Summary
Menneskelige tumorxenoplantater i immunsvækkede mus er værdifulde værktøjer til at studere kræft biologi. Særlige protokoller til at generere subkutane og intrahepatiske xenotransplantater fra humane levercellecancer celler eller tumor fragmenter er beskrevet. Lever regenerering fremkaldt ved delvis hepatektomi i recipientmus præsenteres som en strategi for at lette intrahepatisk engraftment.
Abstract
In vivo eksperimentelle modeller for hepatocellulært carcinom (HCC), som rekapitulere sygdom hos mennesker giver en værdifuld platform for forskning i sygdom patofysiologi og for den prækliniske evaluering af nye behandlingsformer. Vi præsenterer en række forskellige metoder til at generere subkutan eller ortotopisk human HCC xenotransplantater i immundefekte mus, som kunne anvendes i en række forsknings-programmer. Med fokus på brugen af primær tumor væv fra patienter, der gennemgår kirurgisk resektion som udgangspunkt beskriver vi udarbejdelsen af celle suspensioner eller tumorfragmenter for xenografting. Vi beskriver specifikke teknikker til xenotransplantat disse væv i) subkutant, eller ii) i leveren, enten ved direkte implantation af tumorceller eller fragmenter i leveren, eller indirekte ved injektion af celler i musemilt. Vi beskriver også anvendelsen af en delvis fjernelse af det native muselever på tidspunktet for xenografting som en strategi tilfremkalde en tilstand af aktiv leverregenerering i modtagerens mus, der kan gøre det lettere intrahepatisk transplantation af primære humane tumorceller. De forventede resultater af disse teknikker er illustreret. De beskrevne protokoller er blevet valideret ved hjælp af primære humane HCC prøver og implanteret, som typisk udfører mindre håndfast end de veletablerede humane HCC-cellelinier, der bruges meget og ofte citeret i litteraturen. I sammenligning med cellelinjer, vi diskuterer faktorer, der kan bidrage til den relativt lille chance for primær HCC transplantation i xenotransplantation modeller og kommentere de tekniske problemer, der kan have indflydelse på kinetikken af xenograft vækst. Vi foreslår også, der bør anvendes for at sikre, at xenografter opnået nøjagtigt ligne forælder HCC væv.
Introduction
Hepatocellulært carcinom (HCC) er den femte mest almindelige kræftform på verdensplan og den mest hastigt stigende årsag til kræft død i Nordamerika. Den mest udbredte risikofaktor for HCC er skrumpelever, hyppigst forekommende på grund af kronisk viral hepatitis, alkohol misbrug, autoimmun sygdom, eller arvelige stofskiftesygdomme 1.
På trods af den sygdomsbyrde tung pålagt af HCC på befolkningen i hele verden, er patofysiologien af HCC relativt dårligt forstået i forhold til andre almindelige kræftformer såsom tyktarms-, bryst-eller prostatakræft. For eksempel specifikke molekylære og cellulære begivenheder kørsel tumorigenesis fortsat være klart definerede 2. Ligesom de fleste andre faste epitelial kræft, har genomforskningsmetoder afsløret heterogenitet i afvigelser forbundet med HCC 3. En række undersøgelser har vist, uorganiseret aktivitet af en række signalveje, der er involveret i celleproliferation, surlevelse, differentiering og angiogenese 4.. Hertil kommer, at rollen som kræft stamceller i HCC Patobiologi stadig at blive afklaret 5..
Med et begrænset forståelse af HCC patofysiologi har armamentarium af effektive behandlinger for HCC også været relativt begrænset. Debuterende patienter med tumorer begrænset til leveren er kandidater til kurativ behandling med tumor ablation eller kirurgisk resektion, selvom gentagelse er fælles. For patienter med mere fremskreden sygdom, kemoterapi og stråling er af begrænset effekt og bruges primært til sygdomsbekæmpelse med palliativ hensigt 6.
Høj kvalitet in vivo eksperimentelle modeller for menneskelig HCC giver således en værdifuld platform for meget nødvendige grundforskning i patofysiologien af menneskelige HCC samt for vurdering af nye terapeutiske tilgange. Sammenlignet med anvendelse af cellelinier eller veldefinerede musemodeller xenotransplantater af PRImary humane tumorer i immunsvækkede mus har vist sig som et værdifuldt værktøj til disse undersøgelser, da de er i stand til opridset den humane sygdom med high fidelity samtidig indfange heterogenitet, der er til stede inden for og mellem forskellige patienter 7,8. Til dette formål har vi udviklet en række forskellige metoder til at etablere menneskelige HCC implanteret i immunsvækkede mus. Mens størstedelen af offentliggjorte undersøgelser med HCC implanteret beskrive brugen af veletablerede humane HCC-cellelinier til dette formål, har vi fokuseret på at optimere vores analyser til at generere implanteret fra primære HCC prøver taget umiddelbart efter kirurgisk resektion fra patienter.
Kan være brug for forskellige xenografting teknikker til forskellige forskning applikationer. For eksempel er subkutane xenotransplantater genereret fra tumorfragmenter genereres hurtigt, er nemt overvåges, og kan være mere passende for den lokale administration af nye lægemidler med praktiskovervågning af tumorrespons. Intrahepatiske xenotransplantater kan være mere relevant for undersøgelser vedrørende den rolle af den hepatiske mikromiljø i HCC biologi. Xenografter genereret fra tumor celle suspensioner er nødvendige til identifikation og karakterisering af tumor-initierende celleundergrupper eller til forsøg, der kræver in vitro manipulationer af tumorceller før xenotransplantation. Vi har derfor udviklet og valideret følgende protokoller til at etablere subkutan eller intrahepatiske xenografter fra celle suspensioner eller tumorfragmenter afledt af primære humane HCC prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En skematisk oversigt over protokol er vist i figur 1.
1.. Behandling af human HCC Prøver
Opnå primære humane HCC prøver med skriftlig patient samtykke og med godkendelse af den institutionelle forskningsetik bord. Disse protokoller er blevet udført på vores institution med godkendelse fra University Health Network Research Ethics Board i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskelig velfærd.
Saml friske HCC prøver så hurtigt som muligt efter den kirurgiske procedure er blevet taget en gang relevante prøver til kliniske formål. Ideelt set bør dette finde sted inden for 30 min efter fjernelse af væv fra patienten. Som illustreret i figur 2, en prøve på mindst 1 cm 3 opnået fra periferien af tumoren er optimal, da den centrale del af tumoren kan være nekrotisk.Tumorer, der ikke har modtaget nogen behandling før resektion såsom stråling, kemoterapi eller ablation foretrækkes for at maksimere chancen for, at tumorceller er levedygtige. Håndtag primære humane væv i overensstemmelse med standard personlige værnemidler protokoller for biologisk farligt materiale. Udfør alle laboratorie manipulationer af tumorvæv og cellepræparater i en klasse II biosikkerhed kabinet anvendelse af aseptisk teknik.
- Den friske HCC prøve anbringes i 10-25 ml serum-frit Dulbeccos Modified Eagle Medium / Ham 's F12 ved 4 ° C og overføre på is til laboratoriet til øjeblikkelig forarbejdning og tilberedning af væv fragmenter og / eller celler for xenografting i mus.
- Ved hjælp af steril pincet placere tumor prøve i en 100 mm x 20 mm petriskål eller andet egnet steril arbejdsflade. Opdel tumorprøven i fragmenter på ca 2-3 mm 3 ved hjælp af en No.10 kirurgisk skalpel. På dette punkt mener snap-frysning eller formalin-fixing sogle tumorfragmenter for andre forsøg eller analyser efter behov.
- For xenografting af tumorfragmenter, placere nogle af HCC-fragmenter i én eller flere mikrocentrifugerør indeholdende nok Matrigel at give fragmenterne forbliver neddykket. Hold disse rør på is.
- Til forberedelse af en tumor celle suspension bruge kirurgiske skalpelblad til hakkekød det resterende HCC væv så meget som muligt og blandes med 5-10 ml DMEM-F12 i en 50 ml konisk rør afhængigt af mængden af hakket væv.
- Tilføj collagenase type IV og dispase II i endelige koncentrationer på 200 enheder / ml og 0,8 enheder / ml. Pipettere blandingen op og ned samt anvendelse af en 25 ml pipette.
- Røret forsegles og inkuberes blandingen fra trin 1.6 ved 37 ° C i en 5% carbondioxid-inkubator i 30-60 minutter afhængigt af blødheden af tumorvævet. Pipette blandingen op og ned et par gange hver 10 min at vurdere udviklingen af den enzymatiske fordøjelse.
- Efter digestion er færdig, passere tumor løsning gennem en 100 um cellefilter. Forsigtigt mos resterende væv på cellefilter anvendelse af en 25 ml pipette tip for at muliggøre det maksimale antal af tumorceller til at passere igennem. Opsaml anstrengt cellesuspension i et 15 ml konisk rør.
- Centrifugér tumorcelle suspensionen ved 1.200 rpm i 5 minutter ved 4 ° C.
- Forsigtigt dekanteres supernatanten. Afhængig af størrelsen af pelleten tilsættes 2-5 ml iskold 1x røde blodlegemer (RBC) lysepuffer og forsigtigt pipettere op og ned for at resuspendere pelleten. Hold på is i 5 min.
- Tilføj DMEM-F12 for et samlet volumen på 15 ml og centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for at udvaske RBC lysisbuffer.
- Forsigtigt dekanter supernatanten og resuspender RBC-free tumor cellepelleten i DMEM-F12.
- Tæl levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt-udelukkelse enten manuelt eller med en automatiseret celletæller.
- Centrifuge tumor celle portioner, der indeholder den ønskede number af celler til injektion som beskrevet ovenfor, resuspenderes den resulterende cellepellet i 30 pi iskold Matrigel og opbevares på is.
Valgfrit: Efter trin 1.11, vi rutinemæssigt nedbryder humane CD45 + celler (leukocytter) fra bulk tumor celle suspension og / eller rense delmængder af tumorceller ved anvendelse af flowcytometri eller immunomagnetiske perler. Detaljerede protokoller for disse teknikker er godt beskrevet af producenterne af de relevante antistoffer, perler og flowcytometre.
Bemærk: Protokollen beskrevet ovenfor kan også anvendes til at behandle humane tumor xenografter høstet fra mus for at udføre seriel transplantation substituere xenotransplantat væv for primære humane HCC væv i trin 1.1. I denne situation, efter trin 1,11, rutinemæssigt vi nedbryder infiltrerende murine celler fra cellesuspensionen ved anvendelse af et antistof mod muse histokompatibilitetsantigen H2k.
2.Xenografting
Gennemføre alle dyreforsøg i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af den institutionelle dyrepleje udvalg. De heri beskrevne procedurer er blevet afsluttet under en specifik Animal Brug protokol godkendt af University Health Network Animal Care udvalg i overensstemmelse og overholdelse af alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle instanser, bestemmelser og retningslinjer.
Udstyr til levering af inhalationsanæstetika flygtige anæstetika til små dyr bør udnyttes i henhold til standardprocedurer af dyret facilitet og forskningsinstitut. Foretag alle kirurgiske procedurer ved hjælp af aseptisk teknik og sterile instrumenter i en klasse II biosikkerhed kabinet. Udnyt ikke-overvægtige diabetiske svær kombineret immundefekt (NOD / SCID) eller NOD / SCID / interleukin 2-receptor gamma kæde Null (NSG) stammer af mus af begge køn på 6-8 ugers alderen (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Dissemus skal opstaldes og holdes i et anlæg er i stand til at levere patogenfrie betingelser egnet til immundefekte dyr.
Forbered mus for kirurgi i et kammer, der leverer 5% (v / v) inhaleret Isofluran i 1 L / min oxygen. Opretholde anæstesi indtil der er tab af hornhinde og tå refleks i dyret (r). Til subkutan xenografting, barbere et eller flere mindre områder på dorsum af dyret (r) og rense huden med 70% ethanol. For intrahepatisk xenografting, barbere den ventrale thorax og maven af dyret (r) fra aksillerne ned til lyske-regionen og rense huden med 70% ethanol.
2.1 Subkutan Implantation af tumorfragmenter
- Anbring den bedøvede mus udsat, vedligeholdelse inhalationsanæstesimiddel Isofluran anæstesi (2% (v / v) i 1 L / min O 2) med et mundstykke. Påfør Tear-Gel til at beskytte dyrets øjne fra traumatisk skade.
- Steriliser dorsale barberede område (r) med Betadinekirurgisk krat efterfulgt af 70% ethanol og endelig med povidon-iod-opløsning.
- Lav en 5 mm incision i huden ved hjælp af sterile skarpe saks.
- Indsæt en lukket stump saks forsigtigt ind i subkutane rum og spredes forsigtigt for at udvikle en lomme stor nok til at rumme en tumor fragment.
- Sæt tumorfragment forberedt i trin 1.3 i det subkutane lomme med sterile fine tænger.
- Luk hudindskæring hjælp suturer eller clips.
- Giver postoperativ pleje til musen som beskrevet nedenfor.
2.2 Subkutan injektion af tumorceller
- Forbered dyret som beskrevet i trin 2.1.1 og 2.1.2.
- Load suspensionen af tumorceller i Matrigel forberedt i trin 1.13 ind i en insulinsprøjte med en 29 G 1/2 i nål.
- Stik nålen ind i det subkutane rum og aflade indholdet af sprøjten. Fremme nålen flere millimeter langs subkutane flyet væk frabout huden punkturstedet forhindrer lækage af tumor cellesuspension ud af punkturstedet efter tilbagetrækning af nålen.
- Giver postoperativ pleje til musen som beskrevet nedenfor.
2.3 Intrahepatisk Implantation af tumorfragmenter
- Ved hjælp af en 27 G 1/2 i nålen på en 1 ml sprøjte, administrere 350 pi sterilt saltvandsopløsning subkutant i dorsum af bedøvede dyrets hals for at kompensere for intraoperative væsketab. Analgetika, administrere 350 pi sterilt normalt saltvand indeholdende buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutant på dyrets flanke med en 27 G 1/2-in nål på en 1 ml sprøjte.
- Anbring musen liggende på en forvarmet pad med næse og mund placeret i mundstykket for at levere vedligeholdelse inhalationsanæstesimiddel Isofluran anæstesi (2% (v / v) i 1 L / min O 2).
- Udvide lemmerne, og fastgør dem med tape til operativsystemet overflade for at optimere eksponering afventrale maven og brystkassen.
- Udfør proceduren under et forstørrelsesglas lampe for at optimere visualisering.
- Steriliser barberet hud på den ventrale abdomen og thorax med Betadine kirurgiske krat efterfulgt af 70% ethanol og endelig med povidon-iod-opløsning.
- Brug sterile skarpe saks, lave en tværgående bilateral subcostal hudincision og opdele muskel lag at indtaste bughulen for at tillade tilstrækkelig eksponering af hele leveren.
- Placer et sting i huden over xiphoideus proces, og fastgør den til mundstykket med tape for at give en bedre eksponering af leveren og de omkringliggende strukturer.
- Brug to bomuld tippes applikatorer tilstødende og posteriort til leveren for at stabilisere den.
- Gøre et snit 3 mm i længde og dybde på overfladen af leveren ved anvendelse af en steril nr. 10 skalpelblad.
- Umiddelbart anvende Surgicel og let tryk på incisionssted at opnå hæmostase, fjernes efter 60-90 sekog fortsætte, hvis fuldstændig hæmostase er opnået.
- Placer et fragment skridt tumor 1.3 ind i leveren snit med sterile fin pincet eller med en 18 G kanyle.
- Påfør et lille stykke af Surgicel over leveren indsnit for at forhindre forskydning af tumorfragment og sikre fortsat hæmostase.
- Lukke snittet med suturer eller clips.
- Giv postoperativ pleje som beskrevet nedenfor
2.4 Intrahepatisk implantation af tumorceller via direkte injektion i leveren
- Forbered mus, som beskrevet i trin 2.3.1 til 2.3.7 ovenfor.
- Load tumor cellesuspension (fremstillet i trin 1.13) i en insulinsprøjte under anvendelse af en 29 G 1/2 i nålen.
- Med leveren stabiliseret ved hjælp af en bomuld-tip applikator indsætte insulin kanylen ind i leveren og fremme spidsen et par millimeter ud over indstiksstedet langs et subkapsulær fly.
- Forsigtigt udstøde indholdet af sprøjten og thøne fjernes kanylen fra leveren.
- Placer Surgicel over punkturstedet og tryk forsigtigt med en bomuld tippes applikator for at forhindre udsivning af tumor celle suspension og for at opnå fuldstændig hæmostase.
- Lukke snittet med suturer eller clips og giver postoperativ pleje, som beskrevet nedenfor.
2.5 Intrahepatisk Xenografting af tumorceller via injektion i Spleen
- Forbered mus som beskrevet i trin 2.3.1 til 2.3.5 ovenfor.
- Brug sterile skarpe saks, lave en 1 cm forlod subcostal snit at komme ind i bughulen.
- Brug en bomuld applikator afspejler maven kranialt og dyrets højre side for at blotlægge milten.
- Ved at håndtere de omkringliggende fedtvæv med sterile fine atraumatisk pincet levere milten i snittet og læg en bomuld tippes applikator bag milten at stabilisere den.
- Brug 5-0 silkesutur, steden løs præ-bundet knude rundt milten over den nedre pol.
- Load tumor cellesuspension (fremstillet i trin 1.13) i en insulinsprøjte under anvendelse af en 29 G 1/2 i nålen.
- Sæt insulin kanylen ind i den nedre stang af milten og fremme den forbi niveauet for løs pre-bundet knude.
- Langsomt aflade indholdet af sprøjten, tag kanylen fra milten, og stram knude for at forhindre udsivning af den injicerede tumor celle suspension.
- Udskift milten i bughulen.
- Lukke snittet med suturer eller clips og giver postoperativ pleje, som beskrevet nedenfor.
2.6 Delvis hepatektomi at lette Intrahepatisk engraftment på human tumorvæv
- Forbered mus som beskrevet i trin 2.3.1 til 2.3.7.
- Med sterile skarpe saks, opdele falciforme ligament knyttet til median lap af leveren.
- Ved hjælp af en bomuld tippes applikator, mobiliserevenstre lap af leveren og position en løs præ-bundet knude 5-0 silkesutur omkring venstre lap. Advance løs knude så tæt som muligt mod bilio-kar stilken af den venstre lap og stram knude.
- Udskære venstre lap distalt for ligatur med sterile sakse, efterlader et lille stump for at forhindre glidning af knuden og efterfølgende blødning.
- Ved hjælp af en lignende teknik, ligere og resect størstedelen af medianen Leverlappen undgå galdeblæren.
- Brug Surgicel og blide tryk med en bomuld tippes applikator langs snitfladerne af leverparenkym at opnå fuldstændig hæmostase.
- For intrahepatisk xenografting af en tumor fragment eller tumorceller, fortsætte med trin 2.3.8 til 2.3.11 eller 2.4.2 til 2.4.5 som beskrevet ovenfor.
- For intrahepatisk xenografting af tumorceller via milten injektion udnytte bomuld tippes applikatorer forsigtigt afspejle maven kranialt og dyrets højre side, exposing milten. Fortsæt med trin 2.5.4 til 2.5.9, som beskrevet ovenfor.
- Lukke snittet med suturer eller clips og giver postoperativ pleje, som beskrevet nedenfor.
2.7 Postoperativ pleje
- Fjern musen fra inhalationsanæstesi mundstykket.
- Anbring musen i et bur under en varmelampe i ca 20 min, indtil genvundet fra anæstesi og mobilisere helt.
- Gentag buprenorphin dosis hver 8-12 timer i løbet af de første 2-3 postoperative dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser det typiske udseende af en subkutan human HCC xenograft og den tilsvarende histopatologiske udseende af tumoren. Udvikling og vækst af subkutane xenotransplantater kan let overvåges ved daglig undersøgelse af recipientmus. Tidsintervallet mellem xenografting og udvikling af en tumor kan variere meget afhængigt af typen af væv (tumorfragment vs celle suspension), kilde til væv (primær prøve patient, passerede xenograft eller cellelinje), og mængden af væv implanteret ( antallet af celler eller tumorstørrelse fragment). For eksempel kan betydelige xenotransplantater udvikle sig fra injektion af 5 x 10 6 celler af en veletableret HCC cellelinie inden for 1-2 uger, mens kan være påkrævet 6 måneder til udviklingen af et tilsvarende xenotransplantat fra 1 x 10 5 celler opnået fra en primær patient HCC prøve. Vi har ikke observeret subkutan xenograft dannelse senest 6 måneder efter implantation af tumorprøven og dermed ofrer recipientmus var på dette tidspunkt, hvis implanteret ikke har udviklet.
Figur 4 viser de typiske udseende af intrahepatiske humane HCC-xenotransplantater opnået fra direkte implantation af tumorvæv i leveren samt dem, der opnås ved injektion af tumorceller i milten. Intrahepatiske implanteret der ikke umiddelbart kan påvises ved almindelig fysisk undersøgelse af modtagerens musen medmindre svulsten er ekstremt stor eller har resulteret i udviklingen af ascites eller oppustethed. Selv små dyr billeddiagnostiske metoder såsom CT-scanning er tilgængelige på nogle forskningsinstitutioner og kan bruges til præcist at afhøre leveren af modtagerens mus 11, mener vi ikke overveje dette en bredt anvendelig, praktisk eller omkostningseffektiv tilgang til de fleste efterforskere. Vi har observeret, at den hastighed, hvormed udvikle intrahepatiske implanteret svarer til den hastighed, hvormed subcutaneoos implanteret udvikle sig, og er ligeledes påvirket af variabler såsom den type, kilde og mængde af væv implanteret. Baseret på udførelsen af subkutane xenotransplantater stammer fra den samme forælder væv som benyttes til intrahepatic xenografterne vælger vi et tidspunkterne for ofring af modtagerens mus og undersøgelse af leveren medmindre klare beviser for en stor intrahepatisk tumor er til stede, før dette. Vi har observeret, at tilsætning af en delvis hepatektomi til intrahepatisk xenografting anvendte procedure forbedrer sandsynligheden for at opnå indpodning af humant tumorvæv i muselever, men synes ikke at accelerere xenotransplantat vækst.
Tabel 1 opsummerer tumor engraftment satser opnået efter implantation af primære humane HCC væv i immunsvækkede mus ved hjælp af de forskellige teknikker, der er beskrevet i denne protokol. For hver implantation metode nævneren i tumoroptagelse sats afspejler en unik hum en HCC prøve. Disse data viser, at for primære humane HCC væv, subkutane engraftment satser er ringere end satserne for intrahepatisk engraftment opnået ved intrasplenic tumorcelleinjektion eller intrahepatisk tumorfragment implantation, og at delvis hepatektomi ser ud til at forbedre intrahepatisk engraftment. Selvom vi med succes har udnyttet celle indsprøjtning direkte i musen leveren til at generere intrahepatiske xenografter fra veletablerede humane HCC cellelinjer (data ikke vist), har vi ikke skabt nogen intrahepatiske implanteret med denne metode ved hjælp af primære humane HCC prøver på trods af brugen af delvise hepatektomi .
Figur 1. Skematisk oversigt over protokol illustrerer arbejdsgangen for forarbejdning og tilberedning af HCC prøve samt efterfølgende xenografting optioner (indsat).
544fig2.jpg "/>
Figur 2. Leverresektion eksemplar fra en patient med hepatocellulært carcinom. Denne patient havde ikke modtaget nogen adjuverende behandling til tumoren. Den hvide boks viser en levedygtig del af tumor nær periferien, som blev opnået for xenografting. Målestokken øverst til højre svarer til 1 cm.
Figur 3. Humant hepatocellulært carcinom xenograft genereres fra den subkutane injektion af tumorceller. A) tumoren kan let forstås på højre flanke af dyret. B) Tumor ses at være adskilt fra de omgivende væv efter aflivning af dyret. C) Den histologi af tumor viser typiske træk ved hepatocellulært carcinom, herunder hepatocyt-lignende celler med nukleare atypia og høj nuklear-til-cytoplasma ratio fravær af portal skrifter, og distorted trabekler med øget tykkelse af hepatocellulære plader. Scale bar svarer til 1 cm i panel A og B og 100 um i panel C. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Intrahepatiske humane hepatocellulært carcinom xenotransplantater. A) xenograft genereres fra implantation af en human tumor fragment i muselever. Intraparenchymal tumor angivet med sort pil. Omfanget af linealen nederst på billedet i cm. B) Xenograft genereres fra injektion af humane tumorceller i mus milt efter delvis hepatektomi. Intraparenchymal tumor angivet med sort pil. Scale bar svarer til 1 cm C) Histologi sektion. Gennem margin på intrahepatisk xenograft demonstratning typiske træk af humant hepatocellulært carcinom (nederst til højre) og tilstødende normale muselever (øverst til venstre). Scale bar svarer til 100 um. Klik her for at se større figur .
| Implantationsstedet | Implantation Method | Tumor Tag Rate |
| subkutan | cellesuspension | 6/55 (10,9%) |
| tumorfragment | 23/136 (16,9%) | |
| milt | cellesuspension | 3/15 (20%) * |
| cellesuspension + delvis hepatektomi | 6/14 (42,9%) * | |
| lever | tumorfragment | 6/13 (46,2%) |
| tumorfragment + delvis hepatektomi 2/3 (66,7%) | ||
| cellesuspension | ikke udført | |
| cellesuspension + delvis hepatektomi | 0/8 (0%) | |
| * Andelen af prøver, der gav intrahepatiske tumorknuder | ||
Tabel 1. Menneskelige HCC engraftment satser i immunsvækkede mus svarende til forskellige implantation teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en række forskellige teknikker til at etablere subkutan og intrahepatiske human HCC xenotransplantater i immundefekte mus, der kan anvendes til en bred vifte af eksperimentelle spørgsmål og assays. Mens subkutane xenotransplantater er ofte blevet brugt til at studere forskellige aspekter af HCC biologi, er intrahepatiske xenotransplantater sjældent beskrevet i litteraturen. Desuden har de fleste studier, der beskriver brugen af xenotransplantater genereret disse fra veletablerede cellelinier. På grund af de begrænsninger af kræft cellelinjer i modellering human tumor biologi 12 har vi været motiveret til at validere de ovenfor beskrevne teknikker med primære humane HCC væv. Selvom det ikke er understøttet af statistisk analyse på grund af de små stikprøver af de eksperimentelle grupper vore observationer subjektivt afslører en overbevisende tendens til forbedret engraftment satser med tillæg af delvis hepatektomi til intrahepatisk implantation af tumorceller eller fragmenter. </ P>
De få undersøgelser, der strengt forsøgt at udnytte primære væv har opnået succes subkutan transplantation med kun en meget lille andel af patientprøver opnåede 13-15. Vi har også observeret, at andelen af primære humane HCC prøver, der med held indpode i det subkutane rum i immunsvækkede mus under anvendelse af de ovenfor beskrevne teknikker er begrænset til cirka 15%. I den menneskelige lever, HCC læsioner er hypervaskulære, modtager deres blodforsyning overvejende via leveren arterie 16,17. Vi spekulere, at den lave engraftment på primær HCC væv, som vi og andre har observeret kan være et resultat af sårbarheden af friske HCC væv til den relative hypoxi af mikromiljø, som de er xenotransplanteret uden etablerede arteriel forsyning. Modtagelighed HCC væv til hurtig iskæmisk nekrose i intervallet mellem kirurgisk resektion og xenografting kan også Account for den lave transplantation sats opnået i mus.
Til generering af intrahepatiske menneskelig HCC implanteret fra tumor cellesuspensioner, har vi fundet, at injektion af celler i milten er en teknisk positive holdning, der resulterer i overlegen satser lever transplantation fra primære humane HCC prøver. Milten er en yderst vaskulariseret struktur, som bedre kan understøtte HCC-celler i forhold til andre steder i musen, og hvorfra tumorceller tilsyneladende let rejser ind i leveren via milt og portal vener. I sammenligning med leverparenkym, i hvilke det er teknisk vanskeligt direkte at injicere celler uden lækage eller blødning, milt har strukturel kapacitet til at rumme volumenet af den cellesuspension, der injiceres, og let kan ligeres når tumorcelleinjektion er færdig. Injektion af cellesuspensioner direkte i portalen vene eller hepatisk arterie i 6-8 uger gamle mus ikke er teknisk FeasIBLE.
Vi har udnyttet delvis hepatektomi i recipientmus at lette intrahepatisk engraftment af humane HCC væv. Selvom musemodeller af partiel hepatektomi er ofte blevet brugt til at studere biologi leverregenerering 18, er vi ikke bekendt med rapporter, der beskriver det i kombination med intrahepatisk tumor xenotransplantation. Da leverregenerering sker hurtigt inden for de første adskillige dage efter delvis hepatektomi, vi spekuleret på, at stærkt forbedret ekspression af mitogene og angiogene stimuli inden leverparenkym bedre ville understøtte engraftment og proliferation af sårbare human tumor væv eller celler implanteret i den resterende del af museleveren, sammenlignet med en muselever i sin "hvile"-tilstand 19. Hos mennesker er den største risikofaktor for HCC udvikling avancerede lever fibrose eller cirrose, som er kendetegnet ved udviklingen af uorganiseret regenerativ nejdules, og som er blevet konceptualiseret af nogle som en tilstand af kronisk leverskade og regenerering 20.. De teknikker, vi har vist at indpode humane HCC væv i musen leveren ved at aktivere leverregenerering kan vise sig at være en værdifuld model for at tillade efterforskning ind i rollen som den hepatiske mikromiljø og lever regenererende mekanismer i patofysiologien af HCC.
Medens de heri beskrevne teknikker er i stand til at generere høj kvalitet primære humane HCC-xenotransplantater i immunsvækkede mus skal undersøgere overvejer anvendelsen af disse protokoller overveje nogle begrænsninger af modellen. Først vores protokoller indarbejde minimal forsinkelse mellem den kirurgiske resektion af patientens væv og dets efterfølgende behandling i laboratoriet, men alligevel opnå høje engraftment satser har været en udfordring, og dette tyder på, at levedygtige implementering af disse teknikker kræver nærhed af patienten væv indsamlingssted tillaboratorium, eller infrastruktur, der kan minimere forsinkelser i overførslen af friske prøver. For det andet skal komplicerede intraabdominale kirurgiske procedurer på 6-8 uger gamle immunsvækkede mus udføres af passende uddannet personale for at opnå overlevelse af dyrene i flere måneder før implanteret form disse procedurer og efterfølgende dyrepleje er både tids-og ressourcekrævende. For det tredje, udvikling og progression af intrahepatic implanteret der ikke umiddelbart kan overvåges uden at ofre dyr på forudbestemte tidspunkter, hvilket begrænser nytten af implanteret i denne placering for nogle typer af assays som beskrevet ovenfor. Desuden kan intrahepatiske xenotransplantater afledt fra indsprøjtning af celler i milten præsentere som flere knuder spredt over hele leverparenkym der er vanskeligt nøjagtigt at kvantificere i form af den samlede tumorbyrde. Endelig er det vigtigt at bemærke, intrahepatiske tumorknuder som følge af injektion af celler i milten kan vælgetivt afspejle specifikke subpopulationer af celler, der er i stand til migration fra milten til leveren og efterfølgende tumor indvielse.
Ved generering xenotransplantater fra primære humane HCC-væv, er det også vigtigt at bekræfte, at de resulterende xenotransplantater ligne HCC. Vi har tidligere vist, at lymfomer uforvarende kan udvikle sig fra personbiler leukocytter inden xenotransplanteret menneskelig HCC væv 21. Vi derfor rutinemæssigt nedbryder human CD45 + leukocytter fra primære tumor cellesuspensioner og udnytte RT-PCR, flowcytometri, histopatologiske vurdering og immunhistokemi at analysere implanteret for typiske kendetegn HCC. Når passage etablerede implanteret til yderligere undersøgelser, bør tumorinfiltrerende murine celler også være udtømt anvendelse af et antistof mod mus histokompatibilitetsantigen H2k. Hvis programmet forskning indebærer anvendelse af tumorfragmenter eller måling af xenotransplantat vækst, analyse af xenograFTS på endepunkt bør omfatte en vurdering af, i hvilken grad de tumorer er infiltreret af humane leukocytter og mus celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en canadisk Institutes of Health Research Fase 1 kliniker-Scientist Award (AG) og et driftstilskud fra Cancer Research Society (AG). Forfatterne er taknemmelige for Dr. John Dick for hans støtte til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
