Summary
xenografts الورم في الفئران العوز المناعي البشري هي أدوات قيمة لدراسة بيولوجيا السرطان. موصوفة بروتوكولات محددة لتوليد xenografts تحت الجلد وداخل الكبد من خلايا سرطان الكبد الإنسان أو شظايا الورم. ويرد تجديد الكبد الناجم عن استئصال الكبد الجزئي في الفئران المتلقية كاستراتيجية لتسهيل engraftment داخل الكبد.
Abstract
في الجسم الحي نماذج تجريبية من سرطان الكبد (سرطان الكبد) أن ألخص هذا المرض الإنسان توفير منصة قيمة للبحث في الفيزيولوجيا المرضية المرض وقبل السريرية لتقييم علاجات جديدة. نقدم مجموعة متنوعة من الأساليب لتوليد تحت الجلد أو مثلي xenografts سرطان الكبد في الفئران العوز المناعي البشري التي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية. مع التركيز على استخدام أنسجة الورم الرئيسي من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الجراحي كنقطة انطلاق، ونحن تصف إعداد تعليق خلية الورم أو شظايا لxenografting. وصفنا تقنيات محددة لطعم أجنبي هذه الأنسجة ط) تحت الجلد، أو ب) intrahepatically، إما عن طريق زرع الخلايا السرطانية مباشرة أو شظايا في الكبد، أو بشكل غير مباشر عن طريق حقن الخلايا في الطحال الماوس. نحن أيضا وصف استخدام الاستئصال الجزئي للكبد الفأر الأم في وقت xenografting كاستراتيجية لإحداث حالة من التجديد الكبد النشط في الماوس المتلقي التي قد تسهل engraftment داخل الكبد من الخلايا السرطانية البشرية الأولية. ويوضح النتائج المتوقعة من هذه التقنيات. وقد تم التحقق من صحة البروتوكولات وصفها باستخدام الإنسان الأساسية HCC العينات وxenografts، التي تؤدي عادة أقل بقوة من خطوط الخلايا البشرية سرطان الكبد الراسخة التي يتم استخدامها على نطاق واسع في كثير من الأحيان واستشهد في الأدب. في المقارنة مع خطوط الخلايا، ونحن نناقش العوامل التي يمكن أن تسهم في فرصة منخفضة نسبيا من سرطان الكبد الأولية في engraftment نماذج زرع الأعضاء والتعليق على القضايا الفنية التي قد تؤثر على حركية النمو طعم أجنبي. نحن أيضا تشير الأساليب التي ينبغي تطبيقها لضمان الحصول على xenografts تشبه بدقة أنسجة سرطان الكبد الأم.
Introduction
سرطان الكبد (سرطان الكبد) هو خامس أكثر أنواع السرطان شيوعا في جميع أنحاء العالم والسبب الأكثر تزايدا سريعا للوفاة بالسرطان في أمريكا الشمالية. عامل الخطر الأكثر انتشارا لسرطان الكبد تليف الكبد هو، والتي تحدث بشكل متكرر نتيجة لالتهاب الكبد الفيروسي المزمن، إساءة استخدام الكحول، وأمراض المناعة الذاتية، أو اضطرابات التمثيل الغذائي الوراثية 1.
على الرغم من عبء المرض الثقيل الذي تفرضه على السكان في جميع أنحاء العالم HCC، يتم فهم الفيزيولوجيا المرضية لسرطان الكبد ضعيفا نسبيا بالمقارنة مع غيرها من أنواع السرطان الشائعة مثل القولون والمستقيم، وسرطان الثدي، أو سرطان البروستاتا. على سبيل المثال، لا تزال الأحداث الجزيئية والخلوية محددة يقود إلى تكون الأورام تكون محددة بوضوح 2. مثل معظم سرطانات الظهارية صلبة أخرى، كشفت النهج الجيني عدم التجانس في الانحرافات المرتبطة سرطان الكبد 3. وقد كشفت عدد من الدراسات النشاط المختلين من مجموعة متنوعة من مسارات إشارات تشارك في تكاثر الخلايا، سورvival، والتمايز، والأوعية الدموية 4. بالإضافة إلى ذلك، يبقى دور الخلايا الجذعية السرطانية في سرطان الكبد البيولوجيا المرضية إلى توضيح 5.
مع فهم محدود من سرطان الكبد الفيزيولوجيا المرضية، ظلت أرممنتريوم علاجات فعالة للسرطان الكبد أيضا محدودة نسبيا. المرضى في مرحلة مبكرة مع أورام الكبد تقتصر على المرشحين للعلاج العلاجية باستخدام الاجتثاث الورم أو استئصال الجراحي، على الرغم من تكرار أمر شائع. للمرضى الذين يعانون من مرض أكثر تقدما، والعلاج الكيميائي والإشعاع ذات فعالية محدودة وتستخدم في المقام الأول لمكافحة الأمراض بقصد الملطفة 6.
جودة عالية في نماذج تجريبية المجراة من سرطان الكبد الإنسان وبالتالي توفير منصة قيمة لحاجة الكثير من الأبحاث الأساسية في الفيزيولوجيا المرضية لسرطان الكبد الإنسان، وكذلك لتقييم النهج العلاجية الرواية. بالمقارنة مع استخدام خطوط الخلايا أو النماذج الماوس محددة للغاية، xenografts من الحزب الثوري المؤسسيظهرت أورام الإنسان ماري في الفئران العوز المناعي كأدوات قيمة لمثل هذه الدراسات لأنها قادرة على التلخيص الأمراض التي تصيب البشر مع الدقة العالية أثناء التقاط أيضا عدم التجانس التي موجود داخل وبين مختلف المرضى 7،8. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير مجموعة متنوعة من الأساليب لإنشاء xenografts سرطان الكبد في الفئران العوز المناعي البشري. في حين أن الغالبية العظمى من الدراسات المنشورة التي تنطوي على xenografts سرطان الكبد وصف استخدام خطوط الخلايا البشرية سرطان الكبد راسخة لهذا الغرض، فقد ركزنا على تحسين المقايسات جهدنا لتوليد xenografts من عينات سرطان الكبد الأولية التي تم الحصول عليها على الفور بعد استئصال الجراحي من المرضى.
قد يكون مطلوبا تقنيات xenografting مختلفة للتطبيقات البحثية المختلفة. على سبيل المثال، يتم إنشاء xenografts تحت الجلد الناتجة عن شظايا الورم بسرعة، يمكن رصدها بسهولة، وربما يكون من الأنسب للإدارة المحلية من علاجات جديدة مع مريحةرصد استجابة الورم. قد يكون xenografts داخل الكبد أكثر أهمية للدراسات المتعلقة بدور المكروية الكبدي سرطان الكبد في علم الأحياء. Xenografts المتولدة من تعليق خلية الورم ضرورية لتحديد وتوصيف مجموعات فرعية الخلايا السرطانية أو الشروع في التجارب التي تتطلب التلاعب في المختبر من خلايا الورم قبل زرع الأعضاء. وبالتالي قمنا بتطوير والتحقق من صحة البروتوكولات التالية لإنشاء تحت الجلد أو داخل الكبد xenografts من الايقاف الخلية أو شظايا الورم المشتقة من عينات سرطان الكبد الإنسان الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويقدم لمحة التخطيطي للبروتوكول في الشكل 1.
1. تجهيز العينات HCC الإنسان
الحصول على عينات سرطان الكبد الإنسان الأولية مع موافقة المريض الخطية وبموافقة من مجلس أخلاقيات البحوث المؤسسية. وقد أجريت هذه البروتوكولات بها في مؤسستنا مع موافقة من مجلس أخلاقيات البحوث الصحية شبكة جامعة في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية، والدولية من أجل رفاهية الإنسان.
جمع العينات HCC جديدة في أقرب وقت ممكن بعد إجراء العمليات الجراحية تم أخذ عينات مرة واحدة مناسبة لأغراض سريرية. من الناحية المثالية ينبغي أن تأخذ هذا المكان في غضون 30 دقيقة بعد إزالة الأنسجة من المريض. كما هو موضح في الشكل 2، وشمل عينة من 1 سم على الأقل 3 تم الحصول عليها من محيط الورم هو الأمثل، والجزء المركزي من الورم قد يكون نخرية.ويفضل الأورام التي لم تتلق أي علاج قبل استئصال مثل الإشعاع، والعلاج الكيميائي، أو الاجتثاث من أجل تعظيم فرصة أن الخلايا السرطانية هي قابلة للحياة. التعامل مع الأنسجة البشرية الأساسية وفقا للبروتوكولات الحماية الشخصية القياسية للمواد biohazardous. أداء جميع التلاعبات مختبر أنسجة الورم والاستعدادات خلية في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية باستخدام تقنيات العقيم.
- وضع عينة HCC جديدة في 10-25 مل معدلة F12 النسر متوسطة / هام 'ق Dulbecco والمصل خالية في 4 درجات مئوية، ونقل على الجليد إلى المختبر لمعالجة فورية وإعداد شظايا الأنسجة و / أو خلايا لxenografting في الفئران.
- باستخدام ملقط معقم، ضع عينة الورم في 100 مم × 20 مم طبق بتري أو غيرها من مناسبة سطح العمل العقيمة. تقسيم عينة الورم إلى أجزاء من حوالي 2-3 مم 3 باستخدام شفرة المشرط الجراحي NO.10. عند هذه النقطة، والنظر في الأداة الإضافية تجميد أو التلاعب في نتائج الفورمالين قلى بعد شظايا الورم لتجارب أخرى أو يحلل كما هو مطلوب.
- لxenografting من شظايا الورم، ضع بعض من شظايا سرطان الكبد في واحدة أو أكثر أنابيب microcentrifuge تحتوي على ما يكفي للسماح Matrigel شظايا بالبقاء مغمورة. إبقاء هذه الأنابيب على الجليد.
- لإعداد تعليق خلية الورم، واستخدام شفرة المشرط الجراحي لتخطر على أنسجة سرطان الكبد المتبقية قدر الإمكان وتخلط مع 5-10 مل من DMEM-F12 في أنبوب 50 مل المخروطية اعتمادا على حجم الأنسجة المفروم.
- إضافة نوع كولاجيناز الرابع وdispase الثاني بتركيزات النهائي من 200 وحدة / مل و 0.8 وحدة / مل على التوالي. ماصة الخليط صعودا وهبوطا جيدا باستخدام ماصة 25 مل.
- ختم الأنبوب واحتضان الخليط من الخطوة 1.6 عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون الحاضنة لمدة 30-60 دقيقة تبعا ليونة من أنسجة الورم. ماصة الخليط صعودا وهبوطا عدة مرات كل 10 دقيقة لتقييم التقدم المحرز في عملية الهضم الأنزيمية.
- بعد ديGESTION كاملة، وتمرير الحل الورم من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون. الهريس بلطف الأنسجة المتبقية على مصفاة الخلية باستخدام ماصة 25 مل تلميح لتمكين أكبر عدد ممكن من الخلايا السرطانية بالمرور. جمع تعليق خلية المتوترة في أنبوب مخروطي 15 مل.
- الطرد المركزي تعليق خلية الورم في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- صب بلطف طاف. اعتمادا على حجم بيليه، إضافة 2-5 مل من الجليد الباردة 1X خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة وبلطف ماصة صعودا وهبوطا ل resuspend بيليه. الحفاظ على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إضافة DMEM-F12 إلى وحدة تخزين ما مجموعه 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتغسل العازلة تحلل RBC.
- صب بلطف طاف و resuspend الحرة RBC بيليه الخلايا السرطانية في DMEM-F12.
- عد خلايا قابلة للحياة باستخدام الاستبعاد التريبان الأزرق إما يدويا أو مع خلية مكافحة الآلي.
- مأخوذة الطرد المركزي الخلايا السرطانية التي تحتوي على numbe المطلوبص من الخلايا للحقن كما هو موضح أعلاه، resuspend الكرية الخلية مما أدى إلى 30 ميكرولتر من الجليد الباردة Matrigel، ومتجر على الجليد.
اختياري: بعد الخطوة 1.11، ونحن بشكل روتيني CD45 + تستنفد خلايا الإنسان (الكريات البيض) من الخلية تعليق الورم الأكبر و / أو تنقية مجموعات فرعية من الخلايا السرطانية باستخدام التدفق الخلوي أو الخرز immunomagnetic. بروتوكولات مفصلة عن هذه التقنيات موصوفة بشكل جيد من قبل الشركات المصنعة للأجسام ذات الصلة، والخرز، وأجهزة قياس التدفق الخلوي.
ملاحظة: وصف بروتوكول أعلاه يمكن أن تستخدم أيضا لمعالجة ورم xenografts الإنسان تحصد من الفئران من أجل أداء زرع المسلسل، واستبدال الأنسجة طعم أجنبي للأنسجة سرطان الكبد الإنسان الأساسي في الخطوة 1.1. في هذه الحالة، بعد الخطوة 1.11، ونحن تستنزف بشكل روتيني تسلل خلايا الفئران من تعليق خلية باستخدام الأجسام المضادة ضد المستضد الماوس التوافق النسيجي H2K.
2.Xenografting
إجراء كافة الإجراءات الحيوانية في الامتثال للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية. وقد تم الانتهاء من الإجراءات الموضحة في هذه الوثيقة تحت محددة بروتوكول استخدام الحيوان التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان شبكة الصحة جامعة وفقا والامتثال لجميع الجهات ذات العلاقة التنظيمية والمؤسسية واللوائح والمبادئ التوجيهية.
معدات للتسليم من وكلاء مخدر متقلبة الاستنشاق للحيوانات الصغيرة ينبغي أن تستخدم وفقا لإجراءات التشغيل الموحدة للمنشأة الحيوان ومعهد البحوث. تنفيذ جميع العمليات الجراحية باستخدام تقنية العقيم وأدوات معقمة في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية. استخدام غير البدناء السكري نقص المناعة الشديد مجتمعة (NOD / SCID) أو NOD / SCID / انترلوكين 2 مستقبلات غاما سلسلة فارغة (مجموعة موردي المواد النووية) سلالات من الفئران من كلا الجنسين في 6-8 أسابيع من العمر (مختبر جاكسون، بار هاربور، ME) 9،10. هؤلاءيجب أن يضم الفئران وصيانتها في منشأة قادرة على توفير ظروف مناسبة خالية من مسببات الأمراض للحيوانات العوز المناعي.
إعداد الفئران لإجراء عملية جراحية في غرفة توريد 5٪ (ت / ت) استنشاق isoflurane وفي 1 لتر / دقيقة من الأوكسجين. الحفاظ على التخدير حتى يكون هناك فقدان منعكس القرنية وأخمص القدمين في الحيوان (ق). لxenografting تحت الجلد، ويحلق واحد أو أكثر من مجالات صغيرة على ظهر الحيوان (ق) وتطهير الجلد مع الايثانول 70٪. لxenografting داخل الكبد، يحلق الصدر والبطن بطني من الحيوان (ق) من الإبطين وصولا الى المنطقة الأربية وتطهير الجلد مع الايثانول 70٪.
2.1 زرع تحت الجلد من شظايا ورم
- ضع الماوس تخدير عرضة، والحفاظ على التخدير الاستنشاق isoflurane و(2٪ (ت / ت) في 1 لتر / دقيقة O 2) مع لسان حال. تطبيق المسيل للدموع جل لحماية العينين الحيوان من الإصابات.
- تعقيم المنطقة الظهرية حلق (s) مع بتدينفرك الجراحية تليها الايثانول 70٪ وأخيرا مع محلول البوفيدون اليود.
- جعل 5 مم شق الجلد باستخدام مقص حاد العقيمة.
- إدراج مقص حادة مغلق برفق في الفضاء تحت الجلد وتنتشر بلطف لتطوير جيب كبيرة بما يكفي لاستيعاب جزء الورم.
- إدراج جزء الورم أعدت في الخطوة 1.3 في جيب تحت الجلد باستخدام ملقط غرامة معقمة.
- إغلاق شق الجلد باستخدام الخيوط الجراحية أو مقاطع.
- توفير الرعاية بعد العملية الجراحية لالماوس كما هو موضح أدناه.
2.2 الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية
- إعداد الحيوان كما هو موضح في الخطوات 2.1.1 و2.1.2.
- تحميل تعليق الخلايا السرطانية في Matrigel أعدت في الخطوة 1.13 في حقنة الأنسولين مع 29 G 1/2 في الإبرة.
- ادخال الإبرة في الفضاء تحت الجلد وتفريغ محتويات الحقنة. تتقدم الإبرة عدة مليمترات على طول الطائرة تحت الجلد بعيدا الابأوم الموقع ثقب الجلد يمنع تسرب تعليق الخلية السرطانية من موقع الوخز على سحب الإبرة.
- توفير الرعاية بعد العملية الجراحية لالماوس كما هو موضح أدناه.
2.3 زرع داخل الكبد من شظايا ورم
- باستخدام 27 G 1/2 في إبرة على حقنة 1 مل، 350 ميكرولتر من إدارة معقمة طبيعية تحت الجلد محلول ملحي في ظهر الرقبة تخدير الحيوان للتعويض عن الخسائر السوائل أثناء العملية. لتسكين وإدارة 350 ميكرولتر من العقيمة المالحة العادية التي تحتوي على البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) تحت الجلد على الجناح الحيوان، وذلك باستخدام إبرة 1/2-in 27 G على حقنة 1 مل.
- ضع الماوس مستلق على وسادة قبل ساخنة مع الأنف والفم وضعه داخل المعبرة لتقديم الصيانة التخدير الاستنشاق isoflurane و(2٪ (ت / ت) في 1 لتر / دقيقة O 2).
- تمديد أطرافه وتأمينها مع الشريط على سطح التشغيل لتحسين التعرض للالبطن بطني والصدر.
- تنفيذ الإجراء تحت مصباح المكبرة لتحسين التصور.
- تعقيم الجلد حلق على البطن بطني والصدر مع بتدين فرك الجراحية تليها الايثانول 70٪ وأخيرا مع محلول البوفيدون اليود.
- باستخدام مقص حاد العقيمة، وجعل عرضية الثنائية تحت الضلع شق الجلد وتقسيم طبقات العضلات لدخول التجويف البريتوني للسماح التعرض الكافي للكبد كامل.
- وضع غرزة في الجلد فوق الناتئ الرهابي وثبته لسان حال بشريط من أجل السماح التعرض أفضل من الكبد والهياكل المحيطة بها.
- استخدام اثنين من تطبيقها القطن ذات الرؤوس المجاورة والخلفية إلى الكبد لتحقيق الاستقرار فيه.
- إجراء شق 3 ملم في الطول والعمق على سطح الكبد باستخدام مشرط معقم رقم 10 شفرة.
- تطبق على الفور Surgicel وضغط لطيف على موقع شق لتحقيق الارقاء، وإزالة بعد 60-90 ثانيةوالمضي قدما الا اذا كان قد تم تحقيق الإرقاء كاملة.
- وضع جزء خطوة الورم 1.3 في شق الكبد مع ملقط غرامة معقمة أو مع إبرة G 18.
- تطبيق قطعة صغيرة من خلال شق Surgicel الكبد لمنع تشريد جزء الورم وضمان استمرار الارقاء.
- إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع.
- توفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه
2.4 زرع الخلايا السرطانية داخل الكبد عبر الحقن المباشر في الكبد
- إعداد الماوس كما هو موضح في خطوات 2.3.1 إلى 2.3.7 أعلاه.
- تحميل تعليق الخلية السرطانية (المعد في الخطوة 1.13) في حقنة الانسولين باستخدام 29 G 1/2 في الإبرة.
- مع استقرار الكبد باستخدام قضيب من القطن طرف، إدراج حقنة الأنسولين الإبرة في الكبد ودفع غيض بضعة ملليمترات وراء موقع الوخز على طول الطائرة تحت المحفظة.
- الوفاء بلطف محتويات حقنة ورالدجاجة إزالة الإبرة من الكبد.
- المكان Surgicel على موقع البزل وتطبيق ضغط لطيف مع قضيب من القطن ذات الرؤوس لمنع التسرب من تعليق خلية الورم وتحقيق الإرقاء كاملة.
- إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع وتوفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه.
2.5 Xenografting داخل الكبد من الخلايا السرطانية عن طريق الحقن في الطحال
- إعداد الماوس كما هو موضح في الخطوات 2.3.1 إلى 2.3.5 أعلاه.
- باستخدام مقص حاد العقيمة، وجعل ترك 1 سم تحت الضلع شق للدخول في التجويف البريتوني.
- استخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس لتعكس المعدة cranially والجانب الأيمن الحيوان من أجل فضح الطحال.
- من خلال التعامل مع الأنسجة الدهنية المحيطة بها مع ملقط معقم ارضحي غرامة، وتقديم الطحال في شق ووضع قضيب من القطن ذات الرؤوس وراء الطحال لتحقيق الاستقرار فيه.
- باستخدام 5-0 خياطة الحرير، ومكانعقدة فضفاضة مرتبطة مسبقا حول الطحال فوق القطب السفلي.
- تحميل تعليق الخلية السرطانية (المعد في الخطوة 1.13) في حقنة الانسولين باستخدام 29 G 1/2 في الإبرة.
- إدراج الأنسولين حقنة الإبرة في القطب السفلي من الطحال ودفع من الماضي من مستوى عقدة فضفاضة مرتبطة مسبقا.
- الوفاء ببطء محتويات حقنة، وإزالة الإبرة من الطحال، وتشديد عقدة لمنع أي تسرب من تعليق خلية الورم حقن.
- استبدال الطحال في التجويف البريتوني.
- إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع وتوفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه.
2.6 استئصال الكبد الجزئي لتسهيل داخل الكبد Engraftment من نسيج الورم الإنسان
- إعداد الماوس كما هو موضح في الخطوات 2.3.1 إلى 2.3.7.
- مع مقص حاد العقيمة، تقسيم الرباط المنجلي تعلق على الفص وسيطة من الكبد.
- باستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس، وحشدالفص الأيسر من الكبد وموقف عقدة فضفاضة تعادل 5-0 قبل من الحرير خياطة حول الفص الأيسر. دفع عقدة فضفاضة في أقرب وقت ممكن من أجل عنيق-bilio الأوعية الدموية في الفص الأيسر وتشديد عقدة.
- استئصال الفص الأيسر البعيدة إلى ربطة باستخدام مقص العقيمة، وترك جذع صغير لمنع انزلاق عقدة ونزيف اللاحقة.
- باستخدام تقنية مماثلة، ligate ويقطع غالبية الفص وسيطة من الكبد، وتجنب المرارة.
- استخدام Surgicel وضغط لطيف مع قضيب من القطن ذات الرؤوس على طول أسطح قطع لحمة الكبد لتحقيق الإرقاء كاملة.
- لxenografting داخل الكبد من جزء أو ورم الخلايا السرطانية، والمضي قدما مع خطوات 2.3.8 إلى 2.3.11 أو 2.4.2 إلى 2.4.5 كما هو موضح أعلاه.
- لxenografting داخل الكبد من الخلايا السرطانية عن طريق الحقن الطحال، والاستفادة من تطبيقها القطن ذات الرؤوس لتعكس بلطف المعدة cranially والجانب الأيمن الحيوان، exposiنانوغرام الطحال. المضي قدما في خطوات 2.5.4 إلى 2.5.9 كما هو موضح أعلاه.
- إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع وتوفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه.
2.7 رعاية ما بعد الجراحة
- إزالة الماوس من التخدير سان حال الاستنشاق.
- ضع الماوس في قفص تحت مصباح الحرارة لمدة 20 دقيقة تقريبا حتى تعافى من التخدير وحشد بالكامل.
- تكرار الجرعة كل 8-12 ساعة البوبرينورفين خلال 2-3 أيام بعد العملية الجراحية الأولى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 3 مظهر نموذجي من تحت الجلد طعم أجنبي HCC الإنسان وظهور الأنسجة المقابلة للورم. تطوير ونمو xenografts تحت الجلد يمكن رصدها بسهولة عن طريق الفحص اليومي من الفئران المتلقية. الفاصل الزمني بين xenografting وتطوير ورم قد تختلف اختلافا كبيرا تبعا لنوع من الأنسجة (الورم جزء مقابل تعليق خلية)، ومصدر من الأنسجة (العينة الأولية المريض، طعم أجنبي passaged، أو خط الخلية)، وكمية من النسيج المزروع ( عدد الخلايا أو حجم الورم جزء). على سبيل المثال، قد xenografts لا بأس به من تطوير حقن 5 × 10 6 خلايا من خط خلية سرطان الكبد راسخة في غضون 1-2 أسابيع، في حين قد يكون مطلوبا 6 أشهر لوضع طعم أجنبي مماثلة من 1 × 10 5 خلايا التي تم الحصول عليها من عينة مريض سرطان الكبد الأولي. ونحن لم يلحظ تشكيل طعم أجنبي تحت الجلد في وقت لاحق من 6 أشهر بعد implantatioن من عينة الورم، وبالتالي التضحية الفئران المتلقي في هذا timepoint إذا xenografts لم تتطور.
يوضح الشكل 4 المظاهر نموذجية من داخل الكبد xenografts سرطان الكبد البشرية التي تحققت من زرع مباشرة لأنسجة الورم في الكبد وكذلك تلك التي تحققت من حقن الخلايا السرطانية في الطحال. xenografts داخل الكبد لا يمكن الكشف عنها بسهولة من قبل الفحص البدني العام من الماوس المتلقي إلا إذا كان الورم كبيرا للغاية أو أدى إلى تطور استسقاء أو انتفاخ البطن. على الرغم من طرائق التصوير حيوان صغير مثل الفحص بالاشعة المقطعية متوفرة في بعض معاهد البحوث، ويمكن أن تستخدم لاستجواب دقيق لكبد الفئران المتلقي 11، ونحن لا نعتبر هذا النهج المعمول بها على نطاق واسع، والعملية، أو فعالة من حيث التكلفة بالنسبة لمعظم المحققين. وقد لاحظنا أن المعدل الذي xenografts داخل الكبد تطوير يشبه المعدل الذي subcutaneoلنا xenografts تطوير، ويتأثر مماثل متغيرات مثل نوع، والمصدر، وكمية من النسيج المزروع. استنادا إلى أداء xenografts تحت الجلد مشتقة من نفس أنسجة الأم التي استخدمت لxenografts داخل الكبد، نختار timepoint للتضحية من الماوس المتلقي وفحص الكبد إلا دليل واضح على وجود ورم داخل الكبد كبيرة موجودا قبل ذلك. وقد لاحظنا أن إضافة استئصال الكبد الجزئي إلى إجراء xenografting داخل الكبد تستخدم يحسن من احتمال تحقيق engraftment من أنسجة الورم الإنسان في كبد الفأر، ولكن لا يبدو أن تسريع وتيرة النمو طعم أجنبي.
ويلخص الجدول 1 معدلات engraftment الورم تحقق بعد زرع أنسجة سرطان الكبد الإنسان الأساسية في الفئران العوز المناعي باستخدام تقنيات مختلفة وصفها في هذا البروتوكول. لكل طريقة الزرع، مقام معدل تأخذ الورم يعكس همهمة فريدة من نوعها عينة سرطان الكبد. تثبت هذه البيانات، بالنسبة للأنسجة سرطان الكبد الإنسان الأساسية، ومعدلات engraftment تحت الجلد هي أدنى من معدلات engraftment داخل الكبد عن طريق الحقن الخلايا السرطانية داخل الكبد ورم داخل الطحال أو جزء غرس تحقيقها، ويبدو أن استئصال الكبد الجزئي لتعزيز engraftment داخل الكبد. على الرغم من أننا قد استخدمت بنجاح حقن الخلايا مباشرة في كبد الفأر لتوليد xenografts داخل الكبد من خطوط راسخة الإنسان HCC الخلية (لا تظهر البيانات)، ونحن لم تتولد أي xenografts داخل الكبد مع هذا الأسلوب باستخدام عينات سرطان الكبد الإنسان الأساسية على الرغم من استخدام استئصال الكبد الجزئي .
الشكل 1. نظرة عامة التخطيطي من البروتوكول توضح سير العمل لتجهيز وإعداد عينة سرطان الكبد، فضلا عن خيارات xenografting اللاحقة (الشكل).
544fig2.jpg "/>
الشكل 2. عينة الكبد استئصال من مريض مع سرطان الكبد. كان هذا المريض لم يتلق أي علاج مساعد للورم. يشير مربع أبيض جزء قابلة للحياة من الورم بالقرب من المحيط الذي حصلت لxenografting. شريط النطاق في أعلى اليمين يتوافق مع 1 سم.
الرقم 3. الكبد الإنسان طعم أجنبي سرطان الناتجة عن الحقن تحت الجلد من خلايا الورم. A) الورم يمكن تقدير بسهولة على الجهة اليمنى للحيوان. B) ويعتبر الورم لتكون متميزة عن الأنسجة المحيطة بها بعد التضحية الحيوانية. ج) الأنسجة الورم يوضح ملامح نموذجية من سرطان الكبد، بما في ذلك الخلايا الكبدية مثل مع انمطية النووية والنووية نسبة إلى هيولي عالية، وغياب مساحات المدخل، وشعبة نظمترابيق orted مع زيادة سمك ألواح الخلايا الكبدية. يتوافق شريط النطاق إلى 1 سم في لوحات A و B، و 100 ميكرومتر في لوحة C. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. xenografts داخل الكبد سرطان الكبد الإنسان. A) طعم أجنبي المتولدة من زرع جزء الورم الإنسان في كبد الفأر. الورم Intraparenchymal المشار إليها بواسطة السهم الأسود. حجم المسطرة في الجزء السفلي من الصورة في الطول. B) طعم أجنبي الناتجة عن حقن الخلايا السرطانية البشرية في الطحال الماوس التالية استئصال الكبد الجزئي. الورم Intraparenchymal المشار إليها بواسطة السهم الأسود. يتوافق شريط النطاق إلى 1 سم. القسم C) علم الأنسجة من خلال هامش طعم أجنبي داخل الكبد demonstratالمظاهر التقليدية لسرطان الخلايا الكبدية البشرية (أسفل اليمين) والمتاخمة كبد الفأر العادي (أعلى اليسار) جي. يتوافق شريط النطاق إلى 100 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
| غرس الموقع | طرق زرع | ورم تحمل قيم |
| تحت الجلد | تعليق خلية | 6/55 (10.9٪) |
| الورم جزء | 23/136 (16.9٪) | |
| طحال | تعليق خلية | 3/15 (20٪) * |
| تعليق خلية + استئصال الكبد الجزئي | 6/14 (42.9٪) * | |
| كبد | الورم جزء | 6/13 (46.2٪) |
| الورم جزء + استئصال الكبد الجزئي 2/3 (66.7٪) | ||
| تعليق خلية | يتم تنفيذ | |
| تعليق خلية + استئصال الكبد الجزئي | 0/8 (0٪) | |
| * نسبة العينات التي أسفرت عن العقيدات الورم داخل الكبد | ||
الجدول 1. معدلات سرطان الكبد في الإنسان engraftment الفئران العوز المناعي المقابلة لتقنيات زرع مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفناها مجموعة متنوعة من التقنيات لإقامة تحت الجلد وداخل الكبد xenografts سرطان الكبد في الفئران العوز المناعي البشري التي يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الأسئلة التجريبية والمقايسات. في حين xenografts تحت الجلد وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة مختلف جوانب سرطان الكبد البيولوجيا، ونادرا ما وصفه xenografts داخل الكبد في الأدب. وعلاوة على ذلك، فإن غالبية الدراسات التي تصف استخدام xenografts لقد ولدت هذه من خطوط الخلايا راسخة. بالنظر إلى القيود المفروضة على خطوط الخلايا السرطانية في نمذجة البيولوجيا الورم الإنسان 12، كنا متحمسين للتحقق من صحة الأساليب المذكورة أعلاه باستخدام أنسجة الإنسان سرطان الكبد الأولية. وإن لم يكن يدعمها التحليل الإحصائي بسبب أحجام عينة صغيرة من المجموعات التجريبية، ملاحظاتنا تكشف ذاتي اتجاها نحو تحسين معدلات مقنعة engraftment مع إضافة استئصال الكبد الجزئي لغرس الخلايا السرطانية داخل الكبد أو شظايا. </ ع>
حققت عدد قليل من الدراسات التي حاولت بدقة للاستفادة من الأنسجة الأولية الناجحة engraftment تحت الجلد مع وجود نسبة صغيرة جدا من العينات التي تم الحصول عليها المريض 13-15. لاحظنا أيضا أن نسبة العينات HCC الإنسان الأساسية التي تدبر بنجاح في الفضاء تحت الجلد من الفئران العوز المناعي باستخدام التقنيات الموضحة أعلاه يقتصر على ما يقرب من 15٪. في كبد الإنسان، آفات سرطان الكبد هي مفرط الأوعية، وتلقي إمدادات الدم لديهم في الغالب عن طريق الشريان الكبدي 16،17. نحن التكهن بأن معدل engraftment منخفضة من أنسجة سرطان الكبد الأولية التي نحن وغيرنا وقد لاحظ قد يكون نتيجة لضعف أنسجة سرطان الكبد جديدة لنقص الأكسجين النسبي للالمكروية التي هي في xenografted، بدون إمدادات الشرياني المعمول بها. قد accou أيضا حساسية أنسجة سرطان الكبد إلى نخر الدماغية السريع في الفترة الفاصلة بين استئصال الجراحي وxenograftingNT للحصول على معدل منخفض engraftment المحرز في الفئران.
لتوليد داخل الكبد سرطان الكبد xenografts الإنسان من تعليق خلية الورم، وجدنا أن حقن الخلايا في الطحال هو نهج مواتية من الناحية الفنية التي تنتج في معدلات متفوقة من engraftment الكبد من عينات سرطان الكبد الإنسان الأساسية. الطحال هو بنية أوعية دموية للغاية والتي يمكن أن تدعم أفضل خلايا سرطان الكبد بالمقارنة مع مواقع أخرى في الجسم الماوس، ومنها الخلايا السرطانية تظهر من السفر بسهولة إلى الكبد عبر الأوردة الطحال وبوابة. بالمقارنة مع لحمة الكبد، الى التي من الصعب من الناحية الفنية لحقن الخلايا مباشرة دون تسرب أو نزف، والطحال لديه القدرة الهيكلية لاستيعاب حجم التعليق الخلية التي يتم ضخها، ويمكن ligated بسهولة بمجرد حقن الخلايا السرطانية اكتمال. حقن الايقاف الخلية مباشرة في الوريد البابي أو الشريان الكبدي في الفئران 6-8 أسبوع من العمر ليس تقنيا اتحاد البورصات الأوروبية الآسيويةإيبل.
لقد استخدمت استئصال الكبد الجزئي في الفئران المتلقية لتسهيل engraftment داخل الكبد من سرطان الكبد الأنسجة البشرية. على الرغم من أن نماذج الماوس من استئصال الكبد الجزئي قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة علم الأحياء للتجديد الكبد 18، نحن لسنا على علم بأي تقارير واصفا إياه بالاشتراك مع زرع الأعضاء داخل الكبد السرطانية. منذ تجديد الكبد يحدث بسرعة خلال أول عدة أيام التالية استئصال الكبد الجزئي، ونحن تكهن بأن التعبير تتعزز بشكل كبير من المحفزات مولد للتفتل وعائية داخل حمة الكبد ستدعم بشكل أفضل engraftment وانتشار عرضة الأنسجة السرطانية البشرية أو الخلايا المزروعة داخل الجزء المتبقي من الكبد الماوس، بالمقارنة مع كبد الفأر في "يستريح" دولة 19. في البشر، وتقدم أكبر عامل خطر لسرطان الكبد تليف الكبد تطوير أو تليف الكبد، والذي يتميز تطوير التجدد لا غير منظمdules، والذي تم تصور بعض كدولة من اصابة الكبد المزمن وتجديد 20. التقنيات التي أثبتت أننا لتدبر أنسجة سرطان الكبد الإنسان في كبد الفأر من خلال تفعيل تجديد الكبد قد تكون نموذجا قيما للسماح التحقيق في دور المكروية كبدي وآليات التجدد الكبد في الفيزيولوجيا المرضية لسرطان الكبد.
في حين أن الأساليب المذكورة هنا هي قادرة على توليد عالية الجودة xenografts سرطان الكبد الإنسان الأولية في الفئران العوز المناعي، يجب أن تفكر المحققين استخدام هذه البروتوكولات النظر في بعض القيود المفروضة على النموذج. أولا، لدينا بروتوكولات تتضمن الحد الأدنى من التأخير بين الاستئصال الجراحي للأنسجة المريض والمعالجة اللاحقة لها في المختبر، ولكن تحقيق معدلات عالية engraftment ظلت على التحدي، وهذا يشير إلى أن تنفيذ هذه التقنيات قابلة للحياة يتطلب القرب من المريض موقع جمع الأنسجة لمختبر، أو البنية التحتية التي يمكن أن تقلل التأخير في نقل العينات الطازجة. الثانية، يجب إجراء العمليات الجراحية داخل البطن معقدة على 6-8 الاسبوع الفئران العوز المناعي القديمة من قبل أفراد مدربين بشكل مناسب من أجل تحقيق البقاء للحيوانات لعدة أشهر قبل تشكيل xenografts، وهذه الإجراءات والرعاية اللاحقة الحيوان على حد سواء كثيفة الوقت والموارد. الثالث، وتطور وتقدم xenografts داخل الكبد لا يمكن رصدها بسهولة من دون التضحية الحيوانات في timepoints محددة سلفا، مما يحد من فائدة xenografts في هذا الموقع لبعض أنواع المقايسات على النحو المبين أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، xenografts داخل الكبد المشتقة من حقن الخلايا في الطحال قد يقدم العقيدات متعددة كما المنتشرة في جميع أنحاء لحمة الكبد التي يصعب قياسها كميا بدقة من حيث إجمالي عبء الورم. أخيرا، من المهم أن نلاحظ أن الورم داخل الكبد العقيدات الناجمة عن حقن الخلايا في الطحال قد حددتعكس ively مجموعات سكانية فرعية معينة من الخلايا القادرة على الهجرة من الطحال إلى الكبد والورم اللاحقة البدء.
عند إنشاء xenografts من أنسجة سرطان الكبد الإنسان الأساسية، من المهم أيضا للتأكد من أن xenografts الناتجة تشبه سرطان الكبد. لقد أثبتنا سابقا أن الأورام اللمفاوية يمكن أن تتطور دون قصد من الكريات البيض الركاب داخل أنسجة سرطان الكبد xenotransplanted الإنسان 21. وبالتالي فإننا تستنزف بشكل روتيني CD45 + الكريات البيض البشرية من تعليق خلية الورم الرئيسي والاستفادة RT-PCR، التدفق الخلوي، وتقييم الأنسجة، والمناعية لفحص xenografts لخصائص نموذجية من سرطان الكبد. عند الركض xenografts أنشأت لمزيد من الدراسات، كما ينبغي المنضب خلايا الفئران-تسلل الورم باستخدام الأجسام المضادة ضد المستضد الماوس التوافق النسيجي H2K. إذا ينطوي على تطبيق البحوث استخدام شظايا الورم أو قياس النمو طعم أجنبي، وتحليل xenograيجب FTS في نقطة النهاية الدراسة تشمل تقييما للدرجة التي تسللت الأورام بواسطة الكريات البيض البشرية وخلايا فأر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة المرحلة 1 جائزة الطبيب-ساينتست (AG) وغرانت التشغيل من جمعية أبحاث السرطان (AG). المؤلفون ممتنون للدكتور جون ديك لدعمه لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
