Summary
La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in un
Abstract
L'angiogenesi è il complesso processo di formazione di nuovi vasi definito dalla germinazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi pre-esistente. Angiogenesi gioca un ruolo chiave non solo nel normale sviluppo di organi e tessuti, ma anche in molte malattie in cui la formazione del vaso sanguigno è disregolato, come il cancro, cecità e malattie ischemiche. Nella vita adulta, i vasi sanguigni sono generalmente quiescente così angiogenesi è un obiettivo importante per il romanzo lo sviluppo di farmaci per cercare di regolare la formazione di nuovi vasi specificamente nella malattia. Per capire meglio l'angiogenesi e di sviluppare strategie appropriate per regolarlo, i modelli sono richieste che rispecchiano fedelmente le varie fasi biologiche che sono coinvolti. Il mouse retina neonatale fornisce un eccellente modello di angiogenesi perché arterie, vene e capillari sviluppano a formare un plesso vascolare durante la prima settimana dopo la nascita. Questo modello ha anche il vantaggio di avere un due dibidimensionale (2D) Struttura rendendo semplice analisi rispetto alla complessa anatomia 3D di altre reti vascolari. Analizzando la retina plesso vascolare in tempi diversi dopo la nascita, è possibile osservare le varie fasi della angiogenesi al microscopio. Questo articolo illustra una procedura semplice per analizzare il sistema vascolare di una retina di topo mediante colorazione fluorescente con anticorpi specifici isolectin e vascolari.
Introduction
L'angiogenesi è un processo complesso dello sviluppo definito dalla formazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi preesistenti ed è regolata da diverse vie di segnalazione. Il più importante di questi è il pathway VEGF. VEGF è rilasciato dalle cellule ischemiche e porta alla apertura di angiogenico spuntano nei vasi sanguigni circostanti. La cellula endoteliale leader da un nuovo germoglio vascolare è una 'punta' cellula, che produce filopodi che raggiunge fuori verso la sorgente di VEGF, ed è seguita da proliferazione delle cellule endoteliali 'gambo'. In questo modo, le cellule endoteliali attivate migrano e proliferano verso una regione avascolare dove formano nuovi tubi vascolari. Al fine di stabilizzare questi tubi per sostenere il flusso di sangue, cellule endoteliali interagiscono con periciti e cellule muscolari lisce, che circondano i nuovi vasi sanguigni 1. Angiogenesi è essenziale per vascolarizzazione dell'embrione e tessuti in crescita. Tuttavia, essa contribuisce anche a molti patologicodisturbi cal come il cancro; che difetti di angiogenesi sono associati a malattie ischemiche. Lo sviluppo di trattamenti farmacologici efficaci per regolare l'angiogenesi come mezzo di trattamento malattia è quindi di grande interesse. Per esempio, efficaci fattori anti-angiogenici ridurranno la crescita del cancro, mentre strategie pro-angiogenici possono essere usati per trattare la malattia ischemica. Così, i modelli di angiogenesi sono essenziali per comprendere meglio la regolazione della formazione di nuovi vasi e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per migliorare o ridurre la crescita vascolare.
Un elemento fondamentale della ricerca angiogenesi è la scelta di un modello appropriato vascolare. Molti modelli in vitro sono stati progettati per riprodurre i passi base dell'angiogenesi come la migrazione delle cellule endoteliali, la proliferazione e la sopravvivenza 2,3. Un frequentemente utilizzati saggio in vitro è la formazione di una rete ramificata di cellule endoteliali su una matrice in Matrigel, sebbene til suo non è specifico per le cellule endoteliali, né di solito incorporano il supporto di periciti o cellule muscolari lisce. Valutazione della ex vivo germinazione angiogenesi usando organo cultura mouse, ad esempio, il saggio corpo embrioide, il saggio anello aortico e il saggio metatarso fetale permette l'analisi di angiogenesi delle cellule endoteliali nel contesto delle cellule di supporto aggiuntivi. Tuttavia, le limitazioni principali di questi saggi comprendono la mancanza di flusso di sangue e la regressione dei vasi nel tempo, dando una limitata finestra di analisi. Pertanto, per comprendere la regolazione dell'angiogenesi, più precisamente, in modelli in vivo sono necessari come quelli sviluppati nel topo usando spugne impiantati sottocute o spine matrigel, così come il modello di ischemia dell'arto posteriore. Tuttavia, questi modelli sono difficili da analizzare a causa della complessa architettura 3D del neovasi. In contrasto, l'embrione zebrafish è dimostrato un modello eccellente per visualizzare angiogenesi in tuttamicrorganismo 4. Tuttavia, il topo è evolutivamente molto più strettamente correlato umano rispetto zebrafish, rendendo così il mouse un modello preferito in molti casi. Conseguentemente angiogenesi della retina topo postnatale rappresenta un metodo ben caratterizzato di scelta per la ricerca angiogenesi. Esso non solo fornisce un ambiente fisiologico, ma anche un 2D plesso vascolare che può essere facilmente visualizzato per mezzo di macchie fluorescenti appropriati. L'architettura della rete nave, proliferazione endoteliale, crescita, reclutamento di cellule perivascolari e vaso rimodellamento possono tutti essere studiata utilizzando questa tecnica.
Nella retina neonatale topo, lo sviluppo dei vasi retinici avviene nella prima settimana di vita postnatale. I topi, a differenza degli umani, nascono ciechi e le retine diventano solo vascolarizzato dopo la nascita. Vasi retinici nascono dal centro della retina vicino al nervo ottico al giorno postnatale 0 (P0), e si sviluppano da angiogenesi per formare un altamente organizzared plesso vascolare che raggiunge la periferia retinica di circa 5 P8. I vasi sanguigni si sviluppano in modo caratteristico con il plesso capillare gradualmente crescente verso l'esterno del disco ottico verso la periferia per generare un normale modello di alternanza delle arterie e delle vene, con una rete capillare di intervenire. La vascolarizzazione della retina fornisce un modello ideale per studiare l'angiogenesi come i vasi possono essere facilmente identificati come crescono in quello che è essenzialmente un piano 2D, rendendo così relativamente facile per esaminare la vascolarizzazione retinica nei preparati TV a montaggio 5. Un metodo per isolare il mouse retina neonatale per analisi delle risposte delle cellule endoteliali punta su diverse ore ex vivo è stato riportato 6. In alternativa, un esame più dettagliato di tutto il sistema vascolare della retina e marcatori vascolari associate richiede immunoistochimica di campioni di retina fisse a diversi stadi di sviluppo.
Qui forniamouna descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per tutta la colorazione monte della retina murina plesso vascolare, dalla enucleazione iniziale dell'occhio postnatale (vedere anche 7) attraverso i protocolli di colorazione per l'imaging finale al microscopio.
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Protocol
Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.
1. Enucleazione e la fissazione di postnatali Occhi
- Posizionare il mouse eutanasia cucciolo su un lato, togliere la pelle che copre gli occhi con le forbici.
- Utilizzare forbici e pinze per enucleare l'occhio.
- Luogo forbici sotto l'occhio enucleato, tagliare il nervo ottico e dei tessuti circostanti e sollevare l'occhio. Trasferire in una piastra a 24 pozzetti contenente 4% paraformaldeide (PFA) composto 2x in PBS a temperatura ambiente.
- Consentire ad ogni occhio di fissare per il 10 - 15 min, poi trasferimento al freddo 2x PBS in ghiaccio per 5 - 10 min. È meglio sfalsare enucleazioni e fissazione successiva per garantire il grado di fissazione è uguale per ogni occhio.
2. Dissezione di postnatali retine murini
- Trasferire gli occhi in una capsula di Petri contenente 2x PBS utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro e posto sotto una diffuamen microscopio.
- Rimuovere eventuale grasso intorno all'occhio con pinze e forbici.
- Pierce il bordo della cornea con forbici affilate e tagliare intorno alla cornea e iride e scartare.
- Inserire pinza tra retina e la sclera e rimuovere la sclera facendo attenzione a non strappare la retina. Lo strato coroide può anche essere rimosso, ma se vi è il rischio di danni alla retina occorrono durante tale fase, lo strato coroide può essere lasciato in quanto non dovrebbe influenzare significativamente la qualità della immunocolorazione.
- Rimuovere la lente e l'umor vitreo con pinze.
- Rimuovere i vasi hyaloids raccogliendo insieme nel centro dell'occhio con una pinza sottile poi rapidamente allontanarsi dal centro della retina (in alternativa snip alla base dei vasi hyaloid con le forbici sottili).
- Sciacquare la retina a forma di coppa con PBS in un piatto pulito Petri.
- Fare 4 a 5 incisioni radiali raggiungono circa 2/3 del raggio della retina mediante molla scissors creare una forma 'petalo'.
- Erogare PBS utilizzando una pipetta Pasteur per appiattire la retina, e quindi rimuovere l'eccesso di PBS con un piccolo pezzo di carta assorbente.
- Lentamente pipetta freddo (-20 ° C) il metanolo goccia a goccia sulla superficie della retina fino totalmente coperto e poi alluvione con ulteriore metanolo. Ciò contribuirà a risolvere le retine e faciliterà permeabilizzazione. Le retine diventeranno bianche.
- Trasferire in una provetta 2 ml utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro.
- Lascia retina in metanolo freddo per almeno 20 minuti prima di procedere con immunoistochimica. Degli anticorpi usati qui, solo VE-Caderina non può essere utilizzato con successo su metanolo retine fissi. In questo caso le retine devono proseguire dritto dell'immunocolorazione dopo il punto 9.
- Se necessario, le retine può essere conservato in metanolo a -20 ° C fino a diversi mesi prima della colorazione.
3. Immuno / colorazione isolectin della retina Vascuslatore
- Rimuovere con attenzione / versare via metanolo e delicatamente risciacquare retine brevemente in PBS (in questa fase la retina è ancora nella stessa 2 ml di tubo dal punto 11 di cui sopra).
- Rimuovere PBS e copertura retine con 100 ml di soluzione di Perm / blocchi (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% di siero appropriato (cfr. tabella 1) e agitare delicatamente per 1 ora.
- Rimuovere Perm / Blocca e incubare retine agitando delicatamente la notte a 4 ° C con 100 ml di anticorpi primari selezionati (vedi Tabella 1) e / o IsolectinB4, tutti preparati diluendo a Perm / blocchi.
- Rimuovere anticorpo / isolectin e lavare retine 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTx).
- In alcuni casi, per esempio seguente colorazione con IsolectinB4-Alexa488 o un anticorpo primario direttamente coniugato, non è richiesto un anticorpo secondario e retine può essere montato direttamente (fase 7). Quando un anticorpo primario non coniugato è stato utilizzato nel passaggio 3, poi 100 microlitri della appropriata FluorÈ aggiunto anticorpo secondario escent (diluito 1/200 in PBSTx) e lasciata incubare una notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere anticorpo secondario e lavare retine 4 x 15 min in 2 ml PBSTx.
- Trasferire retine su vetrini utilizzando un ampio foro di plastica pipetta Pasteur e rimuovere l'eccesso PBSTx con tessuto assorbente. Mount retine con l'aggiunta di 50 ml di prolungare mezzo di montaggio su un vetrino e delicatamente posizione sopra la retina.
- Trasferimento scivola al frigorifero per una notte a 4 ° C, assicurando che siano piatte e al riparo dalla luce, per consentire al Prolungare montante per impostare.
- Retina immagine utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza.
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Representative Results
Dopo la dissezione della retina dovrebbe apparire come un fiore piatto (Figura 1). Utilizzando il protocollo, di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando isolectin colorazione B4-Alexa488 e sostenendo cellule muscolari vascolari sono visualizzati tramite actina muscolo liscio anti-alfa (Figura 2). La vista a bassa potenza usando un obiettivo 5X in figura 2 consente una visione d'insieme dell'organizzazione vascolare della retina. Inoltre, utilizzando una diversa combinazione di anticorpi indicati nel protocollo di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando immunocolorazione anti-CD31 e periciti supporto sono visti utilizzando anticorpi contro NG2 (Figura 3) o desmina (Figura 4). Colorazione anti-desmina è utile per la visualizzazione del dito come processi degli periciti e determinare se essi sono strettamente associati con le cellule endoteliali. In contrasto, colorazione anti-NG2 delinea i nuclei di ciascun periciti, che è utile quandoquantificare il numero di cellule periciti sul sistema vascolare. Ciò sarebbe fatta contando il numero di cellule per campo visivo usando una potenza elevata (ad esempio 60X) obiettivo. Se richiesto, combinazioni alternative di anticorpi possono essere utilizzati anche (vedi tabella 1), per esempio, anti-collagene IV è utile per la visualizzazione della membrana basale vascolare. Retine che sono stati macchiati per le cellule endoteliali possono essere analizzati per le caratteristiche chiave di angiogenesi, quali la progressione della vascolarizzazione dal centro verso il bordo della retina, la densità vascolare e la frequenza ramificazione vaso.
Figura 1. Aspetto di una retina neonatale immediatamente dopo la dissezione e l'aggiunta di metanolo. Questa immagine è scattata con un Zeiss Stemi SV6 e AxioCam HR fotocamera c.
Figura 2. Immunostaining di tutto il monte retine (età P7) con isolectin B4-Alexa488 (verde) (A), anti-alfa-actina del muscolo liscio Cy3 (rosso) (B), o risultante dalla fusione (C). Queste immagini sono prese con una Zeiss axioimager e AxioCam fotocamera HRM usando un obiettivo 5X. Si noti il modello di alternanza di arterie e vene. Le arterie sono riconosciuti dalla zona franca capillare che li circonda immediatamente, e sono rivestite di cellule muscolari lisce che macchiano positivo (rosso) per l'alfa actina del muscolo liscio. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 3 Doppia immunocolorazione di montare tutto retine (età P6) con anticorpo primario anti-CD31 (rilevata con anticorpi anti-IgG di topo coniugato a Alexa488, verde, A). Ed anticorpo primario anti-NG2, rilevata con IgG anti-coniglio coniugato Alexa 594 (rosso, B). Queste immagini confocale sono state scattate con un obiettivo 60X combina le immagini di scansione laser da 13 z fette, ciascuna di 0,47 micron di spessore. Una sovrapposizione di immagini in C mostra cellule endoteliali CD31-positive (verde) e periciti NG2-positive (rosso). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4 Double immunocolorazione di montare tutto retine (età P6) con anticorpo primario anti-CD31 (rilevata con anticorpi anti-IgG di topo coniugato a Alexa488, verde, A). Ed anticorpo primario anti-desmina, rilevata con IgG anti-coniglio coniugato Alexa 594 (rosso, B). Queste immagini confocale sono state scattate con un obiettivo 60X combina le immagini di scansione laser da 21 z fette, ciascuna di 0,24 micron di spessore. Una sovrapposizione di immagini in C mostra cellule endoteliali CD31-positive (verde) e periciti desmin-positivo (rosso). Clicca qui per ingrandire la figura .
| Anticorpo primario | Diluizione di lavoro | Blocco soluzione (Serum + Perm / blocchi) | Anticorpo secondario |
| Anti-NG2 (Condroitin solfato proteoglicani) 1:250 | 5% siero di capra | Capra anti coniglio Alexa 594 | |
| Anti-GFAP | 1:500 | 5% siero di capra | Capra anti topo Alexa 488 |
| Anti-Desmina | 1:500 | 5% siero di capra | Capra anti coniglio Alexa 594 |
| Anti-collagene IV | 1:200 | 5% siero di capra | Capra anti coniglio Alexa 594 |
| Anti-Endoglina | 1:100 | 5% siero di capra | Capra anti ratto Alexa 594 |
| Anti-CD31 | 1:500 | 5% siero di capra | Capra anti ratto Alexa 488 |
| Anti-VE-caderina | 01:10 | 5% siero di capra | Capra anti ratto Alexa 594 |
| Anti-Alk1 | 01:25 | 5% di siero asino | Asino di capra anti Alexa 594 |
| Anti-ASMA-Cy5 | 1:100 | <td> Perm Block soloN / A |
Tabella 1. Esempi di anticorpi primari per la colorazione di immunofluorescenza di intere retine mount.
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Discussion
Il metodo qui presentato offre un modo semplice ed efficace per ottenere immagini colorate preparativi monte intero di retine neonatali del mouse, il che rende un modello facilmente quantificabile e fisiologicamente rilevanti di angiogenesi. Inizialmente, l'occhio del mouse può essere molto difficile da sezionare grazie alle sue piccole dimensioni e la forma globo, quindi sono necessarie una certa pratica e di buoni strumenti di dissezione per risultati affidabili. Dissezione di occhi preparati in 2x concentrazione di PBS è importante perché questo provoca una piccola quantità di perdita di acqua dall'occhio e riduce la pressione intra-orbitale, che facilita la dissezione. Buona preparazione della retina è importante per diverse ragioni. Prima mantiene l'integrità del sistema vascolare. Secondo, se il sistema vascolare hyaloid non è ben rimosso riduce l'efficienza della colorazione anticorpale, portando ad alti livelli di background e diminuita risoluzione. Questo problema può verificarsi anche se la PFA tempo di fissazione della retina è troppo lunga. Tuttavia,prima della colorazione, stoccaggio a lungo termine fino a diversi mesi di metanolo nel -20 ° C congelatore è previsto prima della colorazione isolectin e per la maggior parte degli anticorpi in Tabella 1. Sebbene colorazione isolectin è raramente problematico, lo fa macrofagi macchia in aggiunta alle cellule endoteliali. Per buona immunocolorazione di montare tutto retine, la scelta di anticorpi è critica e il protocollo di colorazione deve essere adattato in funzione della specificità dell'anticorpo e la concentrazione, che può variare tra i lotti quando si usano anticorpi policlonali. Alta sfondo di solito può essere ridotta abbassando la concentrazione di anticorpi, aumentando il tempo di lavaggio o l'aggiunta di più detergente alle fasi di lavaggio. Anticorpi che un'aliquota all'arrivo e memorizzate come indicato dal costruttore. Per coloro che sono conservati a -20 ° C, una aliquota di lavoro viene conservato in frigorifero per evitare cicli ripetuti di congelamento scongelamento. Se le macchie fluorescenti luminosi appaiono sul campione macchiato, soprattutto se questo è presente anchenella regione intorno al tessuto, questo suggerisce aggregati precipitati di anticorpi sono presenti che dovrebbe essere rimosso in tutti gli esperimenti successivi mediante centrifugazione per l'anticorpo 10,000 rpm per 5 minuti prima dell'uso. Alcuni degli anticorpi attualmente utilizzati dai nostri laboratori sono in elenco dei materiali con la diluizione appropriata (Tabella 1). La scelta di una combinazione compatibile di anticorpi è molto importante per evitare indesiderate reazioni crociate tra anticorpi primari e secondari. La proliferazione cellulare può essere monitorato iniettando topi con una soluzione di BrdU circa due ore prima della raccolta del tessuto. Questo analogo timina è incorporato nel DNA proliferanti e può essere rilevato utilizzando un anticorpo anti-BrdU, come descritto in precedenza 8.
Ogni retina è molto fragile, ma può essere colorato per diversi marcatori vascolari trattando il tessuto delicatamente mentre lavorano attraverso il protocollo. Un certo numero di controlli sono inclusi nellaogni esperimento per mostrare la specificità della colorazione. Retine non trattati rivelerà il grado di autofluorescenza nel tessuto, che dovrebbe essere minimo. Una alcun controllo anticorpo primario consentirà di determinare il legame non specifico dell'anticorpo secondario al tessuto. Retine che sono stati accidentalmente strappate durante la dissezione possono fornire tessuto utile per i controlli. Dopo il montaggio, colorazione fluorescente viene mantenuto per diversi giorni finchè i vetrini vengono conservati a 4 ° C al buio. Imaging mediante microscopia ad epifluorescenza è migliorata con l'uso di un apotome, che rimuove fuori fuoco luce. Alternativamente, microscopia confocale fornisce accurate imaging cellulare-specifica (figure 3 e 4).
Questo metodo ha molte possibili applicazioni. Può essere applicata a topi in cui i geni chiave che regolano l'angiogenesi sono esaurite, compreso il lavoro che utilizza inducibile Cre-loxP genetica 8-10. Alternativamente angiogenesi retinica può essereseguenti trattamenti farmacologici interrogati consegnati sia sistemica o intra-ocularly per indagare i loro pro-o anti-angiogenica effetti 11. E 'inoltre possibile usufruire di strumenti transgenici disponibili e utilizzare GFP o RFP topi transgenici per visualizzare elementi chiave del sistema vascolare retinico 11,12. (Si noti che utilizzando fissazione PFA 4% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente viene usato al posto del metanolo per passo 2.12 del protocollo prima di imaging endogena GFP o RFP in retine di topi transgenici.) Inoltre, al fine di studiare segnali molecolari meccanismi, è utile per visualizzare l'espressione di mRNA di geni specifici nel plesso retinica mediante ibridazione in situ 13.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust e della British Heart Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R | |
References
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