Summary
新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供
Abstract
血管新生は、既存の血管ネットワークから新規血管の発芽によって定義された新しい血管形成の複雑なプロセスである。血管新生は、臓器や組織の正常な発達ではなく、例えば、癌、失明や虚血性疾患などの血管形成を調節不全である、多くの疾患、だけでなく、重要な役割を果たしている。大人の生活の中で、血管が新生が病気に特異的に新しい血管の形成を試み、規制する新たな薬剤開発のための重要なターゲットであるので、一般的に静止しています。優れた血管新生を理解し、それを規制するための適切な戦略を開発するために、モデルが正確に関与する異なる生物学的工程を反映していることが必要である。動脈、静脈と毛細血管が出産後の最初の週の間に血管叢を形成するために開発するため、マウス新生児の網膜は、血管新生の優れたモデルを提供します。このモデルは、2つの - ジを有するという利点を有するmensional（2D）構造は、他の血管のネットワークの複雑な3D解剖と比較して簡単な解析を行う。出生後の異なる時点で網膜血管叢を解析することにより、顕微鏡下で血管新生の様々な段階を観察することが可能である。この記事ではイソレクチンと血管特異的な抗体で蛍光染色を用いたマウス網膜の血管構造を解析するための簡単な手順を示しています。
Introduction
血管新生は、既存の血管ネットワークから新たな血管の形成によって定義され、いくつかのシグナル伝達経路により調節される複雑な発達過程である。これらの最も顕著なのはVEGF経路である。 VEGFは、隣接血管の発芽血管新生の開始に虚血細胞及びリードによって解除される。芽新しい血管からの主要な内皮細胞は、VEGFの源に向かって手を差し伸べることを糸状仮足を作り出す '先端'セル、であり、 '茎'内皮細胞増殖が続いている。このように、活性化内皮細胞は移動し、それらが新しい血管の管を形成する無血管領域に向かって増殖する。血流をサポートするために、これらのチューブを安定化させるために、内皮細胞は、周皮細胞と新しい血管1を囲む平滑筋細胞と相互作用する。血管新生は胚と成長組織の血管新生のために不可欠です。しかし、それはまた、多くのpathologiに寄与する癌などのCAL障害;血管新生における欠陥は虚血性疾患に関連付けられているのに対し、。疾患を治療するための手段として血管形成を調節するための効果的な薬物治療の開発は非常に興味深いことである。例えば、効果的な抗血管新生因子は、血管新生促進戦略は虚血性疾患の治療に使用することができる一方で、癌の増殖を減少させる。したがって、血管新生のモデルは、より良い新たな血管の形成と血管の成長を高めるか、または減少させるための新たな治療戦略を開発するための規則を理解することが不可欠です。
血管新生研究の基本的な要素は、適切な血管モデルの選択です。 in vitroモデルの多くは、このような内皮細胞の遊走、増殖および生存2,3のような血管形成の基本的な手順を再現するように設計されている。トンが頻繁にin vitroアッセイで使用される、マトリゲルマトリックス上内皮細胞の分枝ネットワークの形成である彼は、内皮細胞に特異的なものではなく、また、通常は周細胞又は平滑筋細胞の支持体を組み込んでいない。このような胚様体アッセイ、大動脈リングアッセイおよび胎児の中足骨アッセイとして、マウスの器官培養を用いたex vivoで発芽血管新生の評価は追加の支持細胞の文脈における内皮細胞の血管新生の分析を行うことができます。しかし、これらのアッセイの主な制限は、分析のために限られたウィンドウを与え、血流の欠如、時間の経過とともに血管の退縮が挙げられる。したがって、in vivoモデルにおいて 、より正確に血管新生の調節を理解するために、例えば皮下に移植スポンジ又はマトリゲルプラグ、並びに後肢虚血モデルを用いて、マウスにおいて開発されたものとして必要とされている。しかし、これらのモデルは、新生血管の複雑な3Dアーキテクチャにより分析することが挑戦しています。これとは対照的に、ゼブラフィッシュ胚全体で血管新生を可視化するための優れたモデルを証明している生物4。しかし、マウスはマウス、多くの場合において好ましいモデル作り、進化的にはるかに密接にゼブラフィッシュより人間に関連しています。結果的に出生後のマウス網膜の血管新生、血管新生研究のための選択のよく特徴付けメソッドを表します。それは生理的な設定だけでなく、容易に適切な蛍光汚れを用いて可視化することができ、2D血管叢を提供するだけでなく。血管ネットワークのアーキテクチャ、内皮増殖、発芽、血管周囲の細胞動員と血管リモデリングは、すべて、この手法を用いて検討することができます。
新生仔マウスの網膜において、網膜血管の発達は出生後の最初の週に起こる。マウスは、人間とは違って、生まれつき目が見えないされ、網膜のみ生後血管なる。網膜血管に近い生後0日（P0）で視神経に網膜の中心部から発生し、高度に組織化を形成するために、血管新生によって開発約P8 5によって網膜周辺部に到達したdの血管叢。血管が徐々に介入して毛細血管網で動脈と静脈の定期的な交流のパターンを生成するために周辺に向かって視神経乳頭から外側に成長毛細血管叢との特性の方法で開発しています。網膜血管系は、このように、それが比較的容易にフラットマウント標本5における網膜血管構造を検討すること、彼らは基本的に2D平面であるものに育つように血管が簡単に識別できるような血管新生を研究するための理想的なモデルを提供します。数時間のex vivoで上内皮先端細胞応答の分析のための新生児マウスの網膜を単離するための方法は、06報告されている。代替的に、全体の網膜血管系および関連血管マーカーのより詳細な調査は、開発の異なる段階で固定網膜標本の免疫染色が必要である。
ここでは、提供する我々は、顕微鏡下で染色プロトコルを介した出生後の眼の初期摘出（また、7参照）から最終的な画像に、マウスの網膜血管叢の全体マウント染色に使用する信頼性と技術的にまっすぐ進む方法の詳細な説明。
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Protocol
特に断らない限り、すべてのステップは、室温で行われる。
1。産後目の摘出および固定
- その側に子犬安楽死マウスを置き、ハサミで目を覆っている皮膚を除去。
- 目を摘出するためにはさみやピンセットを使用してください。
- 摘出眼球下場所はさみ、視神経と周囲の組織をカットし、目を持ち上げて外します。室温で2倍PBSで構成された4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含む24ウェルプレートに移す。
- それぞれの目は、10のために修正するために許可する - 10分 - 15分、その後5氷上で冷たい倍PBSに転送。固定度を確保するためにenucleationsとその後固定をずらすことが最善であるそれぞれの目のために等しくなります。
2。産後マウス網膜の解剖
- disse下穴および場所を広げるためにカットされているプラスチック製パスツールピペットを用いて2倍のPBSを含むペトリ皿に目を移す顕微鏡cting。
- 鉗子やハサミを使って目の周りの任意の脂肪を取り除きます。
- ピアース鋭いハサミで角膜の端と角膜と虹彩の周りカットして捨てる。
- 網膜と強膜の間に鉗子を挿入して、網膜を引き裂くないように注意して強膜を除去する。脈絡膜層も除去することができるが、この工程の間に生じる網膜の損傷がある場合は、脈絡膜層は、それが著しく免疫染色の品質に影響を与えるべきではないように残すことができる。
- レンズとピンセットを用いて硝子体液を削除します。
- その後すぐに網膜の中心（あるいは細かいハサミで硝子体血管の基部に中略）から引き離し細かい鉗子でアイの中心でそれらを一緒に集めることによってhyaloids血管を削除します。
- きれいなペトリ皿にPBSでカップ形の網膜をすすぐ。
- 春scissoを用いた網膜の半径の約2/3に達して4から5放射状の切開を行いますRS '花びら'形状を作成する。
- 網膜を平らにするためにパスツールピペットを用いてPBSをオフに描画した後、吸収紙の小片で余分PBSを除去します。
- 追加のメタノールで完全に覆われており、その後、洪水まで、網膜の表面にドロップでゆっくりピペット寒い（-20°C）メタノールドロップ。これは、網膜を固定するのに役立ちますし、透過性を促進する。網膜は、白になります。
- 穴を広げるためにカットされたプラスチック製パスツールピペットを用いて2 mlのチューブに移します。
- 免疫染色を進める前に、少なくとも20分間冷メタノールで網膜のままにしておきます。ここで使用される抗体のうち、VE-カドヘリンは、メタノール固定網膜上で正常に使用することはできません。この場合、網膜は、ステップ9の後に免疫染色にまっすぐ進んでする必要があります。
- 必要に応じて前まで染色まで数ヶ月のために、網膜を-20℃でメタノールに格納することができます。
3。網膜Vascuの免疫/イソレクチン染色lature
- 慎重に削除/メタノールを留注ぎ、優しく（この段階で網膜は、上記の手順11から同じ2 mlのチューブに残っている）をPBSで簡単に網膜をすすいでください。
- パーマ/ブロック溶液100μl（PBS + 0.3％トリトン+ 0.2％BSA）を含むPBS、カバー網膜に適切な血清+ 5％（ 表1を参照）を取り外し、1時間軽く振る。
- パーマ/ブロックを取り外し、優しい4℃で一晩振とうしながら網膜をインキュベート100℃選択し、一次抗体の液（ 表1を参照）、および/ またはIsolectinB4とC、パーマ/ブロックで希釈することにより調製すべて。
- 抗体/イソレクチンを取り外し、PBS + 0.3％トリトン（PBSTX）における網膜4×10分を洗う。
- IsolectinB4-Alexa488又は直接標識1次抗体で染色した後に例えばいくつかのケースにおいては、二次抗体は必須ではなく、網膜する（ステップ7）を直接取り付けることができる。コンジュゲートしていない一次抗体は、適当なフッ素を100μl次に、ステップ3で使用されているとき自己消費二次抗体（PBSTXで1/200希釈）を加え、4℃または室温で4時間撹拌一晩インキュベート置する。
- 二次抗体を除去し、2ミリリットルPBSTXにおける網膜4×15分を洗う。
- 広い口径プラスチックパスツールピペットを用いてスライドに網膜を転送し、吸収剤、ティッシュで余分PBSTXを削除します。 50μlのを追加してマウント網膜は、網膜上にカバースリップと優しく位置に封入を延長。
- 転送は、彼らが延長封入が設定できるように、フラットで光から保護されていることを確認し、4℃で一晩冷蔵庫にスライドします。
- 共焦点顕微鏡または落射蛍光顕微鏡を用いた画像網膜。
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Representative Results
解剖後網膜は、フラットの花（ 図1）のようになります。上記で概説プロトコルを使用することにより、血管内皮細胞を抗α平滑筋アクチン（ 図2）を用いて可視化されるイソレクチンB4-Alexa488染色を用いて、血管筋細胞を支持することが分かる。 図2の5倍対物レンズを用いて低消費電力の表示は、網膜の血管の組織の概要を可能にする。また、上記のプロトコルで指定された抗体の異なる組み合わせを使用することにより、血管内皮細胞を抗CD31免疫染色と支持周皮細胞を使用して見ることができるNG2（ 図3）又はデスミン（ 図4）に対する抗体を用いて見られる。抗デスミン染色は周皮細胞のプロセスのように指を可視化し、それらが密接に内皮細胞に関連付けられているかどうかを判断するために有用である。これとは対照的に、抗NG2染色がある場合に便利です各周皮細胞の核を、概説血管系の周皮細胞の数を定量化。これは、高電力（ 例えば、60X）対物レンズを用いて、視野当たりのセルの数をカウントすることによって行われるだろう。必要な場合には、抗体の代替の組合せも（ 表1参照）を用いることができ、例えば、抗コラーゲンIVは、血管基底膜を可視化するために有用である。内皮細胞について染色された網膜は、網膜の端に向かって中心から血管系の進行、周波数を分岐血管密度と血管などの血管新生の主要な機能のために分析することができます。
図1。直ちに解剖とメタノールを添加した後新生児網膜の外観。この画像はツァイスSTEMI SV6とAxiocam HRを使用して撮影され Cカメラ。
図2。イソレクチンB4-Alexa488（緑）（）で全体のマウント網膜（年齢P7）の免疫染色、抗α平滑筋アクチンのCy3（赤）（B）またはマージされた（C）。これらの画像はツァイスaxioimagerで撮影されており、 5X対物レンズを用いてAxiocam HRMカメラ。動脈と静脈の交互のパターンに注意してください 。動脈は直ちにそれらを囲む毛細血管無料ゾーンによって認識され、アルファ平滑筋アクチンの陽性染色平滑筋細胞（赤）でコーティングされています。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図3は 、抗CD31一次抗体（Alexa488に結合抗ラットIgG、緑、で検出）で全体のマウント網膜（P6年齢）の二重免疫染色;に抗ウサギIgGコンジュゲートを用いて検出し、抗NG2一次抗体アレクサ594（赤、B）。これらの共焦点画像は、13のzスライス、0.47ミクロン厚のそれぞれからレーザ走査画像を合成60X対物レンズを用いて撮影した。 CのイメージのオーバーレイはCD31陽性内皮細胞（緑色）とNG2陽性周皮細胞（赤）を示しています。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4は、抗CD31一次抗体（Alexa488に結合抗ラットIgG、緑、で検出）で全体のマウント網膜（P6年齢）の二重免疫染色;に抗ウサギIgGコンジュゲートを用いて検出、および抗デスミン一次抗体アレクサ594（赤、B）。これらの共焦点画像は21 Zスライス、0.24μmの厚さのそれぞれからレーザ走査画像を合成60X対物レンズを用いて撮影された。 CのイメージのオーバーレイはCD31陽性内皮細胞（緑色）とデス ミン陽性周皮細胞（赤）を示しています。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
| 一次抗体 | ワーキング希釈 | ブロッキング液（セラム+パーマ/ブロック） | 二次抗体 |
| 抗NG2（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン） 1:250 | 5％ヤギ血清 | ヤギ抗ウサギアレクサ594 | |
| 抗GFAP | 1:500 | 5％ヤギ血清 | ヤギ抗マウスアレクサ488 |
| 抗デスミン | 1:500 | 5％ヤギ血清 | ヤギ抗ウサギアレクサ594 |
| 抗コラーゲンIV | 1:200 | 5％ヤギ血清 | ヤギ抗ウサギアレクサ594 |
| アンチエンドグリン | 1:100 | 5％ヤギ血清 | ヤギ抗ラットアレクサ594 |
| 抗CD31 | 1:500 | 5％ヤギ血清 | ヤギ抗ラットアレクサ488 |
| 抗VE-カドヘリン | 午前1時10分 | 5％ヤギ血清 | ヤギ抗ラットアレクサ594 |
| アンチALK1 | 1時25 | 5％ロバ血清 | ロバ抗ヤギアレクサ594 |
| アンチASMA-Cy5の | 1:100 | <TD>ペルミブロックのみN / A |
表1。全体のマウント網膜の免疫蛍光染色のために一次抗体の例。
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Discussion
ここで紹介する方法は、血管新生の容易に定量化し、生理学的に適切なモデル作り、新生児マウスの網膜のステンドホールマウント標本の画像を取得するための簡単かつ効率的な方法を提供しています。最初は、マウスの目は、その小さなサイズと地球の形状により解剖するのは非常に困難になる可能性がありますので、いくつかの練習と良い解剖ツールは信頼性のある結果を得るために必要とされている。これは眼からの水分損失の少量を引き起こし、切開を容易にするイントラ軌道圧を低下させるため、PBSの2倍の濃度で調製した眼の切開が重要である。網膜の良好な製剤は、いくつかの理由のために重要である。最初に、血管系の整合性を維持します。硝子体の脈管構造が十分に除去されない場合、第二に、高レベルのバックグラウンドをもたらす、抗体染色の効率が低下し、分解能を低下させた。網膜のPFA固定時間が長すぎる場合にも、この問題が発生する可能性があります。しかし、事前の染色に、-20℃の冷凍庫内のメタノールで数ヶ月に長期貯蔵アップ前イソレクチン染色に、 表1中の抗体の最も適しています。イソレクチン染色がまれに問題があるが、内皮細胞に加えて、シミマクロファージを行う。全体のマウント網膜の良い免疫、抗体の選択は重要であり、染色プロトコルはポリクローナル抗体が使用されているバッチ間で異なる場合があり、抗体特異性と濃度に応じて適合させなければならない。高いバックグラウンドは、通常、抗体濃度を低下させる洗浄時間を増加または洗浄工程に多くの洗剤を加えることによって減少させることができる。メーカーによって示される抗体は、到着時に小分けして保存されます。 -20°Cで保存されているものについては、作業アリコートを凍結融解の反復サイクルを避けるために、冷蔵庫に保管されている。明るい蛍光スポットは、これがまた存在している場合は特に、染色された試料上に表示された場合組織の周りの地域では、これは抗体の沈殿凝集体が使用前に5分間、10,000 rpmのための抗体を遠心分離することによって、すべてのその後の実験では削除されるべき存在していることを示唆している。現在私たちの研究室で使用される抗体のいくつかは、適切な希釈（ 表1）材料リストにある。抗体の互換性のある組合せを選択すると、一次および二次抗体との間の望ましくない交差反応を回避するために非常に重要である。細胞増殖の前に組織を採取するにBrdUを約2時間の溶液をマウスに注射することによってモニターすることができる。このチミンアナログは、DNAの増殖に組み込まれており、8前述したように、特異的な抗BrdU抗体を用いて検出することができる。
各網膜は非常に壊れやすいですが、プロトコルを介して作業しながら、そっとティッシュを処理することによって別の血管マーカーについて染色することができます。コントロールの数はに含まれています染色の特異性を示すために、各実験。未処理の網膜は最小限であるべき組織における自家蛍光の程度を明らかにする。まだ一次抗体コントロールは、組織への二次抗体の非特異的結合の決定を可能にしない。誤って解剖中に破れてきた網膜は、コントロールに有用な組織を提供することができます。スライドは、暗闇の中で4℃で保存されているようにマウントした後、蛍光染色は限り数日間保持されます。落射蛍光顕微鏡による撮像は、フォーカス光のうち除去する余線分の使用によって改善される。代替的に、共焦点顕微鏡（ 図3および図4）正確な細胞特異的イメージングを提供する。
この方法は、多くの可能な用途を有する。それは血管形成を調節する重要な遺伝子が遺伝学のCre-loxPを8-10誘導性を使用する作業も含まれ、空乏化されたマウスに適用することができる。あるいは、網膜血管新生は、することができます尋問は、次の薬物治療は、彼らのプロまたは抗血管新生効果11を調査するために、全身または内眼どちら配信。これは、利用可能なトランスジェニックツールを利用して、網膜血管系11,12の主要な要素を視覚化するGFPまたはRFPトランスジェニックマウスを使用することも可能である。 （室温で1時間、PBS中4％PFAを用いて固定は、従来のトランスジェニックマウスからの撮像内因性のGFP又は網膜におけるRFPのプロトコールのステップ2.12、メタノールの代わりに使用されることに留意されたい。）さらに、分子シグナリングを研究するためにメカニズムは、in situハイブリダイゼーション13 での使用網膜神経叢における特定の遺伝子のmRNA発現を可視化することが有用である。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、ウェルカムトラストと英国心臓財団によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R | |
References
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