Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner

Summary

Intravital mikroskopi er et kraftfuldt værktøj, der giver billeddannelse forskellige biologiske processer i levende dyr. I denne artikel præsenterer vi en detaljeret metode til billeddannelse dynamikken i subcellulære strukturer, såsom de sekretoriske granulat, i spytkirtlerne af levende mus.

Abstract

Her beskriver vi en procedure til billede subcellulære strukturer i levende gnavere, der er baseret på anvendelse af konfokal intravital mikroskopi. Som model organ, bruger vi spytkirtlerne af levende mus, da de giver flere fordele. For det første kan de let udsættes for at muliggøre adgang til optikken, og stabiliseres for at lette reduktionen af ​​bevægelsesartefakter grund hjerteslag og respiration. Dette letter billedbehandling og spore små subcellulære strukturer betydeligt. For det andet er de fleste af cellepopulationer spytkirtlerne er tilgængelige fra overfladen af ​​organet. Dette tillader anvendelse af konfokal mikroskopi, der har en højere rumlig opløsning end andre teknikker, der har været anvendt til in vivo-billeddannelse, såsom to-foton mikroskopi. Endelig kan spytkirtler nemt manipuleres farmakologisk og genetisk, hvilket giver et robust system til at undersøge biologiske processer på molekylært niveau.

I denne undersøgelse har vi fokus på en protokol til at følge kinetikken af ​​exocytose af sekretoriske granula i acinære celler og dynamikken i den apikale plasmamembran, hvor de sekretoriske granula fusionerer ved stimulering af beta-adrenerge receptorer. Konkret har vi brugt en transgen mus, der co-udtrykker cytosol GFP og en membran målrettet peptid fusioneret med det fluorescerende protein tandem-Tomat. Dog kan de procedurer, som vi brugte til at stabilisere og image spytkirtlerne kan udvides til andre musemodeller og koblet til andre tilgange til at mærke in vivo cellulære komponenter, der muliggør visualisering af forskellige subcellulære strukturer, såsom endosomes, lysosomer, mitokondrier og actin cytoskeleton.

Introduction

I de seneste to årtier fremkomsten af levende mikroskopi og brug af fluorescerende proteiner har ført til store gennembrud på hver cellulær proces tænkelige, og dermed fremme vores forståelse af cellebiologi ^1. Dette felt har nydt voldsomt fra anvendelsen af ​​mammale cellekulturer, der er ekstremt stærke modelsystemer, især når det kommer til eksperimentelle manipulationer. Men de ofte ikke giver en korrekt gengivelse af biologi komplekse flercellede organismer ^2. Dette spørgsmål er begyndt at blive behandlet af udviklingen af intravital mikroskopi (IVM), som har åbnet døren på at undersøge de vigtigste biologiske spørgsmål inden for områder som neurobiologi, immunologi og tumor biologi ^3. Hidtil er de fleste af de undersøgelser, der er baseret på IVM er blevet udført på de niveauer, væv og de enkelte celler, uden at give nogen oplysninger om dynamikken i subcellulære afsnit. For nylig vores laboratorium og andres har udviklet IVM teknikker, der kan imaging subcellulære strukturer i levende gnavere ^{4-7, 13-15} og tillader farmakologiske og genetiske manipulationer in vivo. Denne fremgangsmåde er blevet brugt af os til at studere membran trafficking in vivo, og mere specifikt endocytose og reguleret exocytose ^6,7.

Vores eksperimentelle model system er baseret på at afsløre, stabilisere og billeddannelse submandibulære spytkirtlerne (SGS) af bedøvede gnavere. Valget af strain gauges som en model organ for IVM skyldes det faktum, at kirtler er let tilgængelige ved at udføre en mindre operation kan externalized uden at kompromittere deres fysiologi, og stabiliseret for at reducere bevægelsesartefakter grund hjerteslag og respiration. Desuden kan strain gauges selektivt manipuleres genetisk ved injektion enten virale eller ikke-virale vektorer gennem spytudførselsgang ^8,9. Endelig strain gauges er exokrine kirtler sammensat af polariseret epithelial celler, der danner acini og kanalerne, myoepitelcellerne og en kompleks population af stromaceller. Af denne grund, de er en glimrende model til at studere exocytose, endocytose, gen levering, og aktincytoskelet, som fremhævet i vores seneste undersøgelser ^10, og tilbyder mulighed for at studere aspekter af cellebiologi, såsom celle polaritet, celledeling, celle- celle vejkryds og ionkanaler.

I dette papir, vi beskriver i detaljer, en imaging-protokol for at opnå subcellulære opløsning i epitel SGS med en levende mus. Konkret viser vi, hvordan billedet de sekretoriske granula i acinuscellerne af SGS under reguleret exocytose. Som tidligere vist, efter stimulering med agonister af beta-adrenerge receptor, sekretoriske granula fusionerer med den apikale plasmamembran og gradvist bryde sammen, frigiver deres indhold til acinære canaliculi ^6. Vores mål er at give de grundlæggende værktøjer til efterforskerne med minimal erfaring i kirurgiske procedurer og håndtering af dyr, således at de med succes kan udføre IVM på en subcellulære opløsning. Da den mest udfordrende del i IVM er forberedelsen af ​​dyret, her har vi fokus på beskrivelsen af ​​de basale kirurgiske procedurer, der er brugt til at afsløre og immobilisere SGS uden at kompromittere deres funktion. Med hensyn til de procedurer, til at mærke subcellulære strukturer, flere strategier, såsom systemisk levering af fluorescerende prober, anvendelse af transgene dyr, eller en kombination af begge, er blevet beskrevet andetsteds ^7,11.

Protocol

Del 1: Microscope og Forberedelse af Imaging Setup

1. Enhver omvendt konfokal mikroskop skal være egnet til IVM. I denne undersøgelse et Olympus IX81 inverteret mikroskop udstyret med en FluoView-1000 laser scanning konfokal enhed blev anvendt. For at opnå den bedst mulige opløsning, anbefales brug af høje NA mål, såsom vand-nedsænkning UPLSAPO 60x/1.20 NA, og olien fordybelse Plan-Apo 60x/1.42 NA. Olie immersionsobjektiver har højere effektivitet indsamling og selvom de kræver brug af et dækglas mellem vævet og målet, giver de en bedre billedkvalitet, når de anvendes til billedområder indenfor 15-20 um fra overfladen. Derudover brugen af ​​olie eliminerer bekymring for vandfordampning under længere billedoptagelse. For at opretholde temperatur og fugtighed, bør mikroskop fuldt lukket og forsynet med varme og befugtet luft. Alternativt dyret mikroskopbordet ogmål skal opvarmes af andre midler. For eksempel kan kemisk varmepuder anvendes for dyret, og den fase, og specielt designet objektive varmeapparater kan anvendes til det formål (figur 1A). Målet varmelegeme skal tændes 30 minutter, før du starter proceduren. Bemærk: Når varmepuder er brug for at holde dyret varm en gaze har at placere i mellem puden og huden. Huden skal overvåges for forbrændinger.
2. De faste faser i de fleste af de kommercielt tilgængelige konfokale mikroskoper har en åbning, der bruges til at indsætte forskellige holdere, der bruges til at passe dias, petriskåle og plader af forskellige størrelser. For at udføre IVM en standard fase indsats til 35 mm petriskåle vendes på hovedet, er dækket med en glasplade, 40 mm, som derefter fastgøres ved højvakuum siliconefedt eller tape (figur 1A). En brugerdefineret Indsatsen kan også være fremstillet af 3 mm tyk aluminium plade. Glasoverfladen derefter cleaned med 70% ethanol og huggede med en Kimwipe.
3. Fremstilling en skræddersyet holder til SGS immobilisering (stabilisator). Formålet med indehaveren er at stabilisere SGS på plads, og stift par dem på scenen og dækglasset. Holderen kan foretages fra en 60 mm plastik petriskål. Først bunden af ​​skålen brudt væk fra vægge og skåret i rektangler på ca 15 x 10 mm. Derefter er de afrundede kanter og poleret ved hjælp af fint sandpapir. Fire afstandsstykker (1,5-2 mm) er bygget ved at fjerne gummi tips 1 ml sprøjtestemplerne. Ved at bruge fint sandpapir, overfladen af ​​afstandsstykker og de fire hjørner af plaststykket er poleret. Afstandsstykkerne limes derefter ved hjælp af geléagtige superlim, og senere glattet med fint sandpapir på en flad overflade. Bemærk, at for ældre dyr, kan størrelsen af ​​holderne og afstandsstykkerne skal øges til at rumme lidt større kirtler.
4. Fremstilling af optiske kobling gel. 0,3% Carbomer-940 (Tabel 2) gel fremstilles ved opvarmning op til 100 ml ultrarent vand og opløse 5,47 g D-sorbitol. Derefter 0,3 g carbomer-940 tilsat. Bægerglasset skal dækkes og anbringes på en omrøring varmepladen (laveste kogetrin) i flere timer, eller indtil alle carbomer klumper er fuldstændig opløst. Endelig Trietanolamine tilsat dråbevis under forsigtig omrøring, indtil en pH på omkring 7,4 er nået. Gelen opbevares ved 4 ° C ^13.

Del 2: Dyr og Anæstesi

1. Før der udføres forsøg med dyr, bør de protokoller godkendes af dit lokale Dyrepleje og etiske komité. Vigtigere er det, skal forskerne være ordentligt uddannet til at udføre kirurgiske procedurer og bør rådføre sig med deres lokale dyrepleje udvalg eller institution dyrlæge før du fortsætter med proceduren.
2. I denne undersøgelse, en musemodel (GFP / mTomato-mus) afledt ved at krydse FVB mus, der udtrykker opløselig GFP (GFP-mus) with C57B6 mus, der udtrykker en membran målrettet peptid fusioneret med det fluorescerende protein tandem-Tomat (mTomato-mus) ⁶ blev anvendt. Bemærk: Det tager normalt 20-30 min for dyret at blive fuldt bedøvede og prepped til billedbehandling
3. Musene huses i et kontrolleret miljø i dyreanlægget og får lov til at akklimatisere sig i en uge før forsøget. Dette skridt er nødvendigt til billeddannelse SGS da eventuelle nød resulterer i forøget sekretorisk aktivitet ^12. Vand og mad leveres ad libitum. Hanner fra 2 -5 måneder bruges til billeddannelse eksperimenter (20-30 g).
4. Før anæstesi, vejes dyrene til at bestemme den korrekte dosis af bedøvelsesmiddel.
5. Da stress induceret ved indgivelse af injicerbare anæstetika kan forringe sekretoriske aktivitet SGS inducere præ-anæstesi med isofluran inhalering, efterfulgt af injektion af anæstetika. Til dette formål placeres musene meget forsigtigt ind i fordamperen kammer, ogtænde ilt flow (800-900 mmHg). Indstil isofluran niveauer til 3% for at starte præ-anæstesi-induktion.
6. Når dyrene er bevidstløs, indsprøjte en blanding af 100 mg / kg ketamin og 20 mg / kg xylazin i bughulen (25 G kanyle). Anæstetika er frisk fremstillet ved fortynding af 100 mg / ml xylazin 20 mg / ml i saltvand og derefter blande det med ketamin. Denne blanding yderligere fortyndet 1:1 med saltvand og en passende mængde, baseret på dyrets vægt. Denne fortynding hjælper med at forebygge utilsigtet overdosis. Bemærk, at blandingen mister sin effektivitet efter 20 min.
7. Observere dyrene for tegn på vågenhed og injicere mere anæstesiblandinger, hvis de kommer ud af anæstesi (ca. 75% af den oprindelige dosis inden for 45 minutter efter den første injektion, og 50% hver time derefter). Kontroller dybden af ​​anæstesi hver 15 min ved at klemme pote og observere respons. Bemærk: administrere altid oftalmologiske salve for at forhindretørhed øje.
8. Bedøvelsesmidler fremkalde hypotermi, hvilket kan påvirke reproducerbarheden af ​​forsøgene og sundhed af dyret. Derfor bør mus holdes under varmelampe eller på en opvarmet pude for den samlede varighed af eksperimentet. Bemærk: varmelampen bør være mindst 12-18 inches fra dyret for at forhindre forbrænding
9. Kropstemperaturen hos de dyr, der skal overvåges med et termometer forsynet med en rektal temperatursonde.

Del 3: Animal Kirurgi og positionering for Intravital Microscopy

1. Forbered arbejdsområdet med alle de kirurgiske instrumenter (tabel 1), der skal være rent og sterilt.
2. Barbere halsområdet af musen med en elektrisk klipper. Tør den ventrale side af halsen område af bedøvede mus med et gazesvamp dyppet i 70% ethanol. Tør overskydende med en Kimwipe.
3. Med kedelige buede pincet løfte et lille stykke af huden på midterlinjen (ca.ende i den lavere ende af tyggemuskler), og lave et lille snit (Figur 1B).
4. Sæt saksen i åbningen og adskille huden væk fra det underliggende væv ved at åbne sakseblade. Undgå at beskadige det underliggende kirtelvæv ved at pege saksen op mod undersiden af ​​huden. Gentag dette trin flere gange, indtil huden er adskilt fra dybere væv (figur 1B).
5. Med saks, skære en strimmel af løsnede hud omkring 3 mm bred og 10 mm lang. Huden skal skæres, således at åbningen starter nær bunden af ​​SGS hvor nerven kanalen og blodkarrene forbinder kirtel til resten af ​​kroppen. Efter rengøring såret område, vil den resulterende åbning være ovalt og måler ca 8 x 12 mm. Begge SGs vil være synlige efter åbningen (figur 1B).
6. Med en sprøjte anvende optiske gel i midten af ​​snittet og tørre modydersiden med steril gaze. Rene stykker gaze bør anvendes for hvert tørre for at forhindre indførelse af hår eller blod ind i eksponeret væv. Gentag dette trin, indtil alt blod og løse hår fjernes.
7. Brug # 7 pincet, adskille bindevæv væk fra højre submandibulære kirtel hele vejen til bunden af ​​kirtlen (alternativt denne protokol kan bruges til venstre SGs). Først skal du finde spidsen af ​​SG og få fat i bindevævet et par millimeter over spidsen af ​​kirtel. Riv bindevæv omkring kirtel uden at skade parenkym. (Figur 1B). Når kirtel er udsat for, forsigtigt adskille bindevæv fra kirtlen. Hvis der opstår blødning, vaske blodet væk med saltvand. Sørg for at alle bindevævet er adskilt, og kirtel er fuldt eksponeret. Hold kirtel fugtig ved anvendelse af optisk gel regelmæssigt.
8. Forud for at bringe dyret til mikroskopet, skal du placere et tykt stykke gaze og hjertt pakke på mikroskopbordet at opretholde en temperatur på 38 ± 2 ° C. Temperaturen af ​​den kemiske varmepuden kan justeres ved størrelsen af ​​de udskæringer, der udsætter den indre pose til atmosfæren. Gaze giver nogle isolering af varmepuden fra metallet fase. Dække toppen af ​​varmepuden med et tyndt stykke gaze samt.
9. Placer dyret på sin side (højre side til højre kirtel), og på gaze. Placer dyret med submandibulære spytkirtel placeret i midten af dækglasset (figur 1C).
10. Dyret skal sikres og stabiliseres i denne position før immobilisere kirtel. Anbring et stykke tape på den ventrale side af den forreste højre pote på musen. Hook fortænder med musen med en silke sutur (figur 1C, indsat). Skabe nogle spændinger mellem silketråd og pote, og sæt dem ind på scenen ved malertape. SG bør hvile naturligt i midten afdækglasset. Hovedet og brystkasse skal derudover stabiliseret med plastkiler der kan kobles til scenen.
11. Læg et lille stykke linsepapir over kirtel (figur 1C). Forlæng kirtel lidt og placere en tilpasset holderen over kirtel. Stramt par stabilisatoren til scenen med malertape. Kobling kan forbedres ved en metalbøjle forbundet med scenen (figur 1C). Spændinger og skarpe vinkler bør undgås, da de kan kompromittere blodgennemstrømningen. Umiddelbart efter stabiliseringen inspicere blodgennemstrømningen enten ved at undersøge kirtel visuelt (det bør bevare rosafarvning) eller ved epifluorescens. I GFP / m-tomat mus, kan brutto ændringer af blodgennemstrømningen let evalueres da både blodkar og flere af de blodlegemer er mærket med m-Tomat.
12. Dæk dyret med gaze og en opvarmet pude. Måle temperaturen af ​​den eksponerede kirtel ved hjælp af et termometer udstyret med en lille fleksibel termoelement anbragt i kontakt med den ene side af den eksponerede kirtel.

Del 4: Imaging Parametre

1. Brug epifluorescensbelysning fokus på overfladen af ​​kirtlen ved enten at bruge GFP eller RFP filtersæt. Find overflade SG, og vurdere blodgennemstrømningen i kapillærerne og den overordnede morfologi af vævet. Tegn på vævsskade omfatter membranblæredannelse eller forekomsten af ​​store vacuoles.
2. Vurdere stabiliteten af ​​vævet enten via epifluorescens eller ved forscanne valgte område. En stabil forberedelse er vigtig, da de fleste af bevægelsesartefakter ikke kan fjernes eller korrigeret for i post-processing dataanalyse. Hvis præparatet ikke er stabil, kræves justeringer.
3. For at finde den rette fokusplan billede kirtler i pre-scanning-tilstand (1X zoom), og gradvist flytte målet mod dækglasset indtil acinar strukturer, de sekretoriske granula og pLasma membran bliver klart synlig (figur 2).
4. De billeddiagnostiske parametre for time-lapse afhænge af den enkelte eksperiment. Til billedet dynamikken i de sekretoriske granula bruger en scanning hastighed på 0,5-2 sek / ramme, og 256 x 256 pixels med en 0,2 um / pixel rumlig skala (synsfelt på ca 50 mM x 50 mM). For optimalt at visualisere granulater og plasmamembranen, bør den optiske tykkelse indstilles mellem 0,9-1,2 um. At ophidse GFP og tandem-Tomat, kan man bruge en bølgelængde på 488 nm og 561 nm, hhv. Den maksimale effekt er sat omkring 0,5 mW for 488 nm og 1 mW til 561 nm. Dette sikrer minimal fotoblegning.
5. Detektoren indstillinger skal justeres for at bevare signalet i det dynamiske område og afhænger af lysstyrken af ​​prøven.
6. Når alle parametre er indstillet, kan billeddannelse startes. Først tage et snapshot af synsfeltet, der skal bruges som et referencepunkt. Mensbilleddannelse i tid bortfalder, kan drivende af vævet i XY og Z forekomme. Dette kan manuelt kompenseres ved at justere scanningsområdet og Z-positionen. Justeringerne bør foretages gradvist og med små intervaller for at undgå artefakter. Desuden kan referencebilledet anvendes til at bestemme, om fotoblegning opstår. Hvis der registreres en betydelig fotoblegning (mere end 15-20% reduktion i fluorescens), reducere lasereffekten med 0,1 mW.
7. For at stimulere exocytose, indsprøjtes subkutant 0,1 mg / kg af en frisk fremstillet opløsning af isoproterenol i saltvand. Eksocytose udløses cirka 1 minut efter injektionen. Sekretoriske granulat fusing med plasmamembranen vil blive opdaget af en stigning i GFP-fluorescens omkring granulatet og udbredelse af de tandem-Tomat-peptider i deres begrænsende membraner (Figur 3). Vi anbefaler, at erhverve 3-4 time-lapse-sekvenser i det samme område, 10 min hver.
8. Efter imaging session aflive anesthetized animalske CO ₂ inhalation i en dødshjælp kammer (10-12 mmHg i 10 min.)

Representative Results

I GFP / mTomato mus, de acini vises som klart adskilte strukturer, som udtrykker cytosolisk GFP og membran-målrettet tandem-tomat-peptid (figur 2, stiplet linie). I de enkelte acini er acinusceller afgrænset af tandem-tomat-peptid. GFP er også påvist i de kerner, der er tydeligt synlige inde i acinære celler (figur 2, pile). Cytosol GFP er udelukket fra de sekretoriske granula, der vises som mørke cirkulære vesikler på ca 1-1,5 um i diameter (figur 2, Justering pilespidser). At visualisere eksocytiske begivenheder, har vi fokus på et område af plasmamembranen, der er beriget i sekretoriske granulat (Figur 3, stjerne). Efter subkutan injektion af 0,1 mg / kg isoproterenol, observere vi en stigning i niveauet af GFP-fluorescens omkring nogle af de sekretoriske granula, der er i tæt nærhed til plasmamembranen (Figur 3, grønne pile). Som previously vist disse granulat fusioneres med plasmamembranen og rekruttere en tyk actin meshwork der bevarer den cytoplasmatiske GFP ^6. Hertil kommer, efter fusion med plasmamembranen, tandem-Tomato peptidet diffunderer ind i begrænsende membraner af sekretoriske granulater (figur 3, røde pile). Efter 30-40 sek de sekretoriske granula gradvist bryde sammen, og deres begrænsende membraner er integreret i den apikale plasma membran.

Figur 1. Mikroskop sat op, kirurgiske procedurer og dyr positionering. A. En scene insert designet til at holde 35 mm petriskåle er dækket med en 40 mm dækglas. Indsatsen er anbragt i mikroskopet fase, der er forvarmet med opvarmede puder (orange ovaler) og en opvarmet lampe. Målet er præ Opvarmet med en objektiv varmer (indstillede temperatur: 38 ° C). B. Kirurgiske procedurer for at afsløre spytkirtlerne. Brug ren saks, er et snit i huden over halsområdet. Saksen er indsat i åbningen for at adskille huden fra det underliggende væv. Huden er derefter fjernes, og bindevæv forsigtigt skrællet fra en af kirtler med en pincet. C. dyret er placeret på siden på den forvarmede fase, og kirtel trækkes forsigtigt og anbringes i midten af dækglasset . Fortænderne er hooked på scenen med silketråd (indsat). Et lille stykke af linsepapir er klemt inde mellem kirtel og indehaveren af ​​orgel. Indehaveren af ​​orgel derefter stabiliseret med en klemme, der er sikret på scenen med malertape (grøn).

oad/50558/50558fig2.jpg "/>
Figur 2. Repræsentativt billede af en billeddannende område i spytkirtlerne med en levende GFP / mTomato mus. Acini er pænt fremhævet i GFP-kanal (grøn stiplet linie). Enkelte celler er afgrænset af TD-Tomato peptid, der er lokaliseret på plasmamembranen (rød stiplet linie). GFP er lokaliseret i cytoplasmaet og kerner (pile), men udelukket fra de sekretoriske granuler (inset, pilespidser). Bar, 10 um.

Figur 3. Repræsentant tidssekvens viser exocytose af sekretoriske granuler ved injektion på 0,1 mg / kg isoproterenol. Sekretoriske granuler blev afbildet tæt til plasmamembranen (stjerne). Efter fusion med plasmamembranen niveauer af GFP ved den sekretoriske granulas øge (grønne pile) og TD-tomat-peptidet diffunderer ind i deres begrænsende membraner (røde pile). De sekretoriske granuler langsomt kollapse og deres membraner er integreret i den apikale plasmamembran. Bar, 5 um.

Tabel 1. Materialer

Tabel 2. Instrumenter

Discussion

Hidtil subcellulære strukturer er blevet afbildet meste i in vitro (dvs. cellekulturer), eller i ex vivo (dvs. organisa-kulturer, vævssnit, acinare præparater) modelsystemer, ofte ikke rekapitulere karakteristika intakte levende væv ^6. I denne henseende den strategi, der fremlægges her, er et stort gennembrud, da det giver billeddannelse dynamikken i trin et bestemt membran trafficking (dvs. reguleret exocytose) i levende mus.

Denne protokol udgør en betydelig fremgang med henseender til andre procedurer, der er beregnet til in vivo billeddannelse af generalsekretærerne eller andre organer i kroppen hulrum ^10,11,13-15. Nogle af vores tidligere undersøgelser blev udført på rotter, der er mere modstandsdygtig over for kirurgiske procedurer, har større organer, og en reduceret hjertefrekvens i forhold til mus. Selv procedurerne i mus er sværere at sætte op, de giver flere advantages herunder muligheden for at anvende et bredere spektrum af sygdomsmodeller, transgene og knockout dyr. Desuden giver denne fremgangsmåde med succes minimeret bevægelsesartefakter, hvilket giver en bedre kontrol over det tryk påføres de udsatte organer og dermed reducere risikoen for: i) reduktion af blodgennemstrømningen, ii) beskadige vævet arkitektur, og iii) forringe normale funktion af orglet. Dette er et stort problem, som vi løst ved at fjerne den begrænsning, der genereres af indehaveren af orgel og indføre en stabilisator ^10,11.

En af de mest kritiske trin i denne protokol er at opretholde den rette temperatur i både dyr og i den udsatte organ. Faktisk anæstesi inducerer svær hypotermi og opretholde den rette kropstemperatur mindsker chancerne for død markant før afslutningen af ​​forsøget. Desuden udsatte orgel hurtigt udveksler varme med det eksterne miljø både under kirurgiske procedures og billeddannelse. Da den lokale reduktion af temperaturen alvorligt bremse kinetikken af ​​de eksocytiske trin, er det afgørende at forhindre den ved hjælp af varme lampe, målet varmelegeme, og ved at holde kirtel fugtig med enten gel eller varmt saltvand. Fuld presenning af mikroskopet med et klimakammer er også god løsning til styring af temperaturen. Et andet afgørende trin er at opnå en passende balance mellem stabilisering og opretholdelse af blodgennemstrømningen. Faktisk, i et præparat, der ikke er korrekt stabiliseret, er det meget vanskeligt at følge kinetikken af ​​de sekretoriske granuler, hvis størrelser er i mikrometer. På den anden side, reduktion af resultaterne blodforsyning i dannelsen af ​​store vakuoler eller en signifikant hæmning af regulerede exocytose. For at opnå denne balance er det vigtigt hele tiden at overvåge blodgennemstrømningen og kontrollere for tegn på cellulære skader, mens anvendelse af pres for at stabilisere orglet.

Selv om denne undersøgelse har vi valgt en transgen mus, der muliggør simultan fantasing de sekretoriske granuler og den apikale plasmamembran, kan her beskrevne procedurer udvides til at undersøge flere andre intracellulære processer. Dette kan opnås ved anvendelse af fluorescens-mærkede molekyler, som mærker specifikke cellulære strukturer og kan administreres enten systemisk eller direkte på SGS. Alternativt er der blevet udviklet nye transgene musemodeller, der udtrykker fluorescerende mærkede molekyler, såsom glucose transport GLUT4, F-actin markør LifeAct den nukleare markør histon 2B musen og autofagi markør LC3-GFP. Endelig kan den grundlæggende strategi, vi har udviklet til at immobilisere og image SGS ved høj opløsning potentielt udvides til andre organer (f.eks bugspytkirtel, lever, nyre og mælkekirtler) ved at indføre nogle ændringer i størrelse eller form af stabilisator.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)	Braintree Scientific	190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter	Hazard Technology	PDDT
Heat lamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight	World Precision Instruments	5003708-12
#7 curved tip tweezers	World Precision Instruments	14187
Microscissors	World Precision Instruments	503365
Black Braided Silk suture #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gauze sponges 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Lens cleaning tissue	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476