Målet med dessa försök är att generera kvantitativa tidsförlopp uppgifter om tillväxt och Gene dynamik uttryck av försvagad<em> S. typhimurium</em> Bakteriekolonier växer inuti tumörer. Denna video behandlar tumörcellen förberedelse och implantation, bakterier förberedelse och injicering, hel-djur luminiscens bildbehandling, tumör excision, och bakteriell koloniräkning.
Målet med dessa försök är att generera kvantitativa tidsförlopp uppgifter om tillväxt och Gene dynamik uttryck av försvagad S. typhimurium kolonier växer inuti tumörer.
Vi genererade tumörer modell xenograft hos möss genom subkutan injektion av en human äggstockscancer cellinje, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumör Repository, Frederick, MD).
Vi förvandlas försvagade stammar av S. typhimurium bakterier (ELH430: SL1344 phoPQ-1) med en konstitutivt uttryckt luciferas (luxCDABE) plasmid för visualisering 2. Dessa stammar kolonisera specifikt tumörer medan resterande väsentligen icke-virulent för musen 1.
När mätbara tumörer etablerades, var bakterier injicerades intravenöst via svansvenen med varierande dosering. Tumör-lokaliserad, var bakteriell genexpression övervakas i realtid under loppet av 60 timmar med användning av enin vivo imaging system (IVIS). Vid varje tidpunkt, var tumörerna skars ut, homogeniserades och ströks för att kvantifiera bakteriella kolonier för korrelation med data genuttryck.
Tillsammans ger dessa data ett kvantitativt mått på in vivo tillväxt och Gene dynamik uttryck av bakterier växer inuti tumörer.
Syntetisk biologi har utvecklats snabbt under det senaste decenniet och är nu positionerade för att påverka viktiga problem inom energi och hälsa. Dock har expansion i kliniska arenan har saktat av oro för säkerheten och en frånvaro av att utveckla specifika kriterier för in vivo genetiska kretsar. Accelerera stor genomslagskraft medicinska tillämpningar kommer att kräva användning av förfaranden som har gränssnitt direkt med medicinsk infrastruktur, genetiska kretsar som fungerar utanför den kontrollerade labb miljö, samt säkra och kliniskt accepterade värdar mikrobiella.
Ett antal stammar har undersökts för cancerterapi på grund av deras förmåga att växa preferentiellt i tumörer. Dessa har inkluderat C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, och S. typhimurium 3-8. S. typhimurium har genererat särskilt intresse eftersom de har ställt säkerhet och tolerans i ett antal kliniska prövningar 9-12. Dessa bacteri en ursprungligen visats skapa antitumöreffekter genom stimulering av värdens immunsystem och genom utarmning av näringsämnen som krävs för cancer cellernas ämnesomsättning. Produktionen av terapeutisk last senare tillkommit genom genetiska modifieringar. Även om dessa studier utgör viktiga framsteg i användningen av bakterier för tumörläkemedel, har majoriteten av befintliga insatser förlitat sig på hög nivå uttryck som oftast resulterar i leverans av höga doser, off-target effekter och utveckling av värdresistens 13-16 .
Nu kan syntetisk biologi lägga programmerbar last produktionen genom att utnyttja beräkningsmässigt utformade genetiska kretsar som kan utföra avancerade sensorer och leverans 17-20. Dessa kretsar kan utformas för att fungera som leveranssystem som känner tumör-specifika stimuli och självreglering last produktion som behövs. Emellertid har studera funktionen av dessa kretsar i vivo hittills varit utmanande.
ve_content "> Eftersom plasmider är den gemensamma ramen för syntetiska kretsar, beskriver vi en metod för att karaktärisera dynamiken i plasmid-baserad genuttryck in vivo med hjälp av en musmodell. Dessa metoder utnyttjar time-lapse luminiscens bildbehandling och kvantitativ mätning av biofördelningen. Tillsammans Dessa metoder ger en ram för att studera plasmid-baserade nätverk in vivo för kliniska tillämpningar.Med hjälp av denna procedur, kan vi generera tidsförlopp för tillväxt och Gene dynamik uttryck av bakterier koloniserar tumörer. Medan dessa mätningar rutinmässigt in vitro i satsvis odling eller mikrofluidik-enheter, de är mycket svårare att utföra in vivo.
Det finns flera modifikationer som kan tillämpas på dessa metoder. Medan vi använde OVCAR-8 cellinje för att skapa våra musmodeller, kan ett antal andra cellinjer användas ekvivalent. Exempelvis kan luci…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar H. Fleming för kritisk läsning och redigering av manuskriptet. Detta arbete stöddes av en Misrock Postdoktorsstipendium (TD) och NDSEG examen gemenskap (AP). SNB är en HHMI utredare.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |