Summary
Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.
Abstract
En modelos experimentales in vivo de carcinoma hepatocelular (HCC) que recapitular la enfermedad humana proporcionan una valiosa plataforma para la investigación en la fisiopatología de la enfermedad y para la evaluación preclínica de nuevas terapias. Se presenta una variedad de métodos para generar subcutánea o ortotópico xenoinjertos de HCC humano en ratones inmunodeficientes que podría ser utilizado en una variedad de aplicaciones de investigación. Con un enfoque en el uso de tejido de tumor primario de pacientes sometidos a resección quirúrgica como punto de partida, se describe la preparación de suspensiones de células o fragmentos de tumor de xenoinjerto. Se describen técnicas específicas para estos tejidos xenoinjerto i) por vía subcutánea, o ii) intrahepatically, ya sea por implantación directa de células tumorales o fragmentos en el hígado, o indirectamente mediante la inyección de células en el bazo de ratón. También describimos el uso de la resección parcial del hígado de ratón nativo en el momento de xenoinjertos como una estrategia parainducir un estado de regeneración hepática activa en el ratón receptor que pueden facilitar el injerto intrahepática de las células tumorales humanas primarias. Los resultados esperados de estas técnicas se ilustran. Los protocolos descritos se han validado utilizando muestras y xenoinjertos humanos HCC primaria, que suelen realizar menos robusta que las líneas celulares de HCC humano bien establecidos que se utilizan ampliamente y frecuentemente citados en la literatura. En comparación con las líneas celulares, se discuten los factores que pueden contribuir a la relativamente baja probabilidad de injerto HCC primaria en modelos de xenotrasplante y hacer comentarios sobre cuestiones técnicas que pueden influir en la cinética de crecimiento de xenoinjertos. También le sugerimos los métodos que deben aplicarse para garantizar que los xenoinjertos obtenidos se asemejan con exactitud HCC tejidos padres.
Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común en todo el mundo y el más rápido aumento de la causa de muerte por cáncer en Estados Unidos. El factor de riesgo más frecuente para el CHC es la cirrosis hepática, que ocurre con mayor frecuencia debido a la hepatitis crónica viral, el uso indebido de alcohol, enfermedades autoinmunes o trastornos metabólicos hereditarios 1.
A pesar de la pesada carga de enfermedades impuesta por HCC en las poblaciones de todo el mundo, la fisiopatología de la HCC es relativamente poco conocida en comparación con otros cánceres comunes como los colorrectales, de mama o cáncer de próstata. Por ejemplo, los eventos moleculares y celulares específicos tumorigénesis de conducción aún no se han definido claramente 2. Al igual que la mayoría de los otros cánceres epiteliales sólidos, los enfoques genómicos han revelado la heterogeneidad en las aberraciones asociadas con HCC 3. Un número de estudios han puesto de manifiesto la actividad desordenada de una variedad de vías de señalización implicadas en la proliferación celular, sursupervivencia, la diferenciación, y la angiogénesis 4. Además, el papel de las células madre de cáncer en el CHC patobiología Queda por aclarar 5.
Con una comprensión limitada de HCC fisiopatología, el arsenal de terapias efectivas para el CHC también ha permanecido relativamente limitada. Pacientes en etapa temprana con tumores confinados al hígado son candidatos para tratamiento curativo mediante la ablación del tumor o la resección quirúrgica, aunque la recurrencia es común. Para los pacientes con enfermedad más avanzada, la quimioterapia y la radiación son de eficacia limitada, y se utilizan principalmente para el control de la enfermedad con intención paliativa 6.
Alta calidad en modelos experimentales in vivo de HCC humano por lo tanto proporciona una valiosa plataforma para la investigación básica tan necesaria en la fisiopatología de HCC humano, así como para la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos. En comparación con el uso de líneas celulares o modelos de ratón altamente definidos, xenoinjertos de PRImary tumores humanos en ratones inmunodeficientes han surgido como herramientas valiosas para tales estudios ya que son capaces de recapitular la enfermedad humana con alta fidelidad, mientras que también la captura de la heterogeneidad que está presente dentro y entre diferentes pacientes 7,8. Para este fin, hemos desarrollado una variedad de métodos para establecer xenoinjertos de HCC humanos en ratones inmunodeficientes. Mientras que la mayoría de los estudios publicados que implican xenoinjertos de HCC describen el uso de líneas celulares de HCC humano bien establecidos para este propósito, nos hemos centrado en la optimización de nuestros ensayos para generar los xenoinjertos a partir de muestras de HCC primarios obtenidos inmediatamente después de la resección quirúrgica de pacientes.
Diferentes técnicas de xenoinjertos pueden ser necesarios para diferentes aplicaciones de investigación. Por ejemplo, xenoinjertos subcutáneos generados a partir de fragmentos de tumor se generan rápidamente, se monitorizan fácilmente, y pueden ser más apropiadas para la administración local de nuevas terapias con convenienteseguimiento de la respuesta del tumor. Xenoinjertos intrahepáticos pueden ser más relevantes para los estudios relativos a la función del microambiente hepática en biología HCC. Los xenoinjertos generados a partir de suspensiones de células tumorales son necesarios para la identificación y caracterización de los subconjuntos de células iniciadoras del tumor o para experimentos que requieren en manipulaciones in vitro de células tumorales antes de los xenotrasplantes. Así, hemos desarrollado y validado los siguientes protocolos para establecer subcutánea o xenoinjertos intrahepáticas de las suspensiones de células o fragmentos tumorales derivadas de muestras de HCC humano primarios.
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Protocol
Una visión general esquemática del protocolo se presenta en la Figura 1.
1. El procesamiento de las muestras de HCC humano
Obtener muestras de HCC humano primarias con el consentimiento del paciente por escrito y con la aprobación del comité de ética de investigación institucional. Estos protocolos se han realizado en nuestra institución con la aprobación de la Junta de Ética de Investigación de la Red de Salud de la Universidad en el cumplimiento de todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano.
Obtener muestras de HCC frescos tan pronto como sea posible después del procedimiento quirúrgico muestras una vez apropiadas han sido tomadas para fines clínicos. Idealmente, esto debería tener lugar dentro de 30 min después de la eliminación del tejido del paciente. Como se ilustra en la Figura 2, una muestra de al menos 1 cm 3 obtenida a partir de la periferia del tumor es óptima, como la parte central del tumor puede ser necrótico.Los tumores que no han recibido ningún tratamiento antes de la resección, tales como radiación, quimioterapia o ablación se prefieren a fin de maximizar la probabilidad de que las células tumorales son viables. Mango tejidos humanos primarios de conformidad con los protocolos de protección personal estándar para materiales biológicamente peligrosos. Realice todas las manipulaciones de laboratorio de los tejidos tumorales y preparaciones de células en un gabinete de bioseguridad clase II usando técnicas asépticas.
- Coloque la muestra HCC fresca en 10-25 ml F12 Modificado Medio Eagle / Ham 's de Dulbecco libre de suero a 4 ° C y transferir en hielo al laboratorio para su procesamiento inmediato y la preparación de fragmentos y / o células de tejido de xenoinjerto en ratones.
- Usando una pinza estéril, coloque la muestra de tumor en un 100 mm x 20 mm placa de Petri u otra superficie de trabajo estéril adecuado. Dividir la muestra de tumor en fragmentos de aproximadamente 2-3 mm 3 utilizando una hoja de bisturí quirúrgico N º 10. En este punto, considere complemento de congelación o formalina fijadoras slgunos fragmentos tumorales para otros experimentos o análisis según sea necesario.
- Para los xenoinjertos de fragmentos de tumor, colocar algunos de los fragmentos de HCC en uno o más tubos de microcentrífuga que contiene suficiente Matrigel para permitir que los fragmentos permanezcan sumergidos. Mantenga estos tubos en hielo.
- Para la preparación de una suspensión de células tumorales, usar la hoja de bisturí quirúrgico para picar el tejido HCC restante tanto como sea posible y mezclar con 5-10 ml de DMEM-F12 en un tubo cónico de 50 ml, dependiendo del volumen de tejido picado.
- Añadir colagenasa tipo IV y dispasa II a concentraciones finales de 200 unidades / ml y 0,8 unidades / ml, respectivamente. Pipetear la mezcla de arriba y abajo, así con una pipeta 25 ml.
- Sellar el tubo e incubar la mezcla de la etapa 1.6 a 37 ° C en un incubador de dióxido de carbono al 5% durante 30-60 min en función de la suavidad del tejido tumoral. Pipetear la mezcla arriba y abajo un par de veces cada 10 min para evaluar la marcha de la digestión enzimática.
- Después digestion es completa, pasar la solución del tumor a través de un colador de 100 micras de células. Machacar suavemente el tejido que queda en el filtro de células usando una punta de pipeta de 25 ml para que el máximo número de células tumorales que pasar a través. Recoger la suspensión de células tensa en un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar la suspensión de células tumorales a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Decantar con cuidado el sobrenadante. Dependiendo del tamaño de la pastilla, añadir 2-5 ml de hielo 1x frío de glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis y suavemente pipetee arriba y hacia abajo para volver a suspender el sedimento. Mantener en hielo durante 5 min.
- Añadir DMEM-F12 hasta un volumen total de 15 ml y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C para lavar el tampón de lisis RBC.
- Decantar con cuidado el sobrenadante y resuspender el botón celular tumoral RBC-libre en DMEM-F12.
- Contar las células viables mediante exclusión con azul de tripano, ya sea manualmente o con un contador de células automatizado.
- Alícuotas de células tumorales de centrífuga que contiene la Numbe deseadaR de las células para inyección como se describe anteriormente, resuspender el sedimento celular resultante en 30 l de Matrigel enfriado con hielo, y almacenar en hielo.
Opcional: Después del paso 1.11, que rutinariamente agotamos + células CD45 humanos (leucocitos) de la suspensión de células tumorales a granel y / o purificar subconjuntos de células tumorales mediante citometría de flujo o perlas inmunomagnéticas. Los protocolos detallados para estas técnicas están bien descritos por los fabricantes de los anticuerpos pertinentes, perlas, y citómetros de flujo.
Nota: El protocolo descrito anteriormente también se puede utilizar para procesar xenoinjertos tumorales humanos recogidas de ratones con el fin de realizar el trasplante en serie, sustituyendo el tejido de xenoinjerto para el tejido HCC humano primario en el paso 1.1. En esta situación, después de la etapa 1.11, que rutinariamente agotamos la infiltración de células murinas de la suspensión celular utilizando un anticuerpo contra el antígeno de histocompatibilidad de ratón H2K.
2.Xenoinjertos
Llevar a cabo todos los procedimientos con animales en el cumplimiento de los protocolos aprobados por el comité de cuidado de los animales institucional. Los procedimientos descritos en este documento se han cumplido en un Protocolo específico la utilización de animales aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network de conformidad y el cumplimiento de todos los organismos pertinentes de las normativas e institucionales, normas y directrices.
Equipo para suministro de agentes anestésicos volátiles inhalatorios a los animales pequeños se debe utilizar de acuerdo con los procedimientos operativos estándar de las instalaciones de animales y el instituto de investigación. Llevar a cabo todos los procedimientos quirúrgicos complejos que requieren una técnica aséptica e instrumentos estériles en un gabinete de seguridad biológica de clase II. Utilizar los no obesos de inmunodeficiencia combinada severa diabético (NOD / SCID) o NOD / SCID / interleucina 2 cadena de nulos receptor gamma (GSN) cepas de ratones de ambos sexos en las 6-8 semanas de edad (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Estosratones debe ser alojado y mantenido en una instalación capaz de proporcionar condiciones libres de patógenos adecuados para los animales inmunodeficientes.
Preparar los ratones para la cirugía en una cámara de suministro de 5% (v / v) de inhalación de isoflurano en 1 L / min de oxígeno. Mantener la anestesia hasta que haya pérdida de la córnea y la punta reflejo en el animal (s). Para xenoinjerto subcutáneo, afeitarse una o más áreas pequeñas en el dorso del animal (s) y limpiar la piel con etanol al 70%. Para los xenoinjertos intrahepática, afeitar el tórax ventral y el abdomen del animal (s) de la axila hasta la región inguinal y limpiar la piel con etanol al 70%.
2.1 Implantación subcutánea de fragmentos de tumor
- Coloque el ratón anestesiado propensos, el mantenimiento de la anestesia por inhalación de isoflurano (2% (v / v) en 1 L / min de O 2) con una boquilla. Aplicar Tear-Gel para proteger los ojos del animal de una lesión traumática.
- Esterilizar el área afeitada dorsal (s) con Betadinelavado quirúrgico seguido de etanol al 70% y finalmente con solución de povidona yodada.
- Haga una incisión en la piel 5 mm usando unas tijeras afiladas estériles.
- Inserte una tijera romo cerrado suavemente en el espacio subcutáneo y extender suavemente para desarrollar un bolsillo lo suficientemente grande como para dar cabida a un fragmento de tumor.
- Inserte el fragmento de tumor preparada en el paso 1.3 en el bolsillo subcutáneo usando unas pinzas finas estériles.
- Cierre la incisión de la piel con suturas o grapas.
- Proporcionar cuidados postoperatorios para el ratón, como se describe a continuación.
2.2 La inyección subcutánea de células tumorales
- Preparar el animal tal como se describe en los pasos 2.1.1 y 2.1.2.
- Cargar la suspensión de células tumorales en Matrigel preparados en la etapa 1.13 en una jeringa de insulina con un 29 G 1/2 en la aguja.
- Insertar la aguja en el espacio subcutáneo y descargar el contenido de la jeringa. Avanzar la aguja varios milímetros a lo largo del plano subcutáneo de distancia from el sitio de la punción de la piel evita la fuga de la suspensión de células del tumor fuera de la zona de punción después de la retirada de la aguja.
- Proporcionar cuidados postoperatorios para el ratón, como se describe a continuación.
2.3 Implantación intrahepática de fragmentos de tumor
- El uso de un 27 G 1/2 en la aguja en una jeringa de 1 ml, administrar 350 l de estéril por vía subcutánea solución salina normal en el dorso del cuello del animal anestesiado para compensar las pérdidas de líquido intraoperatorias. Para la analgesia, administrar 350 l de solución salina estéril que contiene buprenorfina normal (0,1 mg / kg) por vía subcutánea en el flanco del animal, utilizando una aguja de 27 G en 1/2-in una jeringa de 1 ml.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla de calefacción con la nariz y la boca posicionado dentro de la boquilla para entregar el mantenimiento de anestesia por inhalación de isoflurano (2% (v / v) en 1 L / min de O 2).
- Extienda las extremidades y fijarlos con cinta a la superficie de operación para optimizar la exposición deel abdomen y el tórax ventral.
- Lleve a cabo el procedimiento bajo una lámpara de aumento para optimizar la visualización.
- Esterilizar la piel afeitada en la parte ventral del abdomen y el tórax con lavado quirúrgico Betadine seguido de etanol al 70% y finalmente con solución de povidona yodada.
- Usando unas tijeras afiladas estériles, hacer una incisión en la piel subcostal bilateral transversal y dividir las capas musculares para entrar en la cavidad peritoneal para permitir una exposición adecuada de todo el hígado.
- Coloque una puntada en la piel por encima de la apófisis xifoides y fijarlo a la boquilla con cinta adhesiva a fin de permitir una mejor exposición del hígado y de las estructuras circundantes.
- Utilice dos hisopos adyacentes y posterior al hígado para estabilizarlo.
- Hacer una incisión de 3 mm de longitud y la profundidad en la superficie del hígado utilizando una hoja de bisturí No. 10 estéril.
- Aplique inmediatamente Surgicel y leve presión sobre la zona de la incisión para lograr la hemostasia, retire después de 60-90 segundosy proceder solamente si la hemostasia completa se ha logrado.
- Coloque un fragmento del tumor paso 1.3 en la incisión del hígado con unas pinzas finas estériles o con una aguja de 18 G.
- Aplique una pequeña pieza de Surgicel sobre la incisión del hígado para evitar el desplazamiento del fragmento del tumor y asegurar la hemostasia continuado.
- Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas.
- Proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación
2.4 Implantación intrahepática de células tumorales a través inyección directa en el hígado
- Preparar el ratón como se describe en los Pasos 2.3.1 a 2.3.7 anteriores.
- Cargar la suspensión de células tumorales (preparado en la etapa 1.13) en una jeringa de insulina usando un 29 G 1/2 en la aguja.
- Con el hígado estabilizado utilizando un aplicador de punta de algodón, inserte la aguja de la jeringa de insulina en el hígado y avanzar en la punta unos milímetros más allá del sitio de la punción por un plano subcapsular.
- Descargar suavemente los contenidos de la jeringa y Tgallina retire la aguja del hígado.
- Lugar Surgicel sobre el sitio de la punción y aplique una presión suave con un aplicador con punta de algodón para evitar la fuga de la suspensión de células tumorales y para lograr la hemostasia completa.
- Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas y proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación.
2.5 xenotrasplante intrahepática de células tumorales a través de la inyección en el bazo
- Preparar el ratón como se describe en los pasos 2.3.1 y 2.3.5 anteriores.
- Con unas tijeras afiladas estériles, hacen un 1 cm incisión subcostal izquierda para entrar en la cavidad peritoneal.
- Utilice un aplicador con punta de algodón para reflejar el estómago craneal y hacia el lado derecho del animal con el fin de exponer el bazo.
- Por la manipulación de los tejidos adiposos de los alrededores con pinza atraumática finas estériles, entregar el bazo en la incisión y colocar un aplicador con punta de algodón detrás del bazo para estabilizarlo.
- El uso de sutura de seda 5-0, lugarun nudo flojo pre-atado alrededor del bazo por encima del polo inferior.
- Cargar la suspensión de células tumorales (preparado en la etapa 1.13) en una jeringa de insulina usando un 29 G 1/2 en la aguja.
- Inserte la aguja de la jeringa de insulina en el polo inferior del bazo y avanzar más allá del nivel del nudo pre-atado flojo.
- Se descargan lentamente el contenido de la jeringa, retire la aguja del bazo, y apretar el nudo para evitar cualquier fuga de la suspensión de células tumorales inyectadas.
- Vuelva a colocar el bazo en la cavidad peritoneal.
- Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas y proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación.
2.6 hepatectomía parcial para Facilitar intrahepática injerto de tejido tumoral humano
- Preparar el ratón como se describe en los pasos 2.3.1 al 2.3.7.
- Con unas tijeras afiladas estériles, se divide el ligamento falciforme unido al lóbulo medio del hígado.
- El uso de un aplicador con punta de algodón, movilizarel lóbulo izquierdo del hígado y la posición de un nudo flojo pre-atado de sutura de seda 5-0 alrededor del lóbulo izquierdo. Avanzar el nudo flojo tan cerca como sea posible hacia el pedículo bilio-vascular del lóbulo izquierdo y apriete el nudo.
- Extirpar el lóbulo izquierdo distal a la ligadura utilizando tijeras estériles, dejando un pequeño tocón para evitar el deslizamiento del nudo y posterior hemorragia.
- Usando una técnica similar, ligar y resecar la mayoría de la lóbulo medio del hígado, evitando la vesícula biliar.
- Uso Surgicel y una presión suave con un aplicador con punta de algodón a lo largo de las superficies de corte en el parénquima hepático para lograr la hemostasia completa.
- Para los xenoinjertos intrahepática de un fragmento de tumor o células tumorales, proceder con pasos 2.3.8 a 2.3.11 o 2.4.2 a 2.4.5 como se describe anteriormente.
- Para xenoinjertos intrahepática de las células tumorales a través de la inyección esplénica, utilizar bastoncillos de algodón para reflejar suavemente el estómago craneal y hacia el lado derecho del animal, exposión del bazo. Continúe con los pasos 2.5.4 al 2.5.9 como se describió anteriormente.
- Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas y proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación.
2.7 Cuidado Postoperatorio
- Retire el ratón desde la boquilla de anestesia inhalatoria.
- Coloque el ratón en una jaula bajo una lámpara de calor durante aproximadamente 20 min hasta que se recupere de la anestesia y la movilización totalmente.
- Repetir la dosis de buprenorfina cada 8-12 horas durante los primeros 2 a 3 días del postoperatorio.
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Representative Results
La Figura 3 muestra la apariencia típica de un xenoinjerto subcutáneo HCC humano y la correspondiente apariencia histopatológica del tumor. El desarrollo y el crecimiento de xenoinjertos subcutáneos pueden ser controlados fácilmente por examen diario de los ratones receptores. El intervalo de tiempo entre los xenoinjertos y el desarrollo de un tumor puede variar mucho dependiendo del tipo de tejido (fragmento de tumor vs suspensión de células), fuente de tejido (muestra primaria paciente, xenoinjerto mediante pasajes, o línea celular), y la cantidad de tejido implantado ( número de células o tamaño de fragmento de tumor). Por ejemplo, xenoinjertos considerables pueden desarrollarse a partir de la inyección de 5 x 10 6 células de una línea celular HCC bien establecida dentro de 1-2 semanas, mientras que 6 meses pueden ser necesarios para el desarrollo de un xenotrasplante similar de 1 x 10 5 células obtenidas a partir de una muestra primaria HCC paciente. No hemos observado la formación de xenotrasplante subcutáneo a más tardar 6 meses después de implantation de la muestra del tumor, y por lo tanto sacrificar los ratones receptores en este punto de tiempo si xenoinjertos no se han desarrollado.
La Figura 4 demuestra los aspectos típicos de intrahepáticos xenoinjertos de HCC humano obtenidos de la implantación directa del tejido del tumor en el hígado, así los obtenidos a partir de la inyección de las células tumorales en el bazo. Xenoinjertos intrahepáticos no se pueden detectar fácilmente mediante un examen físico general del ratón receptor a menos que el tumor es muy grande o se ha traducido en el desarrollo de ascitis o distensión abdominal. Aunque las pequeñas modalidades de imágenes de animales tales como el escaneo CT están disponibles en algunos institutos de investigación y podrían ser utilizados para interrogar con precisión el hígado de los ratones receptor 11, no consideramos este un enfoque ampliamente aplicable, práctico o rentable para la mayoría de los investigadores. Hemos observado que la velocidad a la que se desarrollan los xenoinjertos intrahepáticos es similar a la velocidad a la que Subcutaneonos xenoinjertos desarrollar, y es igualmente afectada por variables tales como el tipo, el origen y cantidad de tejido implantado. Con base en el desempeño de xenoinjertos subcutáneos derivados del mismo tejido progenitor que la utilizada para xenoinjertos intrahepática, seleccionamos un punto de tiempo para el sacrificio del ratón receptor y el examen del hígado menos que una clara evidencia de un tumor intrahepático grande está presente antes de esto. Hemos observado que la adición de una hepatectomía parcial con el procedimiento xenoinjertos intrahepática utilizado mejora la probabilidad de lograr el injerto de tejido de tumor humano en el hígado de ratón, pero no parece acelerar la tasa de crecimiento de xenoinjerto.
La Tabla 1 resume las tasas de injerto tumorales obtenidos tras la implantación de HCC tejidos humanos primarios en ratones inmunodeficientes utilizando las diferentes técnicas que se describen en este protocolo. Para cada método de la implantación, el denominador de la tasa de absorción del tumor refleja un zumbido único una muestra de HCC. Estos datos demuestran que, para los tejidos de HCC humano primarias, las tasas de injerto subcutáneo son inferiores a las tasas de injerto intrahepática obtenidos por inyección de células tumorales intraesplénica o intrahepática implantación fragmento de tumor, y que la hepatectomía parcial parece mejorar el injerto intrahepática. Aunque hemos utilizado con éxito la inyección directa de células en el hígado del ratón para generar los xenoinjertos intrahepáticas de las líneas consolidadas humanos HCC células (datos no presentados), no hemos generado ningún xenoinjertos intrahepáticos con este método utilizando muestras de HCC humanos primaria a pesar del uso de una hepatectomía parcial .
Figura 1. Descripción del esquema de protocolo que ilustra el flujo de trabajo para la elaboración y preparación de la muestra HCC, así como posteriores opciones xenoinjertos (recuadro).
544fig2.jpg "/>
Figura 2. Muestra de resección del hígado de un paciente con carcinoma hepatocelular. Este paciente no había recibido ninguna terapia adyuvante para el tumor. El cuadro blanco indica una parte viable del tumor cerca de la periferia, que se obtuvo de los xenoinjertos. La barra de escala en la parte superior derecha corresponde a 1 cm.
Figura 3. Hepatocelular humano de xenoinjerto de carcinoma de generada a partir de la inyección subcutánea de células tumorales. A) El tumor se puede apreciar fácilmente en el flanco derecho del animal. B) El tumor se ve que es distinto de los tejidos circundantes después de sacrificar el animal. C) La histología del tumor demuestra características típicas de carcinoma hepatocelular, incluyendo hepatocitos como las células con atipia nuclear y la relación nuclear a citoplásmica alta, ausencia de espacios porta y disttrabéculas orted con el aumento de espesor de las placas hepatocelulares. La barra de escala corresponde a 1 cm de los grupos A y B, y 100 micras en el panel C. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 4. Intrahepáticos xenoinjertos de carcinoma hepatocelular humano. Un xenoinjerto) generada a partir de la implantación de un fragmento de tumor humano en el hígado de ratón. Tumor intraparenquimatosa indicado por la flecha negro. Escala de la regla en la parte inferior de la fotografía en cm. B) xenoinjerto generado a partir de la inyección de células tumorales humanas en el bazo del ratón después de la hepatectomía parcial. Tumor intraparenquimatosa indicado por la flecha negro. La barra de escala corresponde a 1 cm. Sección C) Histología través margen de demonstrat xenotrasplante intrahepáticahaciendo que sus rasgos típicos de carcinoma hepatocelular humano (parte inferior derecha) y al lado de hígado de ratón normal (arriba a la izquierda). La barra de escala corresponde a 100 micras. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
| Implantación del sitio | Método de Implantación | Tumor Take Rate |
| subcutáneo | suspensión de células | 6/55 (10,9%) |
| fragmento de tumor | 23/136 (16,9%) | |
| bazo | suspensión de células | 3/15 (20%) * |
| suspensión celular + hepatectomía parcial | 6/14 (42,9%) * | |
| hígado | fragmento de tumor | 6/13 (46,2%) |
| fragmento de tumor + hepatectomía parcial 2/3 (66,7%) | ||
| suspensión de células | no se realiza | |
| suspensión celular + hepatectomía parcial | 0/8 (0%) | |
| * Proporción de muestras que arrojaron nódulos tumorales intrahepáticos | ||
Tabla 1. Tasas Humanos injerto de HCC en ratones inmunodeficientes correspondientes a diferentes técnicas de implantación.
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Discussion
Hemos descrito una variedad de técnicas para establecer subcutánea y intrahepáticos xenoinjertos de HCC humano en ratones inmunodeficientes que se pueden aplicar a una amplia variedad de preguntas experimentales y ensayos. Mientras xenoinjertos subcutáneos se han utilizado ampliamente para estudiar diversos aspectos de la biología de HCC, xenoinjertos intrahepáticos raramente se describen en la literatura. Además, la mayoría de los estudios que describen el uso de xenoinjertos han generado estos partir de líneas celulares bien establecidas. Dadas las limitaciones de las líneas de células de cáncer en el modelado de la biología del tumor humano 12, se nos ha motivado para validar las técnicas descritas anteriormente usando HCC tejidos humanos primarios. Aunque no es apoyada por el análisis estadístico debido a los pequeños tamaños de las muestras de los grupos experimentales, nuestras observaciones subjetivamente revelan una tendencia irresistible hacia la mejora de las tasas de injerto con la adición de una hepatectomía parcial a la implantación intrahepática de las células tumorales o fragmentos. </ P>
Los pocos estudios que rigurosamente han intentado utilizar tejidos primarios han logrado el injerto subcutáneo éxito con sólo una proporción muy pequeña de las muestras de los pacientes obtenidos 13-15. También hemos observado que la proporción de muestras de HCC humanos primaria que injertar con éxito en el espacio subcutáneo de ratones inmunodeficientes usando las técnicas descritas anteriormente se limita a aproximadamente 15%. En el hígado humano, lesiones HCC son hipervascular, que recibe su suministro de sangre predominantemente a través de la arteria hepática 16,17. Especulamos que la baja proporción de injertos de tejidos HCC primarios que nosotros y otros hemos observado puede ser el resultado de la vulnerabilidad de los tejidos HCC frescas a la hipoxia relativa del microambiente en el que su xenoinjertado, sin suministro arterial establecido. La susceptibilidad de los tejidos HCC a la rápida necrosis isquémica en el intervalo entre la resección quirúrgica y los xenoinjertos también puede Account para la tasa de injerto bajo logrado en ratones.
Para la generación de xenoinjertos de intrahepáticos de HCC humano a partir de suspensiones de células tumorales, se ha encontrado que la inyección de las células en el bazo es un enfoque técnicamente favorable que se traduce en tasas superiores de injerto de hígado a partir de muestras de HCC humanos primaria. El bazo es una estructura altamente vascularizado que puede apoyar mejor a células de HCC, en comparación con otros sitios en el cuerpo del ratón, y de la que las células tumorales parece viajar fácilmente en el hígado a través de las venas del bazo y del portal. En comparación con el parénquima hepático, en la que es técnicamente difícil de inyectar directamente las células sin fugas o hemorragia, el bazo tiene la capacidad estructural para acomodar el volumen de la suspensión celular que se inyecta, y se puede ligar fácilmente una vez que la inyección de células tumorales es completa. La inyección de suspensiones de células directamente en la vena portal o arteria hepática en ratones 6-8 semanas de edad no es técnicamente FEASible.
Hemos utilizado la hepatectomía parcial en ratones receptores para facilitar el injerto intrahepática del HCC tejidos humanos. Aunque los modelos de ratón de la hepatectomía parcial se han utilizado ampliamente para estudiar la biología de la regeneración del hígado 18, no tenemos conocimiento de ningún informe que describe en combinación con los xenotrasplantes de tumor intrahepático. Puesto que la regeneración del hígado se produce rápidamente dentro de los primeros varios días siguientes hepatectomía parcial, se especuló que el aumento de la expresión en gran medida de los estímulos mitogénicos y angiogénicos dentro del parénquima hepático sería mejor apoyar el injerto y la proliferación de tejido tumoral humano vulnerable o células implantadas dentro de la porción restante de el hígado de ratón, en comparación con un hígado de ratón en su estado "de descanso" 19. En los seres humanos, el mayor factor de riesgo para el desarrollo de HCC se hace avanzar la fibrosis o la cirrosis hepática, que se caracteriza por el desarrollo de desorganizado no regenerativadulos, y que ha sido conceptualizado por algunos como un estado de la lesión hepática crónica y regeneración 20. Las técnicas que hemos demostrado a injertarse HCC tejidos humanos en el hígado del ratón mediante la activación de la regeneración del hígado puede llegar a ser un valioso modelo para permitir la investigación sobre el papel del microentorno hepática y los mecanismos de regeneración del hígado en la fisiopatología de la HCC.
Mientras que las técnicas descritas en el presente documento son capaces de generar los xenoinjertos de HCC humano primarios de alta calidad en ratones inmunodeficientes, los investigadores que contemplan el uso de estos protocolos deben tener en cuenta algunas limitaciones del modelo. En primer lugar, nuestros protocolos incorporan un retraso mínimo entre la resección quirúrgica del tejido del paciente y su posterior procesamiento en el laboratorio, sin embargo, la consecución de altas tasas de injerto ha seguido siendo un reto; esto sugiere que la aplicación viable de estas técnicas requiere la proximidad del sitio de recogida de tejido del paciente a lalaboratorio, o de infraestructura que pueden reducir al mínimo los retrasos en la transferencia de muestras frescas. En segundo lugar, complejos procedimientos quirúrgicos intraabdominales en 6-8 semanas de edad ratones inmunodeficientes deben ser realizadas por personal con la formación adecuada para lograr la supervivencia de los animales durante varios meses antes de formar xenoinjertos; estos procedimientos y cuidado de los animales son posteriores tanto tiempo y muchos recursos. En tercer lugar, el desarrollo y la progresión de xenoinjertos intrahepáticas no pueden ser controlados fácilmente sin sacrificar los animales en puntos de tiempo predeterminados, lo que limita la utilidad de xenoinjertos en esta ubicación para algunos tipos de ensayos como se describe anteriormente. Además, xenoinjertos intrahepática derivados de la inyección de las células en el bazo pueden presentar en forma de múltiples nódulos dispersos por todo el parénquima hepático que son difíciles de cuantificar con precisión en términos de carga total del tumor. Finalmente, es importante señalar que los nódulos tumorales intrahepáticos resultantes de la inyección de las células en el bazo pueden seleccionarIvely reflejar subpoblaciones específicas de células que son capaces de la migración del bazo para la iniciación hígado y tumoral posterior.
Cuando la generación de xenoinjertos de tejidos HCC humano primarios, también es importante confirmar que los xenoinjertos resultantes se asemejan a HCC. Hemos demostrado anteriormente que los linfomas se puede desarrollar sin darse cuenta a partir de leucocitos de pasajeros dentro de los tejidos de HCC humano xenotransplantados 21. Por lo tanto agotamos rutinariamente leucocitos CD45 + humanas a partir de suspensiones de células tumorales primarias y utilizamos la RT-PCR, citometría de flujo, la evaluación histopatológica e inmunohistoquímica para ensayar xenoinjertos para las características típicas de HCC. Cuando pases xenoinjertos establecidos para otros estudios, las células murinas infiltrantes de tumor también deberá ser agotado utilizando un anticuerpo contra el antígeno de histocompatibilidad de ratón H2K. Si la aplicación de la investigación implica el uso de fragmentos de tumor o de la medición del crecimiento de xenoinjerto, el análisis de la xenografts en el punto final del estudio deben incluir una evaluación del grado en que los tumores están infiltrados por los leucocitos humanos y células de ratón.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de la Fase 1 premio Clínico Scientist (AG) de y una subvención de funcionamiento de la Sociedad de Investigación del Cáncer (AG). Los autores agradecen al Dr. John Dick por su apoyo a este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
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