Summary
Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.
Abstract
In vivo experimentele modellen van hepatocellulair carcinoom (HCC) dat de menselijke ziekte recapituleren een waardevol platform voor onderzoek naar de ziekte van pathofysiologie en voor de preklinische evaluatie van nieuwe therapieën. We presenteren verschillende methoden voor subcutane of orthotopisch menselijke HCC xenograften in immuundeficiënte muizen die kunnen worden gebruikt in diverse onderzoekstoepassingen genereren. Met een focus op het gebruik van primaire tumorweefsel van patiënten die chirurgische resectie als uitgangspunt beschrijven we de bereiding van celsuspensies of tumorfragmenten voor xenografting. We beschrijven specifieke technieken om deze weefsels i) subcutane xenograft, of ii) intrahepatisch, hetzij door directe implantatie van tumorcellen of fragmenten in de lever, of indirect door injectie van de cellen in de muis milt. We hebben het gebruik van partiële resectie van de natieve muizenlever beschrijven ook bij de xenografting als strategie ominduceren een staat van actieve lever regeneratie in de ontvanger muis die de intrahepatische innesteling van primaire menselijke tumorcellen kan vergemakkelijken. De verwachte resultaten van deze technieken worden geïllustreerd. De beschreven protocollen zijn gevalideerd met primaire menselijke HCC monsters en xenografts, die typisch minder krachtig dan de gevestigde humane HCC cellijnen die verspreid zijn en vaak aangehaald in de literatuur voeren. In vergelijking met cellijnen, bespreken we de factoren die kunnen bijdragen tot de relatief lage kans op primaire HCC innesteling in xenotransplantatie modellen en commentaar op technische problemen die de kinetiek van xeno-groei kan beïnvloeden. We stellen ook voor methoden die moeten worden toegepast om ervoor te zorgen dat xenograften verkregen nauwkeurig lijken ouder HCC weefsels.
Introduction
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de vijfde meest voorkomende kanker wereldwijd en de snelst toenemende oorzaak van overlijden door kanker in Noord-Amerika. De meest voorkomende risicofactor voor HCC is levercirrose, meest voorkomende door chronische virale hepatitis, alcoholmisbruik, auto-immuunziekte, of erfelijke metabole stoornissen 1.
Ondanks de zware lasten van ziekte HCC op populaties wereldwijd, is de pathofysiologie van HCC relatief slecht begrepen in vergelijking met andere gemeenschappelijke kanker, zoals colorectale, borst-of prostaatkanker. Bijvoorbeeld, specifieke moleculaire en cellulaire gebeurtenissen rijden tumorigenesis blijven duidelijk worden omschreven 2. Net als de meeste andere vaste epitheliale tumoren, hebben genomische benaderingen geopenbaard heterogeniteit in de afwijkingen in verband met HCC 3. Een aantal studies verstoorde activiteit van een verscheidenheid van signalerende wegen betrokken bij celproliferatie, sur geopenbaardVival, differentiatie, en angiogenese 4. Bovendien is de rol van kanker stamcellen in HCC pathobiology nog worden opgehelderd 5.
Met een beperkt begrip van HCC pathofysiologie, heeft het arsenaal van effectieve therapieën voor HCC ook relatief beperkt gebleven. Vroeg stadium patiënten met tumoren beperkt tot de lever zijn kandidaten voor curatieve therapie met tumor ablatie of chirurgische resectie, maar herhaling is gemeenschappelijk. Bij patiënten met gevorderde ziekte, chemotherapie en straling van beperkte werkzaamheid en worden voornamelijk gebruikt voor ziektebestrijding palliatieve intentie 6.
Hoge kwaliteit in vivo experimentele modellen van menselijke HCC bieden dus een waardevol platform voor veelgevraagde basisonderzoek naar de pathofysiologie van menselijke HCC en voor evaluatie van nieuwe therapeutische benaderingen. Vergeleken met het gebruik van cellijnen of zeer gedefinieerde muismodellen, xenografts van primary menselijke tumoren in immunodeficiënte muizen hebben ontpopt als waardevolle instrumenten voor dergelijke studies, omdat ze in staat zijn recapituleren de menselijke ziekte met hoge getrouwheid, terwijl ook het vastleggen van de heterogeniteit die aanwezig binnen en tussen verschillende patiënten 7,8 is zijn. Daartoe hebben we verschillende methoden menselijke HCC xenograften vaststellen immunodeficiënte muizen ontwikkelden. Terwijl de meerderheid van de gepubliceerde studies met HCC xenograften beschrijven het gebruik van gevestigde menselijke HCC cellijnen voor dit doel, hebben we ons gericht op het optimaliseren van onze analyses te xenograften uit primaire HCC specimens verkregen onmiddellijk na chirurgische resectie van patiënten te genereren.
Verschillende xenografting technieken kan nodig zijn voor verschillende wetenschappelijke toepassingen. Bijvoorbeeld, subcutane xenotransplantaten gegenereerd tumorfragmenten snel tot zijn gemakkelijk gevolgd, en meer geschikt voor plaatselijke toediening van nieuwe geneesmiddelen met handigmonitoring van de tumor respons. Intrahepatische xenotransplantaten belangrijker zijn voor studies met betrekking tot de rol van de lever micromilieu in HCC biologie. Xenotransplantaten gegenereerd uit tumorcellen suspensies nodig zijn voor de identificatie en karakterisatie van tumor-initiërende cel subsets of experimenten die in vitro manipulatie van tumorcellen voorafgaand aan xenotransplantatie. We hebben dus ontwikkeld en gevalideerd de volgende protocollen om subcutaan of intrahepatische xenograften vestigen van celsuspensies of tumor fragmenten afkomstig uit primaire menselijke HCC exemplaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een schematisch overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Verwerking van Human HCC Monsters
Verkrijgen primaire exemplaren menselijke HCC met schriftelijke toestemming van de patiënt en met de goedkeuring van het institutioneel onderzoek ethiek boord. Deze protocollen zijn aangebracht in onze instelling verricht met toestemming van de University Health Network Research Ethics Board in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn.
Verzamel verse exemplaren HCC zo spoedig mogelijk na de chirurgische procedure eenmaal de nodige monsters zijn genomen voor klinische doeleinden. Idealiter moet dit gebeuren binnen 30 minuten na het verwijderen van het weefsel van de patiënt. Zoals geïllustreerd in figuur 2, een monster van ten minste 1 cm 3 verkregen uit de periferie van de tumor optimaal, aangezien het centrale gedeelte van de tumor necrose zijn.Tumoren die geen behandeling gegeven voor resectie zoals bestraling, chemotherapie of ablatie voorkeur om de kans dat tumorcellen levensvatbaar maximaliseren. Handvat primaire menselijke weefsels in overeenstemming met de standaard persoonlijke beschermingsmiddelen protocollen voor biologisch gevaarlijk materiaal. Voer alle laboratorium manipulaties van de tumor weefsels en cellen voorbereidingen in een klasse II bioveiligheid kast met behulp van aseptische technieken.
- Leg de verse HCC monster in 10-25 ml serum-vrij Modified F12 Eagle Medium / Ham 's Dulbecco bij 4 ° C en breng op ijs naar het laboratorium voor onmiddellijke verwerking en bereiding van weefsel fragmenten en / of cellen voor xenografting in muizen.
- Met behulp van een steriel pincet, plaatst de tumor monster in een 100 mm x 20 mm petrischaal of een andere geschikte steriele werkvlak. Verdeel de tumormonster in fragmenten van ongeveer 2-3 mm 3 met een No.10 chirurgisch scalpel. Op dit punt, overweeg dan snap-freezing of formaline vaststelling some tumorfragmenten voor andere experimenten of analyses zoals vereist.
- Voor xenografting van tumorfragmenten, plaats enkele van de HCC fragmenten in een of meer microcentrifuge buisjes met Matrigel genoeg om de fragmenten ondergedompeld blijven. Houd deze buizen op ijs.
- Voor de bereiding van een tumorcel suspensie Gebruik de chirurgische scalpel om gehakt de resterende HCC weefsel zoveel mogelijk en meng met 5-10 ml DMEM-F12 in een 50 ml conische buis afhankelijk van het volume van het gehakt weefsel.
- Voeg collagenase type IV en dispase II bij de definitieve concentraties van 200 eenheden / ml en 0,8 eenheden / ml. Pipet het mengsel op en neer en met een pipet 25 ml.
- Sluit de buis en incubeer het mengsel van stap 1,6 bij 37 ° C in een 5% kooldioxide incubator gedurende 30-60 minuten afhankelijk van de zachtheid van het tumorweefsel. Pipetteer de oplossing op en neer een paar keer per 10 minuten om de voortgang van de enzymatische digestie te beoordelen.
- Na diBeheersmaatschappij is voltooid, gaan de tumor oplossing door een 100 um cel zeef. Voorzichtig mash restmateriaal op de cel zeef met behulp van een 25 ml pipet tip om het maximum aantal tumorcellen in staat te passeren. Verzamel de gespannen celsuspensie in een 15 ml conische buis.
- Centrifugeer de tumorcel suspensie bij 1200 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Voorzichtig giet het supernatant. Afhankelijk van de grootte van de korrel, voeg 2,5 ml ijskoude 1x rode bloedcellen (RBC) lysis buffer en voorzichtig pipet op en neer om de pellet te resuspenderen. Blijf op ijs gedurende 5 minuten.
- Add DMEM-F12 tot een totaal volume van 15 ml en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C te wassen RBC lysis buffer.
- Voorzichtig decanteren en resuspendeer de RBC-vrije tumorcel pellet in DMEM-F12.
- Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw exclusie handmatig of met een geautomatiseerde celteller.
- Centrifuge tumorcel fracties die het gewenste number cellen voor injectie zoals hierboven beschreven, resuspendeer de verkregen celpellet in 30 ul ijskoude Matrigel en bewaar op ijs.
Optioneel: Na stap 1.11, we regelmatig afbrekende menselijke CD45 + cellen (leukocyten) van de bulk tumorcel schorsing en / of zuiveren subsets van tumorcellen met flowcytometrie of immunomagnetische kralen. Gedetailleerde protocollen voor deze technieken zijn goed beschreven door de fabrikanten van de relevante antilichamen, kralen en flowcytometers.
Opmerking: De hierboven beschreven protocol kan worden gebruikt om menselijke tumor xenotransplantaten geoogst uit muizen om seriële transplantatie voeren verwerken, vervangende xenograft weefsel voor de primaire menselijke HCC weefsel in stap 1.1. In deze situatie na stap 1.11, we routinematig afbrekende infiltrerende muizencellen van de celsuspensie met een antilichaam tegen muizen histocompatibility antigen H2k.
2.Xenografting
Voeren alle dierlijke procedures in overeenstemming met protocollen door de institutionele dier zorg commissie goedgekeurd. De hierin beschreven procedures zijn afgerond onder een specifieke dierproeven protocol door de University Health Network Animal Care Comite in overeenstemming en de naleving van alle relevante wettelijke en institutionele organisaties, voorschriften en richtlijnen goedgekeurd.
Apparatuur voor de levering van inhalatie-vluchtige anesthetica voor kleine dieren moeten worden gebruikt volgens de standaard operationele procedures van het dier faciliteit en onderzoeksinstituut. Voer alle chirurgische ingrepen onder aseptische omstandigheden en steriele instrumenten in een klasse II bioveiligheid kast. Gebruik maken van niet-obese diabetische ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD / SCID) of NOD / SCID / interleukine 2 receptor gammaketen null (NSG) stammen van muizen van beide geslachten bij 6-8 weken oud (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Dezemuizen moeten worden gehuisvest en in een inrichting die in staat is pathogeenvrije omstandigheden die geschikt zijn voor immunodeficiënte dieren.
Bereid muizen voor chirurgie in een kamer toevoeren 5% (v / v) ingeademd isofluraan in 1 L / min zuurstof. Handhaaf anesthesie totdat er verdwijnen van de cornea en teen reflex in het dier (en). Voor subcutane xenografting, scheren een of meer kleine gebieden op het dorsale gedeelte van de dier (en) en reinigen van de huid met 70% ethanol. Voor intrahepatische xenografting, scheren de ventrale thorax en de buik van het dier (en) uit de oksels tot aan de liesstreek en reinigen van de huid met 70% ethanol.
2.1 onderhuidse inplantingen van tumorfragmenten
- Plaats de verdoofde muis gevoelig handhaven inhalatie isofluraan anesthesie (2% (v / v) in 1 L / min O 2) met een mondstuk. Solliciteer Tear-Gel voor de ogen van het dier te beschermen tegen ernstige verwondingen.
- Steriliseer de dorsale geschoren gebied (en) met Betadinechirurgische scrub gevolgd door 70% ethanol en tenslotte met povidonjood oplossing.
- Maak een 5 mm incisie in de huid met behulp van steriele scherpe schaar.
- Plaats een gesloten stompe schaar voorzichtig in de subcutane ruimte en verspreid zachtjes een zak groot genoeg om een tumor fragment tegemoet te ontwikkelen.
- Plaats de tumor fragment bereid in stap 1.3 in de subcutane pocket met steriele fijne pincet.
- Sluit de incisie in de huid met behulp van hechtingen of clips.
- Zorg postoperatieve zorg aan de muis zoals hieronder beschreven.
2.2 Subcutane injectie van tumorcellen
- Bereid het dier zoals beschreven in stap 2.1.1 en 2.1.2.
- Laad de schorsing van tumorcellen in Matrigel bereid in stap 1.13 in een insuline spuit met een 29 G 1/2 in de naald.
- Steek de naald in de subcutane ruimte en afvoer van de inhoud van de injectiespuit. Het bevorderen van de naald enkele millimeters langs de onderhuidse vliegtuig weg frOM de huid prikplaats voorkomt lekkage van de tumor celsuspensie uit de prikplaats bij het terugtrekken van de naald.
- Zorg postoperatieve zorg aan de muis zoals hieronder beschreven.
2.3 Intrahepatic Implantatie van tumorfragmenten
- Met behulp van een 27 G 1/2 in naald op een spuit 1 ml, toedienen 350 ul van steriele fysiologische zoutoplossing subcutaan in het dorsale gedeelte van de hals van het verdoofde dier om te compenseren voor intraoperatieve vochtverlies. Voor analgesie toedienen 350 pi steriele fysiologische zoutoplossing met buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan op flank van het dier, met een 27 G naald 1/2-in op een 1 ml spuit.
- Plaats de muis in rugligging op een voorverwarmde pad met de neus en mond aan de binnenkant van het mondstuk om onderhoud te leveren inhalatie isofluraananesthesie (2% (v / v) in 1 L / min O 2).
- Verleng de ledematen en zet ze vast met tape om het besturingssysteem oppervlak om de blootstelling van het optimaliserenhet ventrale abdomen en thorax.
- Voer de procedure uit onder een vergrootglas lamp visualisatie te optimaliseren.
- Steriliseer de geschoren huid op de ventrale abdomen en thorax met Betadine chirurgische scrub, gevolgd door 70% ethanol en tenslotte met povidonjood oplossing.
- Met behulp van steriele scherpe schaar, maak een dwarse bilaterale subcostal huidincisie en verdeel de spieren lagen om de buikholte te voeren om een adequate blootstelling van de gehele lever mogelijk te maken.
- Plaats een steek in de huid boven de zwaardvormig proces en zet hem aan het mondstuk met tape om een betere belichting van de lever en de omliggende structuren mogelijk te maken.
- Gebruik twee wattenstaafje applicators grenst en posterior naar de lever om het te stabiliseren.
- Een insnijding 3 mm in lengte en diepte op het oppervlak van de lever met een steriele scalpel nr. 10.
- Onmiddellijk van toepassing Surgicel en zachte druk om de incisie site om hemostase te bereiken; verwijderen na 60-90 secen ga alleen als volledige hemostase is bereikt.
- Plaats een tumor fragment stap 1.3 in de lever incisie met steriele fijn pincet of met een 18 G naald.
- Breng een klein stukje van Surgicel over de lever incisie om verplaatsing van de tumor fragment te voorkomen en te zorgen voor de voortdurende hemostase.
- Sluit de incisie met hechtingen of klemmen.
- Geef postoperatieve zorg zoals hieronder beschreven
2.4 Intrahepatic Implantatie van tumorcellen via directe injectie in de lever
- Bereid de muis, zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.7 hierboven.
- Laad de tumorcel suspensie (bereid in stap 1.13) in een insulinespuit met een 29 G 1/2 in de naald.
- Met de lever gestabiliseerd met behulp van een katoenen-applicator, steek de insuline spuit naald in de lever en vooraf de punt een paar millimeter boven de prikplaats aan een subcapsulaire vliegtuig.
- Voorzichtig ontladen van de inhoud van de spuit en tkip kan de naald uit de lever.
- Plaats Surgicel over de prikplaats en druk zachtjes met een wattenstaafje om lekkage van de tumorcel schorsing te voorkomen en om volledige hemostase van toepassing.
- Sluit de incisie met hechtingen of klemmen en geven postoperatieve zorg zoals hieronder beschreven.
2.5 Intrahepatic Xenografting van tumorcellen via injectie in de milt
- Bereid de muis, zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.5 hierboven.
- Met behulp van steriele scherpe schaar, maak een 1 cm links subcostal incisie om de buikholte te voeren.
- Gebruik een wattenstaafje de maag craniaal en rechterzijde van het dier teneinde de milt bloot te geven.
- Door het hanteren van de omliggende vetweefsel met steriele dunne atraumatische pincet, leveren de milt in de incisie en plaats een wattenstaafje achter de milt te stabiliseren.
- Met behulp van een 5-0 zijden hechtdraad, plaatseen losse pre-gebonden knoop rond de milt boven de onderste paal.
- Laad de tumorcel suspensie (bereid in stap 1.13) in een insulinespuit met een 29 G 1/2 naald.
- Steek de insulinespuit naald in de onderste pool van de milt en vooraf het verleden het niveau van de losse pre-gebonden knoop.
- Langzaam ontladen van de inhoud van de spuit, de naald uit de milt, en draai de knoop om lekkage van de geïnjecteerde tumorcel schorsing te voorkomen.
- Plaats de milt in de peritoneale holte.
- Sluit de incisie met hechtingen of klemmen en geven postoperatieve zorg zoals hieronder beschreven.
2.6 Gedeeltelijke hepatectomy te faciliteren Intrahepatic Engraftment van Human tumorweefsel
- Bereid de muis, zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.7.
- Met steriele scherpe schaar, verdeel de falciform ligament verbonden aan de mediaan kwab van de lever.
- Met behulp van een wattenstaafje, mobiliserende linker kwab van de lever en de positie van een losse pre-gebonden knoop van 5-0 zijden hechtdraad rond de linker kwab. Vooraf de losse knot zo dicht mogelijk naar de bilio-vaatsteel van de linker kwab en draai de knoop.
- Accijnzen de linker kwab distaal van de ligatuur met steriele schaar, waardoor een kleine stomp om slippen van de knoop en de daaropvolgende bloeding te voorkomen.
- Met een soortgelijke techniek, afbinden en resect de meeste mediaan kwab van de lever, de galblaas vermijden.
- Gebruik Surgicel en druk zachtjes met een wattenstaafje langs de snijvlakken van de leverparenchym om volledige hemostase.
- Voor intrahepatische xenografting van een tumor fragment of tumorcellen, verder met de stappen 2.3.8 tot 2.3.11 en 2.4.2 tot 2.4.5 zoals hierboven beschreven.
- Voor intrahepatische xenografting van tumorcellen via milt injectie, gebruik maken wattenstaafje applicators om voorzichtig weerspiegelen de maag craniaal en rechterzijde van het dier, exposing de milt. Ga verder met stappen 2.5.4 tot 2.5.9 zoals hierboven beschreven.
- Sluit de incisie met hechtingen of klemmen en geven postoperatieve zorg zoals hieronder beschreven.
2.7 postoperatieve zorg
- Verwijder de muis uit de inhalatie-anaesthesie mondstuk.
- Plaats de muis in een kooi onder een warmtelamp voor ongeveer 20 minuten totdat hersteld van anesthesie en volledig mobiliseren.
- Herhaal de buprenorfine dosis elke 8-12 uur gedurende het eerste postoperatieve dagen 2-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont het typische uiterlijk van een subcutane menselijke HCC xenograft en de overeenkomstige histopathologische verschijnen van de tumor. De ontwikkeling en groei van subcutane xenografts kan gemakkelijk gevolgd worden door dagelijkse behandeling van ontvangende muizen. Het tijdsinterval tussen xenografting en ontwikkeling van een tumor kan sterk variëren afhankelijk van het type weefsel (tumor fragment versus celsuspensie), bron van weefsel (primaire bloedmonster, passage xenograft of cellijn), en hoeveelheid weefsel geïmplanteerd ( aantal cellen of de omvang van de tumor fragment). Bijvoorbeeld kan aanzienlijke xenotransplantaten ontstaan uit de injectie van 5 x 10 6 cellen van een gevestigde HCC cellijn in 1-2 weken, terwijl 6 maanden kan nodig zijn voor de ontwikkeling van soortgelijke xenograft van 1 x 10 5 cellen verkregen van een primaire patiënt HCC monster. We hebben niet subcutane xenograft formatie later waargenomen dan 6 maanden na implantation van de tumor steekproef, en dus offeren ontvangende muizen op dit tijdpunt als xenograften niet hebben ontwikkeld.
Figuur 4 toont de typische verschijnselen van intrahepatische menselijke HCC xenograften behaald uit directe implantatie van tumorweefsel in de lever en die verkregen door injectie van tumorcellen in de milt. Intrahepatische xenotransplantaten kunnen niet gemakkelijk worden gedetecteerd door algemeen lichamelijk onderzoek van de ontvanger muis tenzij de tumor zeer groot of heeft geleid tot de ontwikkeling van ascites of abdominale distensie. Hoewel klein dier beeldvormende technieken zoals CT-scan zijn verkrijgbaar bij een aantal onderzoeksinstituten en kunnen worden gebruikt om nauwkeurig te ondervragen de lever van ontvangende muizen 11, doen we dit niet een breed toepasbaar, praktisch, of kosteneffectieve aanpak voor de meeste onderzoekers beschouwen. We hebben vastgesteld dat de snelheid waarmee intrahepatische xenotransplantaten ontwikkelen is vergelijkbaar met de snelheid waarmee subcutaneoons xenotransplantaten ontwikkelen en wordt eveneens beïnvloed door variabelen, zoals het soort, de bron en de hoeveelheid weefsel geïmplanteerd. Gebaseerd op de prestaties van het onderhuidse xenograften afgeleid van dezelfde ouder weefsel als die voor intrahepatische xenograften, selecteren we een meetpunt voor offer van de ontvanger muis en het onderzoek van de lever, tenzij duidelijk bewijs van een grote intrahepatische tumor aanwezig voordat deze is. We hebben waargenomen dat de toevoeging van een partiële hepatectomie de intrahepatische xenografting procedure gebruikt verbetert de kans op het bereiken enting van humane tumor weefsel in de muizenlever, maar lijkt niet de snelheid van xenograft groei te versnellen.
Tabel 1 vat de tumor innesteling tarieven bereikt na implantatie van primaire menselijke HCC weefsels in immunodeficiënte muizen met behulp van de verschillende technieken beschreven in dit protocol. Voor elke implantatie methode, de noemer van de tumor nemen koers weerspiegelt een unieke brom een HCC monster. Deze gegevens tonen aan dat voor primaire menselijke HCC weefsels, subcutane implantatie tarieven zijn inferieur aan de tarieven van intrahepatische engraftment bereikt milt tumorcel injectie of intrahepatische tumor fragment implantatie, en dat gedeeltelijke hepatectomie lijkt intrahepatische engraftment verbeteren. Hoewel we met succes hebben gebruikt directe cel injectie in de muizenlever intrahepatische xenotransplantaten genereren uit gevestigde humane HCC cellijnen (gegevens niet getoond), hebben wij gegenereerd elke intrahepatische xenotransplantaten deze werkwijze gebruikmakend van primaire humane HCC monsters ondanks het gebruik van partiële hepatectomie .
Figuur 1. Schematisch overzicht van protocol illustreren workflow voor de verwerking en bereiding van HCC monster net als de daaropvolgende xenografting opties (inzet).
544fig2.jpg "/>
Figuur 2. Leverresectie monster van een patiënt met hepatocellulair carcinoom. Deze patiënt was is geen aanvullende behandeling van de tumor. De witte doos geeft een levensvatbare deel van de tumor in de buurt van de periferie, die werd verkregen voor xenografting. Schaalbalk rechtsboven komt overeen met 1 cm.
Figuur 3. Menselijke hepatocellulaire carcinoom xenograft gegenereerd uit de subcutane injectie van tumorcellen. A) De tumor zal duidelijk zijn aan de rechterflank van het dier. B) De tumor wordt gezien onderscheiden van het omringende weefsel na het opofferen van het dier. C) de histologie van de tumor toont typische kenmerken van leverkanker, waaronder hepatocyt-achtige cellen met nucleaire atypie en hoog nucleaire-to-cytoplasma-ratio, het ontbreken van portal traktaten, en distorted trabeculae met verhoogde dikte van hepatocellulaire platen. Schaal balk komt overeen met 1 cm in de panelen A en B, en 100 micrometer op paneel C. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Intrahepatische menselijke hepatocellulaire carcinoom xenotransplantaten. A) xenograft gegenereerd door implantatie van een humane tumor fragment in muizenlever. Intraparenchymateuze tumor aangegeven met zwarte pijl. Omvang van liniaal onderaan foto in cm. B) xenograft gegenereerd door injectie van menselijke tumorcellen in de muis milt na gedeeltelijke hepatectomie. Intraparenchymateuze tumor aangegeven met zwarte pijl. Schaal balk komt overeen met 1 cm. C) Histologie doorsnede door marge van intrahepatische xeno DEMONSTRATing typische kenmerken van de menselijke hepatocellulair carcinoom (rechtsonder) en aangrenzende normale muis lever (linksboven). Schaal balk komt overeen met 100 pm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Implantatie Site | Implantatie Methode | Tumor Take Rate |
| subcutane | cel schorsing | 6/55 (10.9%) |
| tumor fragment | 23/136 (16,9%) | |
| milt | celsuspensie | 3/15 (20%) * |
| celsuspensie + gedeeltelijke hepatectomy | 6/14 (42.9%) * | |
| lever | tumor fragment | 6/13 (46,2%) |
| tumor fragment + gedeeltelijke hepatectomy 2/3 (66.7%) | ||
| celsuspensie | niet uitgevoerd | |
| celsuspensie + gedeeltelijke hepatectomy | 0/8 (0%) | |
| * Gedeelte van de monsters dat intrahepatische tumoren opgeleverd | ||
Tabel 1. Human HCC innesteling tarieven in immunodeficiënte muizen die overeenkomen met verschillende implantatie technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben verschillende technieken beschreven subcutane en intrahepatische menselijke HCC xenograften vaststellen immunodeficiënte muizen die kan worden toegepast op een grote verscheidenheid van experimentele vragen en assays. Terwijl subcutane xenotransplantaten zijn op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten van HCC studie biologie worden intrahepatische xenotransplantaten zelden in de literatuur beschreven. Verder is de meeste studies die het gebruik van xenotransplantaten zijn gegenereerd uit deze gevestigde cellijnen. Gezien de beperkingen van kanker cellijnen in het modelleren van de menselijke tumor biologie 12, zijn we gemotiveerd om het bovenstaande met behulp van primaire menselijke HCC weefsels beschreven technieken te valideren. Hoewel door statistische analyse niet ondersteund vanwege de kleine steekproeven van de experimentele groepen, onze waarnemingen subjectief blijkt dat er een dwingende trend naar verbeterde innesteling tarieven met de toevoeging van een gedeeltelijke hepatectomie de intrahepatische implantatie van tumorcellen of fragmenten. </ P>
De weinige studies die rigoureus hebben geprobeerd om de primaire weefsels te gebruiken zijn succesvol subcutane implantatie bereikt met slechts een zeer klein deel van de patiënt monsters verkregen 13-15. We hebben ook waargenomen dat het percentage primaire menselijke HCC monsters die met succes engraft in de subcutane ruimte van immunodeficiënte muizen volgens de hierboven beschreven technieken is beperkt tot ongeveer 15%. In de menselijke lever, HCC laesies zijn hypervasculaire, overwegend ontvangst van hun bloedtoevoer via de leverslagader 16,17. We speculeren dat het lage percentage enting primaire HCC weefsels die wij en anderen hebben waargenomen resultaat van de kwetsbaarheid van verse HCC weefsels naar de relatieve hypoxie van de micro waarin zij xenotransplantatie, zonder een eigen arteriën zijn. De gevoeligheid van HCC weefsels snelle ischemische necrose in het interval tussen chirurgische resectie en xenografting ook ACCOUnt voor de lage innesteling tarief bereikt bij muizen.
Voor het genereren van intrahepatische menselijke HCC xenograften van tumorcellen suspensies hebben wij gevonden dat de injectie van cellen in de milt een technisch gunstig aanpak die resulteert in hogere tarieven lever enting van primaire humane HCC monsters. De milt is een zeer gevasculariseerde structuur die beter kunnen ondersteunen HCC cellen in vergelijking met andere plaatsen in het lichaam muis en waaruit tumorcellen blijken gemakkelijk reizen naar de lever via de milt en portal aderen. In vergelijking met de lever parenchym, waarin het technisch moeilijk direct cellen inbrengen zonder lekkage of bloeding, de milt heeft de structurele capaciteit om het volume van de celsuspensie geïnjecteerd wordt tegemoet, en kan gemakkelijk worden geligeerd na de tumorcel injectie voltooid. Injectie van celsuspensies direct in de poortader en leverslagader in 6-8 weken oude muizen technisch niet feasbaar.
We hebben gedeeltelijke hepatectomy gebruikt in de ontvangende muizen om intrahepatische innesteling van menselijke HCC weefsels te vergemakkelijken. Hoewel muismodellen van gedeeltelijke hepatectomy zijn op grote schaal gebruikt om de biologie van de lever regeneratie 18 bestuderen, we zijn niet op de hoogte van alle rapporten beschrijven in combinatie met intrahepatische tumor xenotransplantatie. Aangezien leverregeneratie treedt snel op binnen de eerste paar dagen na gedeeltelijke hepatectomie, speculeerden wij dat de sterk verhoogde expressie van mitogene en angiogene stimuli in het leverparenchym beter ondersteunen innesteling en proliferatie van kwetsbare menselijk tumorweefsel of cellen geïmplanteerd in het resterende gedeelte van de muizenlever in vergelijking met een muizenlever in zijn "rust" toestand 19. Bij mensen wordt het grootste risicofactor voor HCC ontwikkeling geavanceerd leverfibrose en cirrose, die wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van ongeorganiseerd regeneratieve geenDules, en dat is opgevat door sommigen als een toestand van chronische leverschade en regeneratie 20. De technieken die we hebben aangetoond dat menselijke HCC weefsels enten in de muis lever door activering leverregeneratie kan blijken een waardevol model voor onderzoek naar de functie van de lever en de lever regeneratieve micro mechanismen in de pathofysiologie van HCC toelaten.
Hoewel de hierin beschreven technieken kunnen genereren hoogwaardige primaire humane HCC xenograften in immunodeficiënte muizen moeten onderzoekers overwegen het gebruik van deze protocollen overwegen enkele beperkingen van het model. Allereerst onze protocollen bevatten minimale vertraging tussen de chirurgische resectie van patiëntenweefsel en de latere verwerking in het laboratorium, maar bereiken hoge engraftment tarieven een uitdaging gebleven, hetgeen suggereert dat levensvatbare uitvoering van deze technieken vereist nabijheid van de patiënt weefsel verzamelplaats voor delaboratorium, of infrastructuur dat de vertragingen bij de overdracht van verse exemplaren kunnen minimaliseren. Ten tweede moet complexe intra-abdominale chirurgische ingrepen op 6-8 weken oude immunodeficiënte muizen worden uitgevoerd door speciaal opgeleid personeel om de overleving van de dieren te bereiken voor een aantal maanden voordat xenograften vormen; deze procedures en de daaropvolgende verzorging van dieren zijn zowel tijd en middelen kost. Ten derde, de ontwikkeling en progressie van intrahepatische xenotransplantaten kunnen niet gemakkelijk worden gecontroleerd zonder dat dieren op vooraf bepaalde tijdstippen, waardoor het nut van xenotransplantaten in deze locatie voor sommige assays zoals hierboven beschreven. Daarnaast kan intrahepatische xenotransplantaten verkregen door injectie van cellen in de milt als meerdere knobbeltjes verspreid over het leverparenchym moeilijk precies te bepalen in de totale tumorlast zijn aanwezig. Tenslotte is het belangrijk op te merken dat intrahepatische tumornoduli gevolg van de injectie van cellen in de milt selecterentend weerspiegelen specifieke subpopulaties van cellen die in staat zijn van de migratie van de milt naar de lever en de daaropvolgende tumorinitiatie zijn.
Bij het genereren van xenotransplantaten van primaire humane HCC weefsels, is het ook belangrijk om te bevestigen dat de verkregen xenotransplantaten lijken HCC. We hebben eerder aangetoond dat lymfomen onbedoeld kunnen ontwikkelen van personenauto leukocyten binnen xenotransplanted menselijke HCC weefsels 21. Wij dus regelmatig afbrekende menselijke CD45 + leukocyten uit primaire tumor cel suspensies en gebruik maken van RT-PCR, flowcytometrie, histopathologische beoordeling, en immunohistochemie om xenograften testen op typische kenmerken van HCC. Wanneer doorkweken vastgesteld xenotransplantaten voor verdere studies moet tumor infiltrerende muizencellen worden uitgeput gebruikmaking van een antilichaam tegen muis histocompatibility antigen H2k. Indien de onderzoeksaanvraag omvat het gebruik van tumor fragmenten of het meten van xenograft groei, analyse van de xenografts bij de studieeindpunt moet ook een beoordeling van de mate waarin de tumoren worden geïnfiltreerd door humane leukocyten en muis cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Canadese Institutes of Health Research Fase 1 Werker-Scientist Award (AG) en een exploitatiesubsidie van de Research Society Cancer (AG). De auteurs zijn dank aan dr. John Dick voor zijn ondersteuning van dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
