Mäta tillväxt och Gene Dynamics Expression av tumör-Targeted Published: July 6, 2013 doi: 10.3791/50540

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Tal Danino*¹, Arthur Prindle*², Jeff Hasty^2,3,4, Sangeeta Bhatia^1,5,6,7,8

¹Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, ²Department of Bioengineering, University of California, San Diego, ³Biocircuits Institute, University of California, San Diego, ⁴Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego, ⁵Broad Institute of Harvard and MIT, ⁶Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, ⁷Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, ⁸Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

Summary

Målet med dessa försök är att generera kvantitativa tidsförlopp uppgifter om tillväxt och Gene dynamik uttryck av försvagad

Abstract

Målet med dessa försök är att generera kvantitativa tidsförlopp uppgifter om tillväxt och Gene dynamik uttryck av försvagad S. typhimurium kolonier växer inuti tumörer.

Vi genererade tumörer modell xenograft hos möss genom subkutan injektion av en human äggstockscancer cellinje, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumör Repository, Frederick, MD).

Vi förvandlas försvagade stammar av S. typhimurium bakterier (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) med en konstitutivt uttryckt luciferas (luxCDABE) plasmid för visualisering ^2. Dessa stammar kolonisera specifikt tumörer medan resterande väsentligen icke-virulent för musen ^1.

När mätbara tumörer etablerades, var bakterier injicerades intravenöst via svansvenen med varierande dosering. Tumör-lokaliserad, var bakteriell genexpression övervakas i realtid under loppet av 60 timmar med användning av enin vivo imaging system (IVIS). Vid varje tidpunkt, var tumörerna skars ut, homogeniserades och ströks för att kvantifiera bakteriella kolonier för korrelation med data genuttryck.

Tillsammans ger dessa data ett kvantitativt mått på in vivo tillväxt och Gene dynamik uttryck av bakterier växer inuti tumörer.

Introduction

Syntetisk biologi har utvecklats snabbt under det senaste decenniet och är nu positionerade för att påverka viktiga problem inom energi och hälsa. Dock har expansion i kliniska arenan har saktat av oro för säkerheten och en frånvaro av att utveckla specifika kriterier för in vivo genetiska kretsar. Accelerera stor genomslagskraft medicinska tillämpningar kommer att kräva användning av förfaranden som har gränssnitt direkt med medicinsk infrastruktur, genetiska kretsar som fungerar utanför den kontrollerade labb miljö, samt säkra och kliniskt accepterade värdar mikrobiella.

Ett antal stammar har undersökts för cancerterapi på grund av deras förmåga att växa preferentiellt i tumörer. Dessa har inkluderat C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, och S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium har genererat särskilt intresse eftersom de har ställt säkerhet och tolerans i ett antal kliniska prövningar ^9-12. Dessa bacteri en ursprungligen visats skapa antitumöreffekter genom stimulering av värdens immunsystem och genom utarmning av näringsämnen som krävs för cancer cellernas ämnesomsättning. Produktionen av terapeutisk last senare tillkommit genom genetiska modifieringar. Även om dessa studier utgör viktiga framsteg i användningen av bakterier för tumörläkemedel, har majoriteten av befintliga insatser förlitat sig på hög nivå uttryck som oftast resulterar i leverans av höga doser, off-target effekter och utveckling av värdresistens ^13-16 .

Nu kan syntetisk biologi lägga programmerbar last produktionen genom att utnyttja beräkningsmässigt utformade genetiska kretsar som kan utföra avancerade sensorer och leverans ^17-20. Dessa kretsar kan utformas för att fungera som leveranssystem som känner tumör-specifika stimuli och självreglering last produktion som behövs. Emellertid har studera funktionen av dessa kretsar i vivo hittills varit utmanande.

ve_content "> Eftersom plasmider är den gemensamma ramen för syntetiska kretsar, beskriver vi en metod för att karaktärisera dynamiken i plasmid-baserad genuttryck in vivo med hjälp av en musmodell. Dessa metoder utnyttjar time-lapse luminiscens bildbehandling och kvantitativ mätning av biofördelningen. Tillsammans Dessa metoder ger en ram för att studera plasmid-baserade nätverk in vivo för kliniska tillämpningar.

Protocol

Ett. Cellberedning

1. Passage cellinjer med användning av standardtekniker för cellodling. I detta experiment använde vi OVCAR-8 celler (NCI DCTD Tumör Repository, Frederick, MD). Odla celler till ett mål konfluens av 80 - 100%.
2. Inkubera cellerna med 5 ml trypsin under 5 minuter, tillsätt sedan 5 ml RPMI medium + FBS att inaktivera trypsin.
3. Harvest och räkna cellerna på en hemocytometer. Resuspendera i fenolrött-fritt DMEM vid en målkoncentration av 5 x 10 ⁷ celler / ml, eller omkring 200 | il per kolv.
4. Lägg 15% reducerad Matrigel tillväxtfaktor (BD Biosciences) och hålla cellsuspensionen på is tills implantation.

2. Tumörimplantation

1. Söva 4 veckor gamla kvinnliga Ncr / Nu-möss med användning 3% isofluran och vänta ungefär 5 min för att säkerställa djup anestesi. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
2. Fyll cellerna (100 l per tumör) i en 1 ml spruta och bifoga en 27 1/ 2 gauge nål.
3. För var och en av två bilaterala bakre platserna flanken injektion, lyfta huden försiktigt med pincett för att göra ett tält och injicera celler vid basen. Se till att inte tränga för djupt, producerar blod. Använd pincett för att försiktigt ta bort sprutan utan sprut.
4. Övervaka tumörtillväxt dagligen i 10 - 20 dagar tills en tumör diameter av 2 - 4 mm uppnås.

Tre. Bakterier Framställning

1. Starta en övernattning kultur av bakterier i 3 ml LB medium + Ampicillin från en -80 C frys lager eller kyld tallrik. I detta experiment använde vi S. typhimurium-stam ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
2. På morgonen, späd kultur 1:100 i filtrerad LB och växa till OD600 0.4 - 0.6.
3. Centrifugera ner och tvätta 3 gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och resuspendera vid en slutlig OD600 på 0,1 (cirka 1 x 10 ⁷ celler / ml).

4. Bakterier Injektion

1. Söva djuret av end ställning på sidan med svansen pekar mot din dominanta hand. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
2. Dilate svansvenen med varmt vatten eller en värmelampa.
3. Fyll på bakterier (100 | il per mus) i en 1 ml spruta och böj toppen bara mindre än 90 grader.
4. Rikta in sprutans spets med svansvenen, tränger på ett grunt djup (ska känna något motstånd), och injicera bakterier. Beakta blodflödet förskjutning för en lyckad injektion.

Fem. Mus Imaging

1. Söva djur i induktion kammaren sedan placera varje mus på avbildning plattformen. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi. Behåll exakt positionering för att säkerställa kvantitativa resultat mellan tidpunkter.
2. Bild djur använder IVIS Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences). Om avbildning fler än 1 djur, placera ljus hinder mellan dem för att förhindra cross-illuminering. Djur bör avbildas först på den ventrala sidan för att bekräfta lokalisering av bakterier.
3. Image djur använder dorsalt IVIS varje 2 h under hela experimentet (36 timmar). Skapa ett tidsförlopp för en viss avkastning.

6. Quantifying Bakteriell Biodistribution

1. Euthanize djur med hjälp av CO ₂ och plats på ryggen på ett absorberande blöja.
2. Vrid djuret att exponera de två bakre flanken subkutana tumörer. Skär den omgivande hud vävnad att separera och ta bort tumörer. Håll tumören med pincett, ta bort huden med hjälp av en omvänd sax rörelse. När majoriteten av huden har separerats, helt ta bort tumören med hjälp av pincett.
3. Placera de organ i förväg vägda mikrocentrifugrör. Eftersom massan av dessa rör kan variera kraftigt är det viktigt att i förväg väga dem för kvantitativa resultat.

7. Quantifying Bakteriell Biodistribution

1. För varje tidpunkt, punktskatter och väga tumörer.
2. Tillsätt 500 l PBS + 15% glycerol och homogenisera med en Tissue-Tearor (Biospec). Skölj homogenisatorn tre gånger med etanol mellan proven.
3. Generera spädningar och plåt för bakteriell koloniräkning. Till plattan flera spädningar på en enda pre-delad tallrik använda plattor.

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll, kan vi ta fram data om in vivo-tillväxt och Gene dynamik uttryck av Tumor Targeted bakterier. Den övergripande arbetsflödet sammanfattas i Figur 1.

I det första steget, injicera vi bakterier (grön) och image djuret med IVIS att mäta genuttryck med luminiscens (blått) som en reporter.

Sedan, i det andra steget, vi punktskatter, homogenisera och platta tumörer för kolonier att bestämma antalet bakterier som växer i tumören.

Bioluminescens genereras av bakteriestammar är visualiseras med IVIS (Figur 2). Signal ökar med injicerad dos, med en minsta koloniserande dos omkring 5 x 10 ⁵ (Figur 2A). I alla fall, försvagade bakterier kan bara antingen specifikt kolonisera tumörer eller inte växer i möss. Signal kvantifieras med radiance enheter till normaliseringze för exponeringstid, där typiska värden på 10 ^ 6 eller högre är ett tecken på kolonisering.

För en given infektion, signal ökar med tiden över 24-48 h (Figur 2B). Toppvärdet debut är cirka 36 timmar efter injektion, men tidpunkten kan variera beroende på stammen och plasmiden som används. Var noga med att placera musen på exakt samma sätt varje gång för att säkerställa kvantitativa resultat.

I nästa uppsättning experiment, är bakteriell biodistrution kvantifieras för att mäta tillväxten av bakterier över tiden (figur 3). Livskraftiga bakterier i tumörer kvantifieras genom utskärning och homogenisering tumören och bordläggningen vid serieutspädningar (Figur 3A). Andra organ kan också kvantifieras liknande. Här har vi använt mjälten, eftersom tumören-mjälte-förhållandet är ett typiskt mått på bakteriell specificitet ^{21, 22.}

Dessa räkningar tillåter oss att mäta bakteriell befolkningention över tid (figur 3B). Till vänster kan vi se att antalet bakterier växer stadigt i tumören under hela experimentet, med en fördubbling tid 1-3 tim, betydligt långsammare än i satskultur experiment. Detta reducerade skattesatsen är sannolikt på grund av de dåliga näringsbetingelser i tumören miljön. Till höger har vi kvantifierat tumören-mjälten förhållande och observera att den ökar hela experimentet. Denna upptäckt visar specificitet, i att mjälten räknas är väsentligen konstant medan bakterier fortsätter att växa i tumören.

Figur 1. Schematisk bild av den totala experimentella processen. (A) Bakterier injiceras i svansen-venen och specifikt kolonisera tumörer. (B) Vid varje tidpunkt, är tumörer excideras,homogeniseras, och ströks för kolonier. Omtryckt med tillstånd ^25. Copyright 2012 American Chemical Society.

Figur 2. Hel-djur luminiscens avbildning med IVIS. (A) Signal ökar med injektion dosering och (b) tid. Anpassad med tillstånd ^25. Copyright 2012 American Chemical Society.

Figur 3. Plätering och koloniräkningar att mäta tillväxt dynamik. (A) Serieutspädningar låta enskilda kolonier som skall räknas som ett representativt mjälte prov (botten). (B) Genom att följa dessa punkter, kan vi skapa in vivo befolkning åtgärder av bakterier inuti tumörer ( som i b </ Strong>) Antalet celler med och utan plasmiden (som i C) och tumören till mjälten ratio (som i d). Anpassad med tillstånd ^25. Copyright 2012 American Chemical Society.

Discussion

Med hjälp av denna procedur, kan vi generera tidsförlopp för tillväxt och Gene dynamik uttryck av bakterier koloniserar tumörer. Medan dessa mätningar rutinmässigt in vitro i satsvis odling eller mikrofluidik-enheter, de är mycket svårare att utföra in vivo.

Det finns flera modifikationer som kan tillämpas på dessa metoder. Medan vi använde OVCAR-8 cellinje för att skapa våra musmodeller, kan ett antal andra cellinjer användas ekvivalent. Exempelvis kan luciferized cellinjer användas som medger 3D colocalization av tumör och bakteriellt luciferas kanaler. Dessutom kan medan vi använde en bilateral hind flank modell, olika antal och platser av injektionsställen användas för att generera modeller för att studera olika fenomen. Till exempel är om tumörstorlek en viktig variabel, kan serieutspädningar av celler framställas och injiceras till olika platser samtidigt, generera smaller-och större storlek tumörer. Slutligen, medan vi använde S. typhimurium-stammen ELH430, andra stammar av S. typhimurium eller andra bakterier såsom C. novyi, E. coli, V. cholorae får B. longum användas ekvivalent med dessa metoder, men antalet bakterier för injektion kan behöva justeras.

De mest kritiska steg i detta protokoll innebär skapandet av musen cancer modell och förberedelse och injicering av bakterier. För skapandet av cancer modellen, kommer precisionen i antalet celler och koncentration, injektion volym, och injektionsstället placering öka kraftigt konsekvens av de genererade tumörer. Vi har funnit att ekvivalent storlek, format, och placerade tumörer skapar de mest kvantitativt jämförbara data. För beredning av bakterier, är det viktigt att helt tvätta dem före injektion och styra för bakterier koncentration, volym, och injektionsstället noggrant. Dessa åtgärder krävs för att Avoid överdriven immunologisk effekt av injektionen, och att upprätthålla kvantitativa jämförelser mellan olika musmodeller. Eftersom antalet bakterier som kommer in i tumören är en liten bråkdel av den injicerade dosen, kan variationer i antalet injicerade bakterier mellan möss resulterar i dramatiska skillnader på koloni progression. För ytterligare information, se flera ytterligare referenser på bakteriell förberedelse för kvantitativ in vivo studier ^{3, 4,}

Även om dessa tekniker är mycket anpassningsbara till en mängd specifika studier, vissa begränsningar finnas för att förlänga till vissa tillämpningar. Till exempel kan intravenös tillförsel av höga bakterietal inte vara önskvärt för vissa bakterier och / eller modeller mus på grund av immunologisk effekt. Ett alternativ administreringsväg är oral tillförsel (sondmatning), en teknik som beskrivs på JUPITER ^23. Dessutom kan tidsförlopp imaging vara ganska arbetskrävande beroende på specific experiment längd, tid-upplösning, och utrustning finns tillgänglig. Automatiserad imaging process skulle lindra många av dessa bördor, men också inför nya tekniska utmaningar. Mus vitals såsom hjärtfrekvens, andningsfrekvens och temperatur måste övervakas kontinuerligt av extra utrustning. Dessutom, för långsiktig anestesi måste ögonsalvor användas för att upprätthålla tillräcklig fuktighet. Slutligen måste nivån av bedövningsmedel levereras till mus kontinuerligt justeras för att bibehålla rätt anestesidjup. En sluten slinga återkoppling styrsystem som integrerar mus vitala mätningar med bedövningsmedel leverans skulle underlätta denna process.

Även syntetisk biologi har uppnått stor framgång ^{17, 19, 20,} tillämpa manipulerade genen kretsar för in vivo-applikationer kommer att kräva kvantitativ, in vivo tidsförlopp att informera designprinciper. S. typhimurium är en utmärkt stam för klinisk syntetisk Biolnik för cancerterapi eftersom den liknar E. coli, särskilt koloniserar tumörer, och har visat sig säkert i kliniska försök ^{6, 12, 14, 22.} Dessutom har nya studier funnit att många publicerade kretsar fungerar i S. typhimurium utan modifikation ^24. Använda experimentella plattformen beskrivs här, beskrev vi nyligen hur dynamisk in vivo uttryck profiler kan programmeras med hjälp av inneboende instabilitet plasmidvektorer ^25. Dessutom har senare forskning utvecklat nya metoder för stabilt upprätthåller plasmidvektorer in vivo ^23.

Medan luciferas är en vanlig reporter användas för in vivo imaging för dess känslighet ^5, det finns exempel på utmärkta studier på kvantitativ in vivo genuttryck med GFP ^26. Använda GFP skulle tillåta forskare att studera rumsliga-temporala dynamiken i enskilda bakterier in vivo.Dessutom, medan vi använde en subkutan modell, utvidga dessa studier mot mer relevanta modeller av cancer ytterligare skulle öka deras prognosförmåga ^7. Framtida studier som denna kan göra det möjligt för en nästa generation av in vivo syntetisk biologi för kliniska tillämpningar.

Utveckla både experimentella och computational tekniker i konserten kommer att vara avgörande för att iscensätta in vivo genetiska kretsar. Datormodellering kan snabbt söka systemparametrar för att utforska möjliga utgångar, men måste förbli nära knuten till experimentella resultat för att förbli relevant. Hittills har dessa resultat varit svårt att få kvantitativt, delvis på grund av en brist på metoder för att studera genetiska kretsar in vivo.

Med utgångspunkt i denna plattform, kommer framtida tillämpningar är manipulerade genen kretsar som ytterligare breddar utbudet av uttrycket dynamik, avkänning tumör-specifika stimuli och självreglerande last produktjon som behövs. Som förfining av dessa in vivo-kretsar ökar, kraven på kvantitativa data som krävs för att ställa dem också kommer att öka. Vi anser att de metoder som beskrivs här, tillsammans med nya innovationer inom långsiktig mus imaging, kommer att göra denna process möjlig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	BD Biosciences	309602
3/10 cc Insulin Syringe	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine	Invitrogen	11875-119
Ampicillin	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Broth	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610