle und Platzierung erheblich verbessern die Konsistenz der Tumoren erzeugt. Wir haben festgestellt, dass äquivalent bemessen, geformt und platziert die meisten Tumoren quantitativ vergleichbare Daten zu erstellen. Für die Herstellung von Bakterien, ist es wichtig, vollständig waschen vor der Injektion und für die Bakterien Konzentration, Volumen und Injektionsstelle sorgfältig zu steuern. Diese Schritte sind erforderlich, um avoID übermäßige immunologischen Auswirkungen der Einspritzung, zu halten und quantitativen Vergleich zwischen verschiedenen Mausmodellen. Da die Anzahl der Bakterien, die den Tumor geben einen kleinen Bruchteil der injizierten Dosis können Variationen in der Anzahl der Bakterien zwischen Mäusen injiziert in dramatische Unterschiede auf Kolonie Verlauf führen. Weitere Informationen finden Sie mehrere weitere Verweise auf die bakterielle Vorbereitung für quantitative in vivo-Studien 3, 4,
Während diese Techniken sehr anpassungsfähig an eine Vielzahl spezifischer Studien gibt es einige Beschränkungen für die sich auf bestimmte Anwendungen. Zum Beispiel kann intravenöse Verabreichung von hohen Keimzahlen nicht wünschenswert für bestimmte Bakterien und / oder Mausmodellen durch immunologische Wirkung. Ein alternativer Weg der Verabreichung ist die orale Verabreichung (Magensonde), eine Technik, die auf JoVE 23 beschrieben. Zusätzlich können Zeitraffer-Bildgebung durchaus arbeitsintensive abhängig von der Spezi seinfic Experiment Länge, Zeit-Auflösung und Ausstattung zur Verfügung. Automatisieren der Imaging-Prozess würde lindern viele dieser Belastungen, aber auch neue technische Herausforderungen. Maus Vitalwerte wie Herzfrequenz, Atemfrequenz und Temperatur müssen kontinuierlich durch zusätzliche Geräte überwacht werden. Zusätzlich für längerfristige Anästhesie, muss Augensalben verwendet werden, um ausreichend Feuchtigkeit zu halten. Schließlich muss das Niveau der Narkose ausgeliefert zu der Maus stufenlos eingestellt werden, um die richtige Tiefe der Narkose zu halten. Ein Closed-Loop-Feedback-Steuerung, die Maus lebenswichtigen Messungen integriert Narkose Lieferung erheblich erleichtern würde diesen Prozess.
Während der synthetischen Biologie viel Erfolg 17, 19, 20, erreicht hat die Anwendung gentechnisch Gen Schaltungen in vivo Anwendungen erfordern quantitative in vivo Zeit Kurse zur Design-Prinzipien zu informieren. S. typhimurium ist eine ausgezeichnete Sorte für klinische synthetischen Biologielogie für die Krebstherapie, da es ähnlich wie E. ist coli, speziell kolonisiert Tumoren und hat sich gezeigt, sicher in klinischen Studien am Menschen 6, 12, 14, 22. Darüber hinaus haben die jüngsten Studien festgestellt, dass viele veröffentlichte Schaltungen in S. funktionieren typhimurium ohne Modifikation 24. Mit der experimentellen Plattform hier beschriebenen, haben wir kürzlich beschrieben, wie dynamisch in vivo Expression Profile programmiert unter Verwendung des inhärenten Instabilität von Plasmid-Vektoren 25 werden. Darüber hinaus hat die jüngste Forschung neue Methoden stabil zu halten Plasmid-Vektoren in vivo 23 entwickelt.
Während Luciferase ist ein gemeinsames Reporter für die in vivo-Bildgebung für die Empfindlichkeit 5 verwendet, gibt es Beispiele für gute quantitative Untersuchungen in vivo Genexpression unter Verwendung GFP 26. Mit GFP würde es dem Forscher, die räumlich-zeitliche Dynamik der einzelnen Bakterien in vivo zu untersuchen.Darüber hinaus, während wir früher eine subkutane Modell, die sich diese Studien auf weitere relevante Modelle von Krebs weiter erhöhen würde ihre Vorhersagekraft 7. Zukünftige Studien wie diese ermöglichen kann eine nächste Generation von in vivo synthetischen Biologie für klinische Anwendungen.
Die Entwicklung sowohl experimentelle und rechnergestützte Techniken in Konzert wird entscheidend sein, um Engineering in vivo genetische Schaltkreise. Computational Modeling schnell sondieren Systemparameter mögliche Ausgänge zu erkunden, sondern muss weiterhin eng mit experimentellen Ergebnissen gebunden relevant zu bleiben. Bisher wurden diese Ergebnisse schwer quantitativ zu erhalten, die zum Teil auf einen Mangel an Methoden zur Untersuchung genetischer Schaltkreise in vivo.
Aufbauend auf dieser Plattform werden zukünftige Anwendungen sind Gen entwickelt Schaltungen, die weiter erweitern die Palette der Ausdruck Dynamik, Sensorik Tumor-spezifische Stimuli und sich selbst regulierenden Fracht ProduktIon als nötig. Da die Komplexität der in vivo diese Schaltungen zunimmt, benötigt die Anforderungen an quantitative Daten stimmen sie wird ebenfalls zunehmen. Wir glauben, dass die Methoden hier beschrieben, zusammen mit neuen Innovationen in langfristige Maus Bildgebung, wird dieser Vorgang möglich.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken H. Fleming für die kritische Durchsicht und Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Postdoc-Stipendium Misrock (TD) und NDSEG Graduiertenstipendium (AP) unterstützt. SNB ist ein HHMI Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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