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Neuroscience

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

doi: 10.3791/50557 Published: March 31, 2014

Summary

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

Abstract

기능 신경 말단에서 시냅스 소포는 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스를 받고있다. 이 시냅스 소포 재활용 효과적으로 막 매출을 공개 스티 FM 염료를 사용하여 분석 할 수 있습니다. FM 염료의 사용을위한 종래의 프로토콜이 자극 (유발) 시냅스 활성 다음 뉴런을 분석을 위해 설계되었다. 최근 프로토콜은 자연 또는 소형 시냅스 이벤트와 같은 약한 시냅스 활동을 함께 FM 신호 분석을위한 유효하게되었다. FM 신호의 이러한 작은 변화의 분석 영상 시스템은 강도의 작은 변화를 감지하기에 충분히 민감하다, 그러나 큰 진폭의 인공적인 변화가 억제되어 있어야합니다. 여기서 우리는, 유발 자발 및 미니어처 시냅스 활동, 예를 들어 배양 된 해마 뉴런을 사용하여 적용 할 수있는 프로토콜을 설명한다. 이것은 중요하다으로서이 프로토콜은 또한, FM 염료의 광표백의 속도를 평가하는 수단을 포함강도의 작은 변화 이미징 유물의 소스.

Introduction

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시냅스 소포의 기능은 시냅스 전달의 중요한 결정 요인이다. 그들은 시냅스 세포막 (세포 외 유출)와 융합 할 때이 소포는 신경 전달 물질을 방출, 그들은 세포막 (엔도 사이토 시스)에서 재생과 신경 전달 물질로 다시로드 된 후 릴리스의 또 다른 사이클에 대한 준비가되어 있습니다. 의 역학과 시냅스 소포 재활용을 기본 메커니즘에 대한 연구는 크게 스티 FM 염료 (1)의 도입에 의해 가속화되었다. 긍정적으로 (그림 1A, 그림 1B의 FM1-43 stereoview에서 여러 염료) 친수성 머리 그룹과 소수성 꼬리가 청구 한이 양친 매성 분자는 가역적으로 입력을 침투하지 않고 지질 세포막을 종료 할 수 있습니다. FM 염료의 그룹들이 방출하는 빛의 범위에 영향을 미치는 유사한 기능을 공유 할 수 있습니다. 예를 들어, FM2-10, FM1-43, 및 FM1-84는 두 개의 고리 형 화합물과 슈 사이에 하나의 이중 결합이w 녹색 방출. 그들 사이의 차이는 소수성을 결정하고, 따라서 멤브레인으로부터 출구의 비율 (departitioning) 소수성 꼬리의 길이이다. FM5-95 및 FM4-64의 경우, 세 개의 이중 결합 사이 클릭 화합물을 연결, 그들은 적색 발광을 보여줍니다. 이 염료는 친수성 ​​부분에 대한 차이가 있습니다. 그들은 인해 친수성 ​​환경 소수성 환경 상대 양자 수율 증가, 생체막에 삽입 될 때 모든 FM 염료에서, 형광 강도가 증가한다. 따라서 FM 강도의 변화는 막 회전율의 변화를 나타냅니다. 다른 색 (발광 스펙트럼)과 hydrophobicities는 FM이 시냅스 소포 재활용의 다양한 연구 도구 염료합니다.

이러한 기능을 바탕으로, FM 염료는 대부분 시냅스 소포 재활용 분석을 다음과 같은 방식 (그림 2)에 따라 사용됩니다. 신경그들은 엔도 시토 시스 (염색)을 통해 형태로의는 시냅스 소포 (의 SV)에 채택되기에 가능, FM 염료를 포함하는 세포 외 용액에 목욕을합니다. 염료는 염료가없는 세포 외 용액을인가함으로써 세척하고, 이것은 만 활발히 진행 엔도 시토 시스는 염료 (도 2 하단)으로로드 된 시냅스 소포의 클러스터를 포함 할 기능적 신경 말단을 보여준다. 이후의 세포 외 유출은 세포 외 공간으로 FM 염료의 손실과 형광의 수반하는 손실로 연결 (destaining; 인해 친수성 ​​환경에 departitioning 멀리 세포 외 유출의 사이트에서 확산 둘 다). 따라서 FM의 형광 강도의 변화는 시냅스 소포 엑소와 엔도 사이토 시스의 지표입니다.

FM 염료는 다양한 생물과 준비 2,3에있는 시냅스 소포를 얼룩 destain하는 데 사용되었습니다. 예를 들면 포유류 neur 포함ONAL 문화 4-9, 포유류의 뇌 조각 10, 11, 신경 근육 접합부 (12, 13), 망막 바이폴라 뉴런 14, 15,16 달팽이관의 유모 세포.

일반적으로 실험, 염색 및 destaining 모두 광범위 뉴런 (유발 활동을) 자극에 의​​해 트리거됩니다. 외부 자극 (자연과 소형 시냅스 활동) 9,17-19의 부재에서 재활용을 가지고 최근에, 그러나, 약한 자극에 대한 응답으로 시냅스 소포 재활용도 분석하고있다. 자연과 소형 시냅스 활동은 활동 전위의 자연 발화 (그림 3)을 포함하는 이전에, 외부 자극의 부재에서 발생하는 것과 같이 정의된다. 이러한 약한 시냅스 활동은 다양한 자극에 의​​해 트리거보다 FM 신호의 작은 변화와 관련되어있다. 측정을 요구하는 FM의 fluoresc의 변화줬어 강도는 정확하게 시냅스 소포 세포 외 유출 또는 엔도 시토 시스하지만 강도 인공적하지 않은 변경 사항을 반영합니다. 이슈의 원인 중 하나는 FM 염료에 의한 세포막의 비특이적 염색의 존재이다. 이 구성 요소의 점진적 유실이 잘못 시냅스 활동에 기인한다 측정 된 형광 강도의 점진적인 변화로 이어질 것입니다. 이 계수는 (프로토콜 참조) 적절한 방법에 의해 감소​​ 될 수있다. 이슈의 가장 주목할만한 원인은 시냅스 소포 내에 유지 FM 염료의 광표백입니다. FM 강도 광표백 관련된 변화를 측정하는 생물 (시냅스)의 변화에​​ 비해 작아야한다. 민감한 카메라의 최근의 개발은, 예를 들면 전자 승산 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라가 가능한 노광 시간을 단축하고 형광체를 여기 시키는데 사용되는 빛의 강도를 약화 photobleaching에 의해 최소화 할 수있다. 이슈의 또 다른 원인은 드리프트의 iN 광학 현미경의 초점 수준. 촬상 세션 동안 포커스 드리프트는 기계적 또는 열 효과에 의해 야기 될 수 있고, 잘못 측정 된 형광 강도의 변화로 이어질 것이다.

여기에서 우리는 가능한 특히, 소형 시냅스 활성, 약한 또는 전혀 자극의 컨텍스트에서 시냅스 소포 재활용을 분석하는 FM 염료를 사용할 수 있도록 프로토콜 및 장비를 설명한다. 우리는 배양 된 쥐의 해마 신경 세포를 사용하고 destaining 단계 이미징, 유발과 자발적인 시냅스 이벤트 기간 동안 소포의 염색과 destaining의 예를 보여줍니다. 또한 인하여 시냅스 활동에 대한 FM 염료 손실의 부재에서, FM 염료 광표백의 정도를 평가하는 방법을 설명한다.

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Protocol

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1. 포유류의 뇌에서 뉴런의 차 문화

본 연구에서 수행 된 모든 동물의 절차는 아이오와 대학의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.

  1. 출생 후 0-1 일 (19, 20)에 CA3-CA1 쥐에서 해마의 영역 또는 쥐의 해리 세포 배양을 준비합니다. 24 잘 접시에 쥐 아교 공급 층으로 미리 설정 12 mm의 coverslips는 (두께 번호 0)에 12,000 세포 / 웰의 밀도로 해마 세포를 접시.
  2. 문화 기능 신경 터미널까지 8 일 동안 해마의 신경 세포는 21을 개발. 각각의 신경 말단이 훨씬 클러스터링하지 않고 상대적으로 고립 된 경우 우리는 시험 관내 11 내지 14에 날에 신경을 사용합니다. 신경 세포는 체외 예 Willig 등. 22 Nosyreva 및 Kavalali (23)에 대한 21~28일까지 실험에 사용 할 수 있습니다.
  3. 에기능 연구, 투과광 현미경 (10-20X의 배율 예를 들어 위상 콘트라스트 광학)를 사용하여 건강한 뉴런의 지표에 대해 (염색 전) 커버 슬립을 평가. 건강의 지표는 다음과 같습니다 균일 아교 세포 층, 신경 주위에 명확한 세포 마진, 파란색 구조없이 확장 수상 돌기, 클러스터 인 somata의 부족, 그리고 번들 신경 돌기의 부족.

2. FM 염료와 시냅틱 소포 (염색을)로드

  1. 때문에 전기장 자극에 의​​해 유발 된 시냅스 활동에 염색 (활동 전위를 포함한다)
    1. HEPES 기반의 염료 무료 솔루션에 FM 염료를 추가하여 용액 1을 염색 준비, 예를 들어 타이로드의 솔루션 (자세한 내용은 솔루션을 참조하십시오). FM 염료의 농도는 10 μM FM1-43, 2.5 μM FM4-64입니다. 일반적인 농도 범위는 다음과 같습니다 : 2-15 μm의 FM1-43, 또는 2.5-20 μM FM4-64 3,6. 재발의 억제를 요구하는 실험글루타메이트 시냅스 활동과 시냅스 가소성의 유도는, 더 이온 성 글루타메이트 수용체의 길항제를 추가 AMPA 수용체 (예를 들어, 10 μM CNQX)와 NMDA 수용체 (예를 들어, 50 μM AP5).
    2. 배지에서 일반 타이로드의 솔루션으로 채워져 이미징 챔버에 세포와 커버 슬립을 전송합니다. 우리는 측벽 (백금 와이어가 6.3 mm, RC-21BRFS으로 구분)에 부착 된 자극 전극 촬상 챔버를 사용한다. 이 챔버는 ~ 200 μL의 목욕 볼륨, 폐쇄 이미징 챔버로 설계하지만, 우리는 (상단 커버 슬립이없는 예) 오픈 챔버로 사용된다. 전송하는 동안 공기에 배양 된 세포를 노출하고, 핀셋 (중심 부근의 coverslip의 경계에서 최대가 아닌 선택)로 배양 된 세포를 곤란하게 피하지 않는다.
    3. 실내 온도 (23-25​​ ℃)에서 일반 타이로드의 솔루션으로 이미징 챔버를 Perfuse.
    4. 공동으로 솔루션 1 염색 적용nstant 관류.
    5. 전기 펄스를 적용하여 시냅스 활동을 보여주고 있습니다. 해마 신경 세포의 시냅스 소포의 총 재활용 풀의 최대 염색의 경우, 60 ~ 120 초 (24) 10 Hz에서 문화를 자극한다. 필드 자극의 최대 효율을 달성하려고 할 때 마음에 몇 가지 기능을 유지합니다. 뉴런을 유지하고 완전히) 살아있는 뉴런을 계속하고 균일 한 전기장을 얻기 위해 타이로드의 용액 (의 얇은 층에 침지 전극을 자극하고있는 동안 1) 욕 용액 높이는 가능한 한 낮아야한다. 2) 현재 강도와 지속 시간은, 예를 들어, 형광 칼슘 2 + 영상 신경 흥분의 지표를 사용하여 최적화되어야한다 우리의 경우, 30mA 강도와 1 밀리 초 기간의 일정한 전류가 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다. 3) 목욕 솔루션을 자극하는 동안 일정한 흐름에 적용되어야하며, 전기 자극은 양성자의 원인이 전기 리드 (H 등 행크스 '균형 소금 솔루션)이 포함 된 솔루션을 통해 백 개 이상의 몇 가지 펄스를 전달하여 별도의 실험에서 산성화를 확인합니다.
    6. 포스트 자극 엔도 시토 시스 (25)를 완료 할 수 있도록 필드 자극이 종결 된 후 추가로 60 초 동안 염색 액 (1)에 신경을 둡니다.
    7. (세척 용액 1, 염료 무료 타이로드의 솔루션 플러스 AMPA 수용체와 NMDA 수용체 (섹션 2.1.1 참조)의 길항제 및 전압 의존 나 + 채널 차단제로 관류하여 이미징 챔버 밖으로 염색 액을 씻어 예를 들어, 0.5 μM의 테트로도톡신, TTX). 차단제의 조합은 자발적의 시냅스 활성을 통해 FM 염료의 손실을 억제 할 것이다. 세척 효율을 최대화하기 위해 관류 비율 (<증가EM> 예를 들어, 최대 1-2 분, 그리고 피펫을 사용하여 수동으로 열려있는 영상 실에 직접 솔루션을 세척 1의 알약 (예를 들어, 1 ㎖)를 추가 할 경우) 5 ~ 6 ㎖ / 분이다. 배양 된 뉴런을 방해하지 않도록, 수동 주입의 강도와 방향을 제어합니다.
  2. 때문에 높은 K + 솔루션에 의해 유발 된 시냅스 활동에 염색 (활동 전위를 포함하지 않습니다.)
    1. 하이-K + 타이로드의 솔루션에 FM 염료를 추가하여 솔루션이 염색 준비합니다. 특히, NaCl을위한의 KCl의 몰 치환, 45 mM의 KCl을 함께 수정 된 타이로드의 솔루션을 준비합니다. 필요한 경우, AMPA와 NMDA 수용체의 길항제를 추가합니다. 이러한 높은-K + 용액을 연속적 뉴런을 탈분극 신경 말단으로 칼슘 2 + 유입을 가능하게하고, 최대 26 정도에 시냅스 소포 세포 외 유출을 개시 할 것이다. 높은 농도 (70 ~ 90 밀리미터)도 Klingauf 등. 27 다른 보고서에 사용 된D 리차드 등. 28
    2. 배지에서 일반 타이로드의 솔루션으로 채워져 이미징 챔버로 배양 된 뉴런의 coverslip을 전송합니다.
    3. 일정한 관류에 염색 용액 (2)을 도포 또는 피펫 (26, 28)를 사용하여 1 ~ 2 분 동안 실온에서 뉴런 얼룩. 후자의 경우, 최종 염료 농도는 염료 용액의 자유 알려진 부피의 염색 용액 (2)의 공지 된 양을 추가로 제어한다.
    4. 섹션 2.1.7에 설명 된대로 이미징 챔버 밖으로 염색 솔루션을 씻으십시오.
  3. 자연과 소형 시냅스 활동으로 인해 염색.
    1. 60 분 동안 문화 인큐베이터에 배치하여 37 ° C에 Prewarm 중탄산 기반 솔루션 (예 : 최소 필수 중간, MEM).
    2. 자연 시냅스 활동을 기반으로 염색의 경우, MEM에 FM 염료를 첨가하여 염색 액 3를 준비합니다. 염색을위한 M에 근거시냅스 활동 iniature, 염색 액 3 TTX를 추가하여 염색 액 4를 준비합니다.
    3. 해결 방법 3 또는 4를 염색하는 배지에서 배양 된 뉴런 coverslip에 전송하고, 10 분 동안 37 ° C에서 같은 염색 용액을 떠나으로 얼룩 신경.
    4. 솔루션 세척 1에 간략하게 커버 슬립을 씻어.
    5. 영상 실에서 솔루션 세척 1에 커버 슬립을 전송합니다. 마음에 다음과 같은 사항을주의해야합니다. 1) 세포를 공기에 노출되지 않도록, 필요에 따라, 세척없이 촬상 챔버에 직접 커버 슬립을 전송. 2) 뉴런 HEPES 계 용액으로 염색 용액 3 또는 4로 대체하여 실온에서 염색 할 수있다. 3) 뉴런 염색 용액이 함께 염색 용액 3 또는 4를 대체하고, 실온에서의 나머지 단계를 수행하여,이 방법을 사용하여 하이-K + 용액의 맥락에서 유발 된 시냅스 행위 얼룩이 질 수있다.
    6. 영상 밖으로 염색 액을 씻어섹션 2.1.7에 설명 된 챔버로.

3. FM 염료를 세척

  1. 상술 한 방법 (섹션 2.1.7) 중 어느 신경 염색 및 초기 세정 후, 실온에서 50-10 분 동안 용액으로 세척 1 촬상 챔버 perfuse 계속. 이것은 세포막 및 세포 외 용액으로부터 FM 염료를 제거한다. 우리 촬상 챔버의 경우, 목욕 관류 속도는 600-1,200 μL / 분이다. 세탁 인해 시냅스 활동 (17)에 FM 염료 손실을 억제하기 위해 세포 외 칼슘 2 +의 부재 하에서 수행 될 수있다. 세척은 Advasep-7 세포막 29-31에서 FM 염료 소제로서의 개질 사이클로 덱스트린의 간단한 애플리케이션에 의해 강화 될 수있다. 그것은 모두 FM의 puncta에 (31)의 강도를 줄이고 혜를 손상시키지 않도록 (단일 층 문화의 경우에 예를 들면 5 초) 모든 Advasep-7 노출 짧은을 유지하기 위해 매우 중요합니다셀 LTH. 원형질막에 FM1-43에서 형광도 시냅스 소포 (32)을 입력하지 않는 소광 sulforhodamine 101 (50-100 μM)의 응용 프로그램에 의해 억제 될 수있다.

4. 세탁시 최적의 이미지 필드를 검색

  1. 이미지에 표시 할 필드의 세포는 높은 배율과 높은 수치 조리개 대물 렌즈 (예를 들면 40 배)로 전송 광학 현미경을 사용하여, 건강한 있는지 확인합니다. 이 섹션에서, 우리는 위상차 또는 미분 간섭 대비 광학 장착 거꾸로 현미경 (이클립스 티, 니콘)을 계속 사용합니다. 이 현미경은 현미경의 초점 드리프트를 극복 연속, 실시간 초점 보정을 가능 완벽한 초점 시스템 (PFS)을 갖추고있다. 이 기능은 동일한 초점 평면과 destaining 동안 시간 경과 영상을 위해 필수적이다.
  2. 그 염색 형광 광학계를 사용하여, 효과가 확인한다. AVFM의 puncta에의 OID 집계 개별 BOUTONS 분별하기 어려울 것이기 때문에 그들은 연구의 대상이 아니라면. FM의 puncta에의 모양에주의 : 스테인드 BOUTONS의 대부분은 원형 구슬의 문자열로 표시하는 경우, 그들은 건강에 해로운 신경 터미널을 나타낼 수 있습니다. 광표백을 피하기 위하여 강한 형광 여기에 뉴런의 노출을 최소화한다.

5. 시냅틱 소포에서 FM 염료를 언로드 (Destaining)

  1. 전기장 자극에 의​​해 유발 된 시냅스의 활동으로 인해 Destaining.
    1. 세척 TTX (솔루션 세척 1 등 만 TTX없이 동일) 세정 용액 2 광범위하게 신경을 관류에 의해. 필드의 자극에 의해 유도 된 세포 내 칼슘 2 + 과도 + 영상, 또는 볼트의 패치 클램프 녹음에 의해 형광 칼슘에 의해 예를 들어 같은 세정 매개 변수 (관류 속도와 지속 시간)을 사용하여, 별도의 실험에서 TTX 유실의 유효성을 확인나이에 따라 나 + 전류.
    2. FM 염료 이미징 시작합니다. FM1-43 또는 FM4-64 이미징의 경우, 520 나노 미터 또는 650 nm의 긴 패스를 방출 필터, 각각 및 490 nm의 여기 필터를 사용합니다. 짧은 노출 시간 (예 : 10 ~ 20 밀리 초), 약한 자극 강도 (예 : LED 전력의 5 ~ 10 %), 높은 감도 (예 : EM 게인)을 사용하여, 이미지마다 1 ~ 2 초를 취득. 노출 시간 및 형광 흥분의 강도를 감소시킴으로써 FM 염료의 광표백 최소화. 완벽한 초점 시스템을 설정하여 현미경 초점 드리프트를 최소화합니다.
    3. (120 초 동안 10 Hz에서 예) 현장 자극을 사용하여, 20 솔루션 2 세척에 신경을 자극한다.
    4. FM 염료의 모든 재활용 시냅스 소포를 고갈, 1 ~ 2 분의 중간 휴식 시간에, 자극의 여러 라운드를 적용합니다. 일에 FM 염료로 염색 된 시냅스 소포의 총 재활용 풀의 크기를 평가할 때 중요하다전자 이전 상태 20,33.
  2. 인해 시냅스 활동 Destaining은 활동 전위의 부재에서 유발.
    1. FM 염료 이미징 시작합니다.
    2. 솔루션 1 또는 2를 세척에 용해 자극 시약을 적용합니다. 이러한 시약은 다음을 포함한다 : CA 2 + 세포 외 용액으로부터 셀에 유입, 사용 예에서 허용함으로써 세포 내 칼슘 이온 농도를 높여 (칼슘 2 + 이온 운반체 이오 노마 이신의 KCl (하이-K + 솔루션, 예를 들어 45 MM) 26, 5 μM) 20,34, 자당 (쉽게 탈착 가능한 수영장, 500 ㎜로 사용 예) (35, 36)에서 시냅스 소포의 방출을 자극 고장 성 솔루션을 제공합니다. 워너 악기 37, 또는 Y-튜브 시스템 38-40의에서 SF-77B 시스템 예를 들면, 시약을 적용 신뢰할 수있는 시간적 제어를위한 고속, 지역 관류 시스템을 사용합니다.
  3. 로 인해 Destaining 자연과 분시냅스 활동을 iature.
    1. 때문에 자발적인 시냅스 활동에 destaining를 들어, 솔루션 2를 세척하여, (5.1.1) 이상으로 TTX을 세척 할 것. 용액이 세정과 뉴런을 관류하면서 FM 염료 이미징 시작. 솔루션 1 (TTX로)을 세정에 신경을 perfuse 계속하다가 미니 시냅스 활동 destaining를 들어, FM 염료 이미징 시작합니다.
    2. 자발적 또는 축소하거나 활동을 기반으로 destaining 후 유발 시냅스 활동을 통해 destaining하여 기능 신경 터미널을 식별합니다. 활성은 전술 한 절차에 의해 유발 될 수있다. 더러워 구조 기능적 신경 말단 (예 서서히 엔도 솜 또는 성상 세포 소낭 리사이클)과이 과정에서 유발 된 활성 에이즈 destaining 다량 이외 해당 될 수 있기 때문 식별 프로세스가 필요하다.

6. FM 염료의 광표백 평가 평가

  1. 알데히드 - 고칠 FM 염료 (예를 들어, FM1 - 43FX, FM4-64FX)와 신경 말단을 얼룩. 이것은 상술 유발, 자발적 또는 미니어처 염색법을 사용하여 수행하고, 정착 FM 염료와 FM 염료를 대체하여있다.
  2. 섹션 2.1.7에 설명 된대로 고칠 FM 염료를 세척 할 것.
  3. 화학적으로 정착 솔루션에 커버 슬립을 전송하여 신경 세포를 고정 : 4 ℃에서 30 분 동안 타이로드의 용액에 4 % 파라 포름 알데히드 4 %의 자당 고칠 FM 염료의 형광 강도는 화학 고정 후 유지됩니다.
  4. 두 번 신선한 타이로드의 솔루션으로 커버 슬립을 전송하여, 타이로드의 용액에 10 분 동안 정착을 세척 할 것.
  5. 영상 실에서 신선한 타이로드의 솔루션으로 커버 슬립을 전송합니다.
  6. 라이브 뉴런으로 이미징 파라미터들의 동일한 세트를 사용하여 정착 FM 염료 이미징 시작. 그것은, 어떤 화학적으로 고정 된 표본을 사용 후 잘 이미징 챔버를 씻어하는 것이 중요하기 때문에나머지 정착액은 동일한 챔버에서 수행 후속 라이브 세포 이미징 실험에 영향을 미칠 수있다. 또는 고정 된 세포 이미징, 스테인드 살아있는 세포는 광표백 속도를 평가하기위한 몇 군데 있습니다. 그러나, 그것이 심하게 미니어처 시냅스 활성을 차단하는 것은 어렵다는 것을 명심 가치가, 예를 들어, 소형 활동의 빈도는 세포 외 칼슘 2 + (23)을 제거하여 50 % ~로 감소 될 수 있지만 완전하지 봉쇄.
  7. 각 촬상 세션의 끝에, FM의 형광 강도의 절대 값을 평가하기위한 배경 화상을 취득. FM의 puncta에의 강도는 신경 말단에서 FM 염료에서 진정한 신호뿐만 아니라, 신경 세포의 단일 층 문화, 2) 커버 슬립 및 광학 요소 (예를 들어 대물 렌즈, 필터 등을 기초 1) glial 세포에서 배경 잡음뿐만 아니라 나타냅니다 거울), 3) 검출기 (EMCCD 카메라). 배경 잡음은 ASSE입니다영상화 된 필드의 nonstained 지역에서 ssed. 이러한 영역들은 강도 공간 또는 이종에 한정되는 경우가 이상적인 방법은 아니지만, 카메라 셔터가 닫힌 이미지로 대체하고 검출기로부터 소음을 취득. 동일한 촬상 파라미터를 이용하여 약 10 개 이미지를 획득.

7. 이미지 분석

  1. 시계열 이미지의 스택과 이미지 분석 소프트웨어로 수집 된 데이터를 가져옵니다. 우리는 ImageJ에 (WS Rasband, NIH) 및 관련 플러그인을 사용하여, 예를 들어, 이미지 안정제 플러그인 (강 리) FM의 puncta에 사이에 운동의 작은 정도를 보정하고, 시계열 분석 V2.0 (발라지 Jayaprakash) 분석을위한 시계열.
  2. 시리즈 (ΔFM)의 시작과 끝에서 FM 강도의 변화를 계산한다. 이를 위해 destaining의 개시전 및 destaining (예 5 이미지 프레임 당)의 종료 후 이미지를 평균 및 subtractin하여 차분 화상을 생성G 그들.
  3. 차분 영상에 강도 임계치를 적용함으로써 잠재적으로 기능적 신경 말단을 식별하고, 그 농도 임계 값보다 높은 화소를 검출한다. 임계 값을 설정하는 방법 중 하나는 상기 베어 커버 슬립 영역으로부터 얻어진 배경 강도의 표준 편차를 선택하는 것이다.
  4. 감지하고 그 크기 기준 (연속성에있는 픽셀의 최소 및 최대 수를) 충족 된 인접 픽셀로 고립 된, 기능 신경 터미널을 확인합니다. 이 프로세스는 배경 잡음 및 분석에서 집계 신경 말단을 제거한다.
  5. (각각의 클러스터는 각각의 신경 말단에 대응) 검출 된 픽셀 클러스터에서 지역 수준의 관심 (로아)을 지정합니다. (ΔFM를) destaining 동안 강도의 변화량 분석의 전형적인 매개 변수입니다. 이것은 유발 자발적 또는 소형 시냅스 활동의 누적 양을 나타냅니다. 는 다음과 같은 문제를 나타내는 경우의 ROI를 제외실험의 목적에 따라 강도의 변화 : 촬영하는 동안 증가, 자극 전에 갑자기 감소, 또는 자극 후 긴 대기 시간.
  6. 이미지 분석 소프트웨어로 취득한 시계열 데이터를 가져와 광표백의 비율을 평가. (닫힌 셔터 예) 배경 이미지를 평균 및 개별 이미지에서 뺍니다. 상상 속으로 신경 말단에 해당 FM의 puncta에로의 ROI를 지정하고 시간이 지남에 따라 투자 수익 (ROI) 강도의 변화를 측정한다.

솔루션

  1. 타이로드의 솔루션
    • (mm 단위) 구성 : 125 염화나트륨, 2의 KCl, 2 염화칼슘, 2 MgCl2를 30 포도당, 25 HEPES, 310 mOsm, 산도 7.4.
  2. 염색 액 (1)
    • 타이로드의 솔루션 플러스 FM 염료.
    • 이 용액을 전기 자극에 의​​해 유발 된 시냅스 활동을 기반으로, 염색에 사용된다.
    • AMPA 수용체와 NMDA 길항제의 추가 receptoRS 필요한 경우.
  3. 염색 솔루션 2
    • 하이-K + 타이로드의 솔루션 플러스 FM 염료.
    • 이 수정 타이로드의 솔루션은 염화나트륨을위한의 KCl의 몰 치환, 45 mm로의 KCl의 농도를 증가시켜 제조한다.
    • 이 용액을 연속 탈분극에 의해 유발 된 시냅스 활동을 기반으로, 염색에 사용된다.
    • 필요하면 AMPA 수용체와 NMDA 수용체의 길항제를 추가합니다.
  4. 염색 액 3
    • MEM 솔루션 플러스 FM 염료.
    • 이 용액을 자발 시냅스 활동을 기반으로, 염색에 사용된다.
  5. 염색 액 4
    • MEM 용액 플러스 FM 염료 및 TTX.
    • 이 용액 미니어처 시냅스 활성에 기초 염색에 사용된다.
  6. 솔루션 세척 1
    • 타이로드의 용액 플러스 AMPA 수용체와 NMDA 수용체의 길항제 및 TTX.
  7. 솔루션 2 헹굼
    • 타이로드의 용액 플러스 AMPA 수용체와 NMDA 수용체의 길항제 만 TTX없이.

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Representative Results

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예를 들어, 우리는 시냅스 소포의 destaining 시간 코스 (그림 4)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 배양 된 해마의 신경 세포가 자발적 시냅스 활동 (단계 2.3)를 사용하여 FM4-64로 염색 및 염료 무료 솔루션 (솔루션 2 린스)로 세척 하였다. 영상은 자발적인 활동 (단계 5.3) (연속 라인의 초기 부분, 그림 4A)를 사용하여 초기 destaining 시간의 과정을 보여줍니다. 이것은 120 초 동안 10 Hz에서 자극 필드 각각 (단계 5.1)로 유발 된 활성의 3 라운드를 사용 destaining 시간 코스 따른다. 유발 destaining의 양을 측정하는 방법 중 하나는 소포의 전체 리사이클 풀의 크기에 대응 양두 화살표 (ΔFM 유발)으로 설명된다.

첫 번째 자극이 주어지기 전에, (그림 (b)에 확대) FM 강도의 점진적 감소가 발생했습니다. 이 감소는 destaining 구성되었다때문에 자발적인 시냅스 활동 (ΔFM Spont) 및 광표백 (ΔFM PB). 광표백의 기여가 작은 경우, preimaging 기준선 (ΔFM Spont + ΔFM PB)까지 변화 자발 활동 destaining 량에 근사로서 사용될 수있다.

그림 1
그림 1. FM 염료의 구조. A. FM은 주에게 몇 가지 일반적인 구조적 특징을 염료. 친수성 그룹은 수용액에 머물면서 소수성 꼬리는 FM 염료 막으로 분할 할 수 있습니다. FM2-10, FM1-43 및 FM1-84 쇼 녹색 방출, FM5-95 및 FM4-64 쇼 적색 편이 방출있다. FM1-43, 가장 일반적으로 사용되는 FM 염료 B. Stereoview. 친수성 그룹이 위쪽을 향하도록하고, 소수성 꼬리가 아래로 향하게됩니다. 되었습니다 Nitrogen 원자는 파란색으로 표시됩니다. FM1-43의 또 다른보기를 들어, Schote 및 Seelig 63을 참조하십시오.

그림 2
그림 2. 수용액 즉 (그레이) 훨씬 덜 형광 반면 FM 염료 사용의 기본적인 방식은. 뉴런에 도포 후, 세포막 내로 삽입 FM 염료, 형광 (녹색)이된다. 그것은 일반적으로 세포 외 유출을 다음, 엔도 시토 시스를 거쳐 때 시냅스 소포 (SV)는, FM 염료에 의해 (염색)로드됩니다. 세포 외 용액에 FM 염료를 세척 만 스테인드 소포 형광이 될 수 있습니다. 이 세포 외 유출을 거쳐 따라서 FM 염료를 놓을 때 그 후, 시냅스 소포는 (탈 염색시킨) 언로드됩니다. 아래 이미지는 FM1-43 배양 해마 신경 세포의 모범 염색 (형광 및 위상 콘트라스트 이미지 오버레이를 보여줍니다). 그것은이 문서에 설명 된 프로토콜, 형광 puncta에이 시냅스 전 신경 말단 스테인드 시냅스 소포의 클러스터 (일반적으로 중앙 신경에있는 직경 ~ 1 μm의)가 아닌 개별 시냅스 소포 (직경 ~ 40 nm의) 대표,주의입니다. 단순화를 위해이 방식은 시냅스 소포 엑소 엔도 사이토 시스의 일반적인 생각을 나타냅니다. 그런 방 clathrin 매개 엔도 시토 시스, 과도 키스 앤 실행 엑소 엔도 사이토 시스, 벌크 엔도 시토 시스 (64)에 의해 다음에 전체 붕괴의 융합과 같은 엑소 엔도 사이토 시스의 복수 형태를 포함 할 수 있습니다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

그림 3
그림 3. FM 영상에 의해 연구 시냅스 활동의 세 가지 유형. 유발 시냅스 활동은 일반적으로 외부 전기 자극을 필요로한다. 자발적인 시냅스 활성은 전기 자극의 부재하에 일어난다. 미니 시냅스 활동이 전기 자극없이 활동 전위없이 자발적으로 발생 일반적으로 활동 전위 생성은 전압 의존 나 + 채널, 테트로도톡신의 차단에 의해 억제된다. 세포 외 유출이 (세포질 내 칼슘 이온 농도의 지속적인 증가) 이오 노마 이신, 하이-K + 용액 (연속 탈분극)에 의해 자극, 자당 (쉽게 탈착 풀에있는 소포의 세포 외 유출을 도출)를 포함하는 고장 성 용액, 때 추가 활동이 유발 된 활동을 포함 세포 외 유출을 받아야하는 시냅스 소포에 대한 활동 전위의 발사를 필요로하지 않습니다 모두가. 일부 연구에서, 자발적인 활동이 광범위하게뿐만 아니라 소형 활동을 포함하는 것으로 정의되어 있습니다.

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그림 4. destaining의 대표적인 결과. A. 배양 된 해마의 신경 세포는 37 ° C (2.3 단계)에서 10 분 동안 2.5 μM FM4-64으로 자발적인 활동으로 염색하고 (프로토콜 3) 세척. 뉴런은 자발적인 활동 (단계 5.3)과 destaining 동안 몇 군데, 그리고했다 유발 활동 (단계 5.1) (연속 곡선, N의 평균 = 25 신경 터미널)의 3 라운드. 수직 막대는 SEM을 나타냅니다. Y 축은 절대 FM 강도를 나타내고, 카메라 셔터가 닫힐 때 "0"의 강도를 나타낸다. 유발 destaining의 총 양 (ΔFM 유발) 표시됩니다. B. 패널의 A (연속 곡선, 편의상 생략 SEM 바)에 destaining의 초기 단계의보기를 확장했다. 60 초 관찰하는 동안 억류 자발적인 행위에 주로 기인의 ivity (ΔFM Spont)하지만 인해 (ΔFM PB)을 photobleaching에 부분적이었다. FM4-64 (두꺼운 점선)의 광표백 시간 코스는 고칠 수 FM4-64 (프로토콜 6) 이미징에 의해 별도의 실험에서 산출 된 것입니다. 비율은 (15 분에 걸쳐 커브 피팅에 의해 결정된 5736 초의 시간 상수를 가진 단일 지수 함수)이 19 분에 걸쳐 2~3%이었다. 광표백 곡선 FM4-64의 측정 된 강도의 초기 값에 상당 가진 지수 함수로 그려졌다. 더 긴 기간 (9 분)에 광표백에 Kakazu 등. 19에 보충 그림 S5를 참조 변수 여기 강도와 노출 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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우리는 자연과 소형 시냅스 활동을 유발하고, destaining 단계에서 이미징에 대한 응답으로 시냅스 소포를 염색하고 destaining을위한 프로토콜을 설명했다. 기존 프로토콜 이외에, 우리는 미니어처 시냅스 활성에 근거 FM의 destaining 관찰의 새로운 프로토콜을 포함했다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 운동 장애 근긴장의 마우스 모델에서 배양 된 신경 세포의 이상을 확인했다. 높은 활성 (20)에 의해 자극 될 때, 야생형 마우스에서 그들의 대응에 비해, 이들 뉴런은 칼슘 2 + 의존적으로 시냅스 소포 세포 외 유출을 가속화 받았다. 신경 전달 물질 방출 (19)의 패치 클램프 전기 생리학 기록에 의해 확인 된 이들 뉴런은 또한, 더 자주 소형 시냅스 활성을 나타내었다.

이러한 분석에서 FM 염료를 사용하기위한 프로토콜의 중요한 측면은 ASSE한다SS 및 광표백을 최소화합니다. photobleaching에 의해 야기되는 변화는 시냅스 활동에 의해 발생 된 것과 비교하여 작은 경우 FM 형광 강도의 미묘한 변화를 확실하게 평가할 수있다. 감소 광표백 또한 세포 독성을 억제 또는 제거 할 수있는 잠재력이있다. 광표백은 광을 여기하는 형광체의 노출을 최소화함으로써 감소 될 수 있고, 실시간 이미징 실험에서이를 수행하는 장치의 적어도 두 개의 구성 요소가있다. 한 가지 중요한 요소는 EMCCD 카메라 예를 들어, 광자의 민감한 검출기입니다. 이로써 부정적인 형광 발광의 검출에 영향을주지 않고 노광의 지속 시간 및 강도를 최소화 할 수있다. 관련된 구성 요소 검출기는 영상을 획득 할 때만 여기 광으로 시료의 노출을 제한하는 광원 시스템이다. 이것은 쉽게 노광의 타이밍을 효율적으로 제어 할 수 LED 라이트 (41) (ON / OFF t함으로써 달성된다AKES 1 밀리 초보다 훨씬 적은). 노출은 카메라 (도르 카메라의 예를 들어 "불"터미널)에서 디지털 출력으로 만 이미지를 캡처하는 동안 트리거 될 수 있습니다. LED를 사용하는 추가의 이점은 다음을 포함한다 : 패치 클램프 기록과 유리 피펫의 정확한 처리에 방해가 감광 필터, 광 강도의 장기적인 안정성, 기계적 진동의 부재를 사용하지 않고, 광 강도를 제어하는​​ 능력을 .

일반적으로, 구조적으로 상이한 염료 같은 촬상 조건에서 서로 다른 속도로 photobleach. 따라서 그것은 특히 실험에 사용 된 형광 물질의 광표백의 정도를 평가하는데 이상적 일 것이다. 라이브 신경 말단에서 FM 염료 위해, 때문에 자발적 또는 미니어처 시냅스 활동 시냅스 활성의 광표백 레이트 독립적를 평가하는 것은 기술적 도전이다. 이러한 activit 동안 형광 강도의 감소Y는 FM 염료 (세포 외 유출), FM 염료의 광표백, 또는 두 가지 모두의 생물학적 손실로 인해 수 있습니다. 다행히 고칠 FM 염료의 구조는 nonfixable FM 염료의 것과 거의 동일하도록 설계되어 있습니다. 시냅스 활동이 시편의 화학 고정술 후 차단 된 반면, 여기에 설명 된 프로토콜에서 고칠 FM 염료는 nonfixable FM 염료와 같은 방법에 의해 시냅스 소포에로드되었다. 촬상 조건 라이브 세포 이미징 19과 동일 할 때 특히,이 시스템을 사용하여 측정 광표백의 속도는 최저 2-3 %까지 2 분에 걸쳐 있었다.

FM 염료는 시냅스 소포 재활용의 다양한 측면을 탐구하기 위해 다른 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 염색 및 destaining 동안 서로 다른 시냅스 활동 실험 목적과 평가 될 시냅스 소포 리사이클의 특정 기능에 따라 다양한 방법으로 결합 될 수있다. antagon의 선택ISTS 또한 실험의 목적에 따라 달라집니다. 또한, FM 촬상는 염색 단계 동안뿐 아니라 destaining 단계 9,18,42 동안 수행 될 수있다. 그것은 또한 명심해야한다, 그러나, FM 염료는 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체 (43)을 차단, 44, 저장소로 작동하는 칼슘 2 + 채널 45 mechanotransducer 채널을 침투하고, ATP (46) 수용체와 같은 예기치 않은 효과를 가질 수 있습니다. FM 염료 고농도 잠재적 시냅스 소포 세포 외 유출 자체 (47)의 효율을 변경할 수있다. 따라서 우리는 실험을 설계하고 시냅스 소포 재활용에 대한 결과를 해석에주의를하는 것이 좋습니다. 고려하는 보완 방법은 항원 결정기 소포 단백질 22,48의 내 내강 도메인입니다 항체의 시냅스 소포에 이해를 포함한다. 또한 pH 민감성 소포 루멘 49-51를 대상으로 GFP 변종과 이해를 표현 포함엑소 - 엔도 시토 시스와 함께 내 기공을 갖는 pH 변화를 감지 둘 pH 민감성 항체 복합체 52-54의.

원하지 않는 효과를 제외하면, FM 염료는 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 예를 들면, 그들은 동일한 시냅스 소포 풀이 자발에 대해 공유되어 있는지 해결하는데 사용할 및 소포 릴리스 17,55을 유발, 어느 정도 시냅스 소포 재활용의 효율성은 56, 57를 조절할 수있다하고, 될 수있는 효과 않는 이전 상태 (나머지 또는 자극) 자연과 소형 시냅스 활동을 기반으로 소포 재활용의 이상 상태를 발휘한다. FM 염료는 또한 FM 광 변환 방법 30,58-62 의해 빛과 전자 ​​현미경의 관찰 결과를 상관시킴으로써, 초 미세 구조 레벨에서 시냅스 소포 재활용을 평가할 수있다. FM 염료 동시에 시냅스 기능 및 내 Ca 2 + 콘을 모니터링하는데 사용될 수있다centration 5. 시냅스 소포, FM 염료와 같은 형광 덱스 트란 12 등의 다른 형광 유체 - 위상 마커 라벨링 외에도 격렬한 신경 활성에 의해 트리거되는 벌크 엔도 시토 시스를 모니터링하는데 사용될 수있다. 결론적으로, FM 염료의 응용 프로그램이 시냅스 소포 재활용 및 추가 시냅스 기능에 대한 귀중한 정보 소스를 제공합니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는이 작업을 실행하는 동안 도움이 토론의 Harata 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association), 근긴장 의학 연구 재단, 에드워드 말린 크로, 주니어 재단, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 그리고 NCH에 화이트 홀 재단의 교부금에 의해 투자되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

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References

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유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험
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Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

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