Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.
Vesículas sinápticas em terminações nervosas funcionais sofrem exocitose e endocitose. Esta reciclagem das vesículas sinápticas pode ser efetivamente analisados usando corantes estiril FM, que revelam turnover da membrana. Protocolos convencionais para o uso de corantes FM foram concebidos para a análise de neurônios seguinte estimulada (evocado) atividade sináptica. Recentemente, protocolos tornaram-se disponíveis para a análise dos sinais de FM que acompanham as atividades sinápticas mais fracos, como eventos sinápticas espontâneas ou em miniatura. A análise destas pequenas alterações nos sinais de FM requer que o sistema de imagem é suficientemente sensível para detectar pequenas alterações na intensidade, ainda que as mudanças de artefatuais de grande amplitude são suprimidas. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser aplicado a evocado, espontânea, e actividades sinápticas em miniatura, e usar os neurónios do hipocampo em cultura como um exemplo. Este protocolo inclui também um meio de avaliar a taxa de fotobranqueamento de corantes FM, como este é um significativofonte de artefactos quando imagens pequenas alterações em intensidade.
A funcionalidade das vesículas sinápticas é um importante determinante da transmissão sináptica. Essas vesículas libertar neurotransmissores quando se fundem com a membrana plasmática pré-sináptica (exocitose), e tornam-se pronto para um outro ciclo de libertação depois de ser regenerada a partir da membrana plasmática (endocitose) e recarregado com neurotransmissor. A investigação sobre a dinâmica dos mecanismos subjacentes e reciclagem das vesículas sinápticas foi muito acelerado pela introdução de corantes estiril FM 1. Estas moléculas anfipáticas, que têm carga positiva grupos de cabeça hidrófilos e caudas hidrofóbicas (vários corantes na Figura 1A, stereoview de FM1-43 na figura 1B), de forma reversível pode entrar e sair de membranas lipídicas sem impregnar a. Grupos de corantes FM compartilham características semelhantes que influenciam a gama de luz que eles emitem. Por exemplo, FM2-10, FM1-43, e FM1-84 tem uma dupla ligação entre os dois compostos cíclicos e shoemissão verde w. A diferença entre eles é o comprimento da cauda hidrofóbica, que determina a sua hidrofobicidade e, por conseguinte, a taxa de saída da membrana (departitioning). Nos casos de FM5-95 e FM4-64, três ligações duplas ligação dos compostos cíclicos, e que mostram emissão vermelha. Estes corantes são diferentes no que diz respeito às suas partes hidrofílicas. Em todos os corantes de FM, a intensidade da fluorescência aumenta quando eles são inseridos em membranas biológicas, devido a um aumento no rendimento quântico do ambiente hidrófobo em relação ao ambiente hidrofílico. Assim, as alterações na intensidade de FM representam as alterações no volume de membrana. As diferentes cores (espectros de emissão) e hidrofobicidades fazer a FM tinge uma ferramenta de pesquisa versátil na reciclagem de vesículas sinápticas.
Com base nestas características, os corantes FM são principalmente utilizados de acordo com o seguinte esquema, quando analisando reciclagem das vesículas sinápticas (Figura 2). Neurons são banhadas em uma solução extracelular contendo o corante FM, permitindo que ele seja levado para vesículas sinápticas (SVS), que fazem através de endocitose (coloração). O corante é então lavado por aplicação de uma solução extracelular livre de corante, isto revela as terminações nervosas funcionais, isto é, apenas aqueles submetidos a endocitose activamente, devem conter um conjunto de vesículas sinápticas que são carregados com o corante (Figura 2 abaixo). Exocitose subsequente conduz à perda do corante FM para o espaço extracelular e uma perda concomitante de fluorescência (descoloração, devido a tanto o departitioning para um ambiente hidrofílico e difusão para longe do local de exocitose). Por conseguinte, as alterações na intensidade de fluorescência de FM são indicadores de vesícula sináptica exo e endocitose.
Corantes FM foram utilizados para corar e Destain as vesículas sinápticas em vários organismos e preparações 2,3. Exemplos incluem neur mamíferosculturas onal 4-9, fatias de cérebro de mamíferos 10,11, junções neuromusculares 12,13, neurônios bipolares da retina 14,15, e as células ciliadas da cóclea 16.
Normalmente em tais experiências, tanto coloração e descoloração são acionados por extensivamente estimular os neurônios (atividade evocada). Recentemente, no entanto, a reciclagem de vesícula sináptica em resposta à estimulação fraco foi também analisado, como tem de reciclagem, na ausência de um estímulo externo (actividade sináptica e espontânea diminuta) 9,17-19. Atividades sinápticas espontâneas e miniatura são definidos como aqueles que ocorrem na ausência de estímulos externos, com o primeiro envolvendo a queima espontânea de potenciais de ação (Figura 3). Essas atividades sinápticas fracas estão associados a mudanças menores em sinais de FM que aquelas desencadeadas por estimulação extensa. A medição requer que as alterações na fluores FMintensidade cia refletir com precisão a exocitose das vesículas sinápticas ou endocitose mas as alterações não de artefatos em intensidade. Uma causa do artefacto é a presença de coloração não específica da membrana plasmática por corantes FM. Washout gradual deste componente vai conduzir a uma mudança gradual na intensidade da fluorescência medida, que serão erroneamente atribuído às actividades sinápticas. Este factor pode ser reduzido por métodos adequados (ver protocolo). A causa mais notável do artefato é a fotodegradação de corante FM retida dentro vesículas sinápticas. As mudanças relacionadas à fotodegradação na intensidade FM deve ser pequeno em comparação com os biológicos (sinápticas) mudanças que são medidos. O recente desenvolvimento de câmaras sensíveis, por exemplo, a câmara do dispositivo de carga acoplada multiplicação de electrões (EMCCD), faz com que seja possível, para minimizar a fotodegradação, encurtando o tempo de exposição e enfraquecimento da intensidade da luz usada para excitar o fluoróforo. Outra causa do artefato é um i derivan o nível de concentração da microscopia de luz. O desvio do foco, durante uma sessão de imagem pode ser causada por efeitos mecânicos ou térmicos, e erroneamente conduzir a uma mudança na intensidade de fluorescência medido.
Aqui descrevemos protocolos e equipamentos que tornam possível a utilização de corantes FM para analisar a reciclagem de vesículas sinápticas, mesmo no contexto de uma fraca ou nenhuma estimulação, em particular, a actividade sináptica em miniatura. Mostramos exemplos de coloração e descoloração de vesículas sinápticas evocadas durante os eventos e espontânea, utilizando culturas de neurônios do hipocampo de roedores, e imaginando a fase de descoloração. Também demonstramos como avaliar o grau de FM corante fotodegradação, na ausência de qualquer perda corante FM devido às atividades sinápticas.
Descrevemos os protocolos de coloração e descoloração vesículas sinápticas em resposta a evocada, atividade sináptica espontânea e miniatura, e para geração de imagens durante a fase de descoloração. Em adição aos protocolos existentes, que têm incluído um novo protocolo de observar a descoloração FM com base na actividade sináptica em miniatura. Usando estes protocolos, que anteriormente identificado anormalidades nos neurônios cultivados a partir de um modelo do rato da distonia distúrbio de movim…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos membros do laboratório Harata para discussões úteis durante toda a execução deste trabalho. Este trabalho foi financiado por doações da Associação Americana do Coração, a Fundação Distonia Pesquisa Médica, o Edward Mallinckrodt, Fundação Jr., da National Science Foundation e da Fundação Whitehall para NCH
Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
Isolated stimulator | Digitimer | DS3 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | This is used for assessing the cell morphology at low magnification. |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TiE | This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift. |
Objective lens | Nikon | Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm). | |
Filter cube | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43 |
Filter cube | Nikon | 77032809 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. |
EMCCD camera | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence. |
Liquid recirculating chiller | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise. |
LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation. |
Image acquisition software | Andor Technology | Solis | |
Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
Fast perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | |
CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
Tetrodotoxin | Tocris Bioscience | 1069 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Hanks’ balanced salt | Sigma-Aldrich | H2387 | |
Minimum Essential Medium | Invitrogen | 51200-038 | This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging. |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |