Summary
Intravital माइक्रोस्कोपी जीवित पशुओं में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं इमेजिंग सक्षम बनाता है एक शक्तिशाली उपकरण है. इस लेख में हम रहते हैं, चूहों की लार ग्रंथियों में ऐसी स्रावी granules जैसे subcellular संरचनाओं,, की गतिशीलता इमेजिंग के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
यहाँ हम confocal intravital माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर आधारित है कि लाइव कृन्तकों में छवि subcellular संरचनाओं के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. वे कई लाभ प्रदान के बाद से एक मॉडल के अंग के रूप में हम रहते हैं, चूहों की लार ग्रंथियों का उपयोग करें. पहला, वे आसानी से प्रकाशिकी के लिए पहुँच सक्षम उजागर करने के लिए, और दिल की धड़कन और श्वसन के कारण गति कलाकृतियों की कमी की सुविधा के लिए स्थिर किया जा सकता है. यह काफी इमेजिंग और छोटे subcellular संरचनाओं पर नज़र रखने की सुविधा. दूसरा, लार ग्रंथियों की सेल आबादी के सबसे अंग की सतह से सुलभ हैं. इस तरह के दो photon माइक्रोस्कोपी के रूप में vivo इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है कि अन्य तकनीकों की तुलना में एक उच्च स्थानिक संकल्प किया है कि confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग की अनुमति. अंत में, लार ग्रंथियों को आसानी से इस प्रकार एक आण्विक स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक मजबूत प्रणाली उपलब्ध कराने, औषधीय और आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ की जा सकती है.
इस अध्ययन में हम कोष्ठकी कोशिकाओं में स्रावी granules के एक्सोसाइटोसिस और स्रावी granules बीटा एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स की उत्तेजना पर फ्यूज जहां शिखर प्लाज्मा झिल्ली की गतिशीलता के कैनेटीक्स का पालन करने के लिए बनाया गया एक प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित. विशेष रूप से, हम साइटोसोलिक GFP और फ्लोरोसेंट प्रोटीन मिलकर-टमाटर के साथ जुड़े हुए एक झिल्ली लक्षित पेप्टाइड सह व्यक्त करता है कि एक ट्रांसजेनिक माउस का इस्तेमाल किया. हालांकि, हम लार ग्रंथियों को स्थिर करने और छवि के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं है कि अन्य माउस मॉडल के लिए बढ़ा दिया है और इस तरह endosomes, लाइसोसोम, mitochondria के रूप में विभिन्न subcellular संरचनाओं, के दृश्य को सक्षम करने, vivo सेलुलर घटकों लेबल करने के लिए अन्य तरीकों के लिए युग्मित, और किया जा सकता है actin cytoskeleton.
Introduction
पिछले दो दशकों में रहते माइक्रोस्कोपी के आगमन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग इस प्रकार कोशिका जीव विज्ञान 1 के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने, हर कल्पना सेलुलर प्रक्रिया पर बड़ी सफलताओं के लिए नेतृत्व किया. इस क्षेत्र में यह प्रायोगिक जोड़तोड़ की बात आती है, खासकर जब अत्यंत शक्तिशाली मॉडल प्रणाली, कर रहे हैं कि स्तनधारी सेल संस्कृतियों के उपयोग से काफी लाभ हुआ है. हालांकि, वे अक्सर जटिल बहुकोशिकीय जीव 2 के जीव विज्ञान का सही प्रतिनिधित्व नहीं प्रदान करते हैं. यह समस्या ऐसे तंत्रिका जीव विज्ञान, इम्यूनोलॉजी और ट्यूमर जीव विज्ञान के रूप में 3 क्षेत्रों में महत्वपूर्ण जैविक सवालों की जांच करने के लिए दरवाजा खोल दिया है कि intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) के विकास के द्वारा संबोधित किया जाना शुरू हो गया है. अब तक, IVM पर आधारित अध्ययन के अधिकांश subcellular डिब्बों की गतिशीलता के बारे में कोई जानकारी उपलब्ध कराने के बिना, ऊतकों और व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर प्रदर्शन किया गया है. हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला और अन्यरहते कृन्तकों 4-7, 13-15 और इन विवो में औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ की अनुमति में इमेजिंग subcellular संरचनाओं में सक्षम IVM तकनीक विकसित की है. यह दृष्टिकोण विवो में झिल्ली तस्करी का अध्ययन करने के लिए हमारे द्वारा इस्तेमाल किया, और अधिक विशेष रूप से endocytosis और एक्सोसाइटोसिस 6,7 विनियमित किया गया है.
हमारे प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली, उजागर स्थिर और anesthetized कृन्तकों के अवअधोहनुज लार ग्रंथियों (एसजीएस) इमेजिंग पर आधारित है. IVM के लिए एक मॉडल के अंग के रूप में एसजीएस के चुनाव ग्रंथियों एक मामूली सर्जरी प्रदर्शन से आसानी से सुलभ हैं कि इस तथ्य के कारण है, उनके शरीर क्रिया विज्ञान से समझौता किए बिना externalized, और दिल की धड़कन और श्वसन की वजह से गति कलाकृतियों को कम करने के लिए स्थिर हो सकता है. इसके अलावा, एसजीएस चुनिंदा लार वाहिनी 8,9 के माध्यम से वायरल या गैर वायरल या तो आधारित वैक्टर इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ की जा सकती है. अंत में, एसजीएस ध्रुवीकृत epith से बना बहि: स्त्रावी हैंacini और नलिकाओं, myoepithelial कोशिकाओं, और stromal कोशिकाओं की एक जटिल जनसंख्या जो फार्म elial कोशिकाओं,. इस कारण से, वे हमारे हाल के अध्ययनों से 10 में डाला, एक्सोसाइटोसिस, endocytosis, जीन वितरण, और actin cytoskeleton का अध्ययन, और इस तरह के सेल polarity, कोशिका विभाजन, सेल के रूप में कोशिका जीव विज्ञान के पहलुओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करने के लिए एक शानदार मॉडल हैं सेल जंक्शनों, और आयन चैनल.
इस पत्र में हम विस्तार में एक जीवित माउस के एसजीएस की उपकला में subcellular संकल्प को प्राप्त करने के लिए एक इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन. विशेष रूप से, हम कैसे विनियमित एक्सोसाइटोसिस दौरान एसजीएस के कोष्ठकी कोशिकाओं में छवि स्रावी granules को दिखाते हैं. पहले से दिखाया गया है, बीटा एड्रीनर्जिक रिसेप्टर की agonists के साथ उत्तेजना पर, स्रावी granules शिखर प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और धीरे - धीरे पतन, कोष्ठकी canaliculi 6 में उनकी सामग्री जारी है. हमारा लक्ष्य मीटर के साथ जांचकर्ताओं के लिए बुनियादी उपकरण प्रदान करने के लिए हैसर्जिकल प्रक्रियाओं और जानवर से निपटने में inimal अनुभव, वे सफलतापूर्वक एक subcellular संकल्प पर IVM प्रदर्शन कर सकते हैं. IVM में सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा जानवर की तैयारी है, यहां हम उनके कार्य समझौता किए बिना एसजीएस बेनकाब और स्थिर करने के लिए उपयोग किया जाता है कि बुनियादी सर्जिकल प्रक्रियाओं के वर्णन पर ध्यान केंद्रित. ऐसे प्रणालीगत फ्लोरोसेंट जांच का वितरण, ट्रांसजेनिक जानवरों के उपयोग, या दोनों के संयोजन के रूप subcellular संरचनाओं, कई रणनीतियों, लेबल करने के लिए प्रक्रियाओं के रूप में, कहीं 7,11 वर्णित किया गया है.
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Protocol
भाग 1: माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सेटअप की तैयारी
- कोई उलटा confocal खुर्दबीन IVM के लिए उपयुक्त होना चाहिए. इस अध्ययन में एक FluoView-1000 लेजर स्कैनिंग confocal इकाई से लैस एक ओलिंप IX81 उलटा माइक्रोस्कोप, इस्तेमाल किया गया था. श्रेष्ठ संभव संकल्प को प्राप्त करने के लिए, जैसे पानी विसर्जन UPLSAPO 60x/1.20 एनए, और तेल विसर्जन प्लान ए पी ओ 60x/1.42 एनए के रूप में उच्च एनए उद्देश्यों के उपयोग की सिफारिश की है. तेल विसर्जन उद्देश्यों को उच्च संग्रह क्षमता है और वे ऊतक और उद्देश्य के बीच एक coverslip के उपयोग की आवश्यकता है, हालांकि सतह से 15-20 मीटर के भीतर छवि क्षेत्रों के लिए प्रयोग किया जाता है, वे एक बेहतर इमेजिंग गुणवत्ता प्रदान करते हैं. इसके अतिरिक्त, तेल के उपयोग लंबे समय तक इमेजिंग सत्र के दौरान पानी के वाष्पीकरण के लिए चिंता का विषय समाप्त. तापमान और नमी बनाए रखने के लिए, माइक्रोस्कोप पूरी तरह से बंद किया जाना चाहिए और गर्म और humidified हवा के साथ आपूर्ति की. वैकल्पिक रूप से, जानवर, खुर्दबीन मंच, औरउद्देश्य अन्य साधनों से गरम किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, रासायनिक गर्मी पैड जानवर और मंच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विशेष रूप से डिजाइन उद्देश्य हीटर उद्देश्य (चित्रा 1 ए) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उद्देश्य हीटर प्रक्रिया शुरू करने से पहले 30 मिनट पर बंद किया जाना चाहिए. नोट: गर्मी पैड एक धुंध पैड और त्वचा के बीच में जगह गर्म पशु रखने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. त्वचा जलने के लिए निरीक्षण किया जा रहा है.
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध confocal सूक्ष्मदर्शी से ज्यादातर में मानक चरणों स्लाइड्स, पेट्री डिश, और विभिन्न आकारों की प्लेटें फिट करने के लिए उपयोग किया जाता है कि विभिन्न धारकों डालने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक खोलने की है. 35 मिमी पेट्री डिश के लिए IVM, एक मानक मंच सम्मिलित करने के क्रम में तो उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल या मास्किंग टेप (चित्रा 1 ए) के द्वारा सुरक्षित है जो एक 40 मिमी गिलास स्लाइड के साथ कवर किया, उल्टा उलटा है. एक कस्टम सम्मिलित भी 3 मिमी मोटी एल्यूमीनियम थाली से निर्मित किया जा सकता. कांच की सतह तो सीएल है70% इथेनॉल के साथ eaned और एक Kimwipe साथ swiped.
- एसजीएस स्थिरीकरण (स्टेबलाइजर) के लिए एक स्वनिर्धारित धारक निर्माण. धारक का उद्देश्य जगह में एसजीएस और मंच और coverslip उन्हें सख्ती से दंपती को स्थिर करने के लिए है. धारक एक 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश से बनाया जा सकता है. सबसे पहले, पकवान के नीचे दूर दीवारों से टूट गया है और लगभग 15 x 10 मिमी की आयतों में कट जाता है. फिर, किनारों ठीक sandpaper का उपयोग करके गोल और पॉलिश कर रहे हैं. चार spacers (1.5-2 मिमी) 1 मिलीलीटर सिरिंज plungers के रबर सुझावों को हटाने के द्वारा बनाया जाता है. ठीक sandpaper, spacers के सतह और प्लास्टिक के टुकड़े के चारों कोनों का उपयोग करके पॉलिश कर रहे हैं. spacers तो पतला superglue का उपयोग करके चिपके, और बाद में एक फ्लैट सतह पर ठीक sandpaper का उपयोग smoothed रहे हैं. बड़े जानवरों के लिए, धारकों का आकार और spacers थोड़ा बड़ा ग्रंथियों को समायोजित करने के लिए वृद्धि हुई किया जा सकता है कि, ध्यान दें.
- ऑप्टिकल युग्मन जेल की तैयारी. 0.3% Carbomer-940 (तालिका 2) जेल अति शुद्ध पानी की 100 मिलीलीटर वार्मिंग और डी Sorbitol की 5.47 ग्राम भंग द्वारा तैयार किया जाता है. फिर, Carbomer-940 के 0.3 ग्राम से जोड़ रहे हैं. बीकर कवर और एक भावप्रवण गर्म प्लेट (सबसे कम गर्मी की स्थापना) पर रखा कई घंटे के लिए या सभी carbomer clumps पूरी तरह से भंग कर रहे हैं जब तक की जानी चाहिए. के बारे में 7.4 पीएच तक पहुँच जाता है जब तक अन्त में, Trietanolamine, ड्रॉप वार धीरे भावप्रवण जबकि गयी है. जेल 4 डिग्री सेल्सियस 13 में संग्रहीत किया जाता है.
भाग 2: जानवर और संज्ञाहरण
- जानवरों के साथ किसी भी प्रयोगों का आयोजन करने से पहले, प्रोटोकॉल अपने स्थानीय पशु की देखभाल और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए. महत्वपूर्ण बात है, शोधकर्ताओं ठीक से शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने और प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले अपने स्थानीय पशु की देखभाल समिति या संस्था पशु चिकित्सक से परामर्श करना चाहिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए.
- इस अध्ययन में, एक माउस मॉडल (GFP / mTomato माउस) घुलनशील GFP (GFP माउस) वाई व्यक्त FVB चूहों को पार करके निकाली गईफ्लोरोसेंट प्रोटीन मिलकर-टमाटर (mTomato माउस) 6 के साथ जुड़े हुए एक झिल्ली लक्षित पेप्टाइड व्यक्त वें C57B6 चूहों का इस्तेमाल किया गया था. नोट: यह आमतौर पर पूरी तरह से anesthetized और इमेजिंग के लिए तैयार हो जाते हैं पशु के लिए 20-30 मिनट ले
- चूहे जानवरों की सुविधा में एक नियंत्रित वातावरण में रखे जाते हैं और प्रयोग करने से पहले एक सप्ताह के लिए acclimate करने की अनुमति है. यह कदम बढ़ाया स्रावी गतिविधि 12 में किसी भी संकट के परिणाम के बाद एसजीएस इमेजिंग के लिए आवश्यक है. पानी और भोजन यथेच्छ प्रदान की जाती हैं. 2 -5 महीने पुरानी से पुरुषों इमेजिंग प्रयोगों (20-30 ग्राम) के लिए उपयोग किया जाता है.
- पिछले संज्ञाहरण के लिए, संवेदनाहारी की उचित खुराक निर्धारित करने के लिए पशुओं को तौलना.
- इंजेक्शन anesthetics के प्रशासन द्वारा प्रेरित तनाव एसजीएस के स्रावी गतिविधि क्षीण हो सकता है के बाद से, निश्चेतक का इंजेक्शन द्वारा पीछा किया, isoflurane साँस लेना द्वारा पूर्व संज्ञाहरण प्रेरित. इस उद्देश्य के लिए, बहुत धीरे vaporizer चेंबर में चूहों जगह है, औरऑक्सीजन का प्रवाह (800-900 एमएमएचजी) पर बारी. पूर्व संज्ञाहरण प्रेरण शुरू करने के लिए 3% isoflurane के स्तर सेट करें.
- जानवरों के बेहोश होते ही, peritoneal गुहा (25 ग्राम सुई) में एक 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine के मिश्रण और 20 मिलीग्राम / किलो xylazine इंजेक्षन. Anesthetics हौसले खारा में 20 मिलीग्राम / एमएल के लिए 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine गिराए और फिर ketamine के साथ मिश्रण से तैयार किया जाता है. इस मिश्रण को आगे खारा के साथ 1:1 पतला है और एक उचित मात्रा में पशु वजन के आधार पर इंजेक्ट किया जाता है. यह कमजोर पड़ने आकस्मिक ज्यादा को रोकने में मदद करता है. मिश्रण 20 मिनट के बाद उसकी प्रभावशीलता खो देता है ध्यान दें.
- जागरण के लक्षण के लिए जानवरों को देखें और वे (उसके बाद हर घंटे पहले इंजेक्शन के बाद 45 मिनट के भीतर प्रारंभिक खुराक का लगभग 75%, और 50%) संज्ञाहरण से बाहर आ रहे हैं, तो अधिक संवेदनाहारी मिश्रण इंजेक्षन. पंजा बन्द रखो और प्रतिक्रिया देख कर हर 15 मिनट संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें. नोट: हमेशा रोकने के लिए नेत्र मरहम प्रशासनआंख सूखापन.
- Anesthetics प्रयोगों के reproducibility और पशुओं के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता है, जो हाइपोथर्मिया प्रेरित. इसलिए, चूहों गर्मी दीपक के नीचे या प्रयोग की पूरी अवधि के लिए एक गर्म पैड पर रखा जाना चाहिए. नोट: गर्मी दीपक जल को रोकने के लिए पशु से कम से कम 12-18 इंच होना चाहिए
- पशुओं के शरीर का तापमान एक गुदा तापमान जांच से लैस एक थर्मामीटर के साथ निरीक्षण किया जा रहा है.
भाग 3: intravital माइक्रोस्कोपी के लिए पशु सर्जरी और पोजिशनिंग
- स्वच्छ और बाँझ होना चाहिए कि सभी सर्जिकल उपकरणों (तालिका 1) के साथ कार्यक्षेत्र तैयार करें.
- एक बिजली क्लिपर के साथ माउस की गर्दन क्षेत्र दाढ़ी. 70% इथेनॉल में भिगो धुंध स्पंज के साथ anesthetized माउस की गर्दन क्षेत्र के उदर पक्ष नीचे साफ कर लें. एक Kimwipe के साथ अतिरिक्त सूखी.
- सुस्त घुमावदार चिमटी midline (अनुमानित में त्वचा का एक छोटा सा टुकड़ा उठा के साथmately masseter मांसपेशियों के निचले अंत में), और एक छोटा सा चीरा (चित्रा 1 बी) बनाते हैं.
- उद्घाटन में कैंची डालें और कैंची ब्लेड खोलने से दूर अंतर्निहित ऊतक से त्वचा को अलग. त्वचा के नीचे की ओर कैंची ऊपर की ओर इशारा करते द्वारा अंतर्निहित ग्रंथियों के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचें. त्वचा गहरे ऊतकों (चित्रा 1 बी) से अलग किया जाता है जब तक यह कदम कई बार दोहराएँ.
- कैंची का प्रयोग, के बारे में 3 मिमी चौड़े ढीला त्वचा और लंबे समय 10 मिमी की एक पट्टी में कटौती. उद्घाटन तंत्रिका, नाला और रक्त वाहिकाओं के शरीर के आराम करने के लिए ग्रंथि कनेक्ट जहां एसजीएस के आधार के पास शुरू होता है, ताकि त्वचा में कटौती की जानी चाहिए. घाव क्षेत्र की सफाई के बाद, परिणामी उद्घाटन अंडाकार हो और मोटे तौर पर 8 x 12 मिमी उपाय करेंगे. दोनों एसजीएस खोलने (चित्रा 1 बी) के बाद दिखाई देगा.
- एक सिरिंज के साथ कटौती के बीच में ऑप्टिकल युग्मन जेल लागू करते हैं और दिशा में यह पोंछबाँझ धुंध के साथ बाहर. प्रत्येक उजागर ऊतक में बाल या रक्त की शुरूआत को रोकने के लिए मिटा के लिए धुंध के स्वच्छ टुकड़ों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. सभी रक्त और खुले बाल हटा दिया जाता है जब तक इस चरण को दोहराएँ.
- # 7 चिमटी का प्रयोग, दूर सही अवअधोहनुज ग्रंथि से संयोजी ऊतक (वैकल्पिक रूप से इस प्रोटोकॉल छोड़ दिया एसजीएस पर इस्तेमाल किया जा सकता है) ग्रंथि के आधार करने के लिए सभी तरह से अलग. सबसे पहले, एसजी की नोक पाते हैं और कुछ मिलीमीटर ग्रंथि की नोक ऊपर संयोजी ऊतक हड़पने. पैरेन्काइमा घायल हुए बिना ग्रंथि के आसपास संयोजी ऊतक आंसू. (चित्रा 1 बी). ग्रंथि उजागर होने के बाद, धीरे ग्रंथि से संयोजी ऊतक अलग. खून बह रहा होता है, तो नमक के साथ खून को धो. सभी संयोजी ऊतक अलग हो रहे हैं और ग्रंथि पूरी तरह से सामने आ रहा है कि सुनिश्चित करें. नियमित रूप से ऑप्टिकल युग्मन जेल लगाने से नम ग्रंथि रखें.
- पिछले माइक्रोस्कोप के लिए पशु को लाने के लिए, धुंध की मोटी टुकड़ा और hea जगहटी 38 ± 2 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने की खुर्दबीन मंच पर पैक रासायनिक गर्मी पैक का तापमान वातावरण के भीतर थैली बेनकाब कि कटौती के आकार के द्वारा समायोजित किया जा सकता है. धुंध धातु चरण से गर्मी पैक की कुछ इन्सुलेशन प्रदान करता है. साथ ही धुंध का एक पतला टुकड़ा के साथ गर्मी पैक के ऊपर कवर.
- अपने पक्ष (सही ग्रंथि के लिए दाएं) पर और धुंध पर पशु रखें. Coverslip (चित्रा 1C) के बीच में रखा अवअधोहनुज लार ग्रंथि के साथ पशु रखें.
- पशु ग्रंथि immobilizing से पहले सुरक्षित हैं और इस स्थिति में स्थिर हो जाना चाहिए. माउस के सामने सही पंजा के उदर पक्ष पर मास्किंग टेप का एक टुकड़ा रखें. एक रेशम सीवन (चित्रा 1C, इनसेट) द्वारा माउस के कृन्तक मिला. रेशम के धागे और पंजा के बीच कुछ तनाव पैदा और टेप मास्किंग द्वारा मंच पर उन्हें देते हैं. एसजी के बीच में स्वाभाविक रूप से आराम करना चाहिएcoverslip. सिर और छाती अतिरिक्त चरण के लिए युग्मित किया जा सकता है कि प्लास्टिक wedges द्वारा स्थिर हो जाना चाहिए.
- ग्रंथि (चित्रा 1C) से अधिक ऊतक सफाई लेंस का एक छोटा सा टुकड़ा रखें. थोड़ा ग्रंथि का विस्तार और ग्रंथि पर एक अनुकूलित धारक जगह है. मास्किंग टेप के साथ मंच को कसकर जोड़ी स्टेबलाइजर. युग्मन चरण (चित्रा 1C) से जुड़े एक धातु क्लैंप से सुधार किया जा सकता है. वे रक्त के प्रवाह को समझौता हो सकता है के रूप में तनाव और तेज कोण से बचा जाना चाहिए. स्थिरीकरण (यह गुलाबी रंग बनाए रखने चाहिए) नेत्रहीन ग्रंथि का परीक्षण करके या epifluorescence द्वारा या तो रक्त के प्रवाह का निरीक्षण के तुरंत बाद. रक्त वाहिकाओं और रक्त कोशिकाओं के कई दोनों एम टमाटर के साथ चिह्नित कर रहे हैं के बाद से GFP / एम टमाटर माउस में रक्त के प्रवाह के सकल परिवर्तन आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता.
- धुंध और एक गर्म पैड के साथ जानवरों को कवर किया. W सुसज्जित एक थर्मामीटर का उपयोग करके उजागर ग्रंथि के तापमान को मापनेith उजागर ग्रंथि का एक पक्ष के साथ संपर्क में रखा एक छोटा सा लचीला thermocouple जांच.
भाग 4: इमेजिंग पैरामीटर
- GFP या आरएफपी फिल्टर सेट का उपयोग कर या तो द्वारा ग्रंथि की सतह पर epifluorescence रोशनी ध्यान केंद्रित का उपयोग करना. एसजी की सतह का पता लगाएं, और capillaries में रक्त प्रवाह और ऊतक के समग्र आकारिकी का आकलन करें. ऊतक क्षति के लक्षण झिल्ली blebbing या बड़े vacuoles की उपस्थिति में शामिल हैं.
- या तो epifluorescence के माध्यम से या चयनित क्षेत्र के पूर्व स्कैनिंग द्वारा ऊतक की स्थिरता का आकलन करें. गति कलाकृतियों के सबसे बाद के प्रसंस्करण डेटा विश्लेषण में हटा या के लिए सही नहीं किया जा सकता है के बाद से एक स्थिर तैयारी, आवश्यक है. तैयारी स्थिर नहीं है, तो समायोजन आवश्यक हैं.
- उचित फोकल हवाई जहाज़ छवि पूर्व स्कैनिंग मोड (1x ज़ूम) में ग्रंथियों लगता है, और धीरे - धीरे कोष्ठकी संरचनाओं, स्रावी granules और पी जब तक coverslip की ओर उद्देश्य करने के लिए कदमlasma झिल्ली (चित्रा 2) स्पष्ट रूप से दिखाई देने लगते हैं.
- समय चूक के लिए इमेजिंग मापदंडों व्यक्तिगत प्रयोग पर निर्भर करते हैं. छवि के लिए स्रावी granules की गतिशीलता 0.5-2 सेकंड / फ्रेम के स्कैन गति का उपयोग करें, और एक 0.2 माइक्रोन / पिक्सेल स्थानिक स्तर (लगभग 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन के मद्देनजर क्षेत्र) के साथ 256 x 256 पिक्सल. बेहतर granules और प्लाज्मा झिल्ली कल्पना करने के लिए, ऑप्टिकल मोटाई 0.9-1.2 माइक्रोन के बीच स्थापित किया जाना चाहिए. GFP और मिलकर-टमाटर उत्तेजित करने के लिए, एक क्रमश: 488 एनएम और 561 एनएम के तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर सकते हैं. सत्ता शिखर 488 एनएम और 561 एनएम के लिए 1 मेगावाट के आसपास के लिए 0.5 मेगावाट निर्धारित है. यह कम से कम photobleaching सुनिश्चित करता है.
- डिटेक्टर सेटिंग्स गतिशील सीमा के भीतर संकेत बनाए रखने और नमूना की चमक पर निर्भर करने के लिए समायोजित किया जाना है.
- सभी मापदंडों सेट कर रहे हैं एक बार, इमेजिंग शुरू किया जा सकता है. सबसे पहले, एक संदर्भ बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा देखने के क्षेत्र का एक स्नैपशॉट ले. जबसमय चूक इमेजिंग, XY और जेड में ऊतक की बहती हो सकती है. यह मैन्युअल क्षेत्र स्कैन और Z स्थिति का समायोजन करके मुआवजा दिया जा सकता है. समायोजन धीरे - धीरे और छोटे वेतन वृद्धि से कलाकृतियों से बचने के लिए किया जाना चाहिए. इसके अलावा, संदर्भ छवि photobleaching तब होता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण photobleaching (प्रतिदीप्ति में अधिक से अधिक 15-20% की कमी) का पता चला है, 0.1 मेगावाट से लेजर शक्ति को कम.
- खारा में isoproterenol का एक नया तैयार समाधान की सुई subcutaneously 0.1 मिलीग्राम / किग्रा, एक्सोसाइटोसिस को प्रोत्साहित करने के लिए. एक्सोसाइटोसिस इंजेक्शन के बाद लगभग 1 मिनट शुरू हो रहा है. प्लाज्मा झिल्ली के साथ fusing स्रावी granules कणिकाओं के आसपास GFP प्रतिदीप्ति की वृद्धि हुई है और उनके सीमित झिल्ली में मिलकर-टमाटर पेप्टाइड्स के प्रसार (चित्रा 3) द्वारा पता लगाया जाएगा. हम एक ही क्षेत्र में 3-4 समय चूक दृश्यों, 10 मिनट प्रत्येक प्राप्त करने की सलाह देते हैं.
- इमेजिंग सत्र के बाद, ane euthanizeएक इच्छामृत्यु कक्ष में सीओ 2 साँस लेना (10 मिनट के लिए 10-12 एमएमएचजी) द्वारा पशु sthetized.
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Representative Results
GFP / mTomato माउस में, acini साइटोसोलिक GFP और झिल्ली लक्षित मिलकर-टमाटर पेप्टाइड (चित्रा 2, टूटी लाइन) व्यक्त रूप में जो स्पष्ट रूप से अलग संरचनाओं, दिखाई देते हैं. व्यक्तिगत acini में, कोष्ठकी कोशिकाओं मिलकर-टमाटर पेप्टाइड द्वारा चित्रित कर रहे हैं. GFP भी स्पष्ट रूप से (चित्रा 2, तीर) कोष्ठकी कोशिकाओं के अंदर दिखाई दे रहे हैं कि नाभिक में पता चला है. साइटोसोलिक GFP व्यास में लगभग 1-1.5 माइक्रोन के रूप में अंधेरे परिपत्र पुटिका (चित्रा 2, इनसेट, तीर) दिखाई देते हैं स्रावी granules से बाहर रखा गया है. Exocytic घटनाओं कल्पना, हम (3, तारांकन चित्रा) स्रावी granules में समृद्ध है कि प्लाज्मा झिल्ली के एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित. 0.1 मिलीग्राम / किग्रा isoproterenol के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद, हम प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 3, हरी तीर) के करीब निकटता में हैं कि स्रावी granules के कुछ चारों ओर GFP प्रतिदीप्ति के स्तर में वृद्धि का पालन. पी के रूप मेंreviously, दिखाया इन कणिकाओं प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े हुए हैं और cytoplasmic GFP 6 बरकरार रखती है कि एक मोटी actin meshwork भर्ती. इसके अलावा, प्लाज्मा झिल्ली के साथ विलय के बाद, मिलकर-टमाटर पेप्टाइड स्रावी granules (चित्रा 3, लाल तीर) के सीमित झिल्ली में diffuses. 30-40 सेकंड के बाद स्रावी granules धीरे - धीरे पतन और उनके सीमित झिल्ली शिखर प्लाज्मा झिल्ली में एकीकृत कर रहे हैं.
चित्रा 1. माइक्रोस्कोप, सर्जिकल प्रक्रियाओं, और पशु स्थिति की स्थापना की. ए 35 मिमी पेट्री डिश पकड़ बनाया एक मंच सम्मिलित एक 40 मिमी coverslip के साथ कवर किया जाता है. सम्मिलित गर्म पैड (नारंगी ovals) और एक गर्म दीपक के साथ पूर्व गर्म है कि खुर्दबीन मंच में रखा गया है. उद्देश्य पूर्व है . लार ग्रंथियों को बेनकाब करने के लिए बी सर्जिकल प्रक्रियाओं: एक उद्देश्य हीटर (38 डिग्री सेल्सियस तापमान सेट) के साथ गरम. साफ कैंची का प्रयोग, एक चीरा गर्दन क्षेत्र के ऊपर त्वचा में किया जाता है. कैंची अंतर्निहित ऊतक से त्वचा को अलग करने के लिए खोलने में डाला जाता है. त्वचा तो निकाल दिया जाता है, और संयोजी ऊतक धीरे चिमटी का उपयोग ग्रंथियों में से एक से खुली है. सी. पशु पूर्व गर्म मंच पर अपने पक्ष पर रखा गया है और ग्रंथि धीरे खींच लिया और coverslip के बीच में रख दिया गया है . कृन्तक रेशम धागा (इनसेट) के साथ मंच के शौकीन रहे हैं. लेंस सफाई ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा ग्रंथि और अंग धारक के बीच sandwiched है. अंग धारक तो मास्किंग टेप (हरा) के साथ मंच पर सुरक्षित है कि एक क्लैंप के साथ स्थिर है.
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चित्रा 2. एक लाइव GFP / mTomato माउस की लार ग्रंथियों की एक इमेजिंग क्षेत्र के प्रतिनिधि छवि. Acini अच्छी तरह GFP चैनल (हरा टूटी हुई लाइन) में डाला जाता है. एकल कक्षों प्लाज्मा झिल्ली (लाल टूटी लाइन) पर स्थानीय है कि TD-टमाटर पेप्टाइड द्वारा चित्रित कर रहे हैं. GFP cytoplasm और नाभिक (तीर) में स्थानीयकृत, लेकिन स्रावी granules (इनसेट, तीर) से बाहर रखा गया है. बार, 10 माइक्रोन.
Isoproterenol की 0.1 मिलीग्राम / किग्रा के इंजेक्शन पर स्रावी granules के एक्सोसाइटोसिस दिखा चित्रा 3. प्रतिनिधि समय अनुक्रम. स्रावी granules प्लाज्मा झिल्ली (तारांकन) के करीब imaged थे. प्लाज्मा झिल्ली, स्रावी दाना चारों ओर GFP के स्तर के साथ विलय के बादएस काफी (हरी तीर) में वृद्धि, और TD-टमाटर पेप्टाइड उनके सीमित झिल्ली (लाल तीर) में diffuses. स्रावी granules धीरे धीरे पतन और उनके झिल्ली शिखर प्लाज्मा झिल्ली में एकीकृत कर रहे हैं. बार, 5 माइक्रोन.
तालिका 1. सामग्री
तालिका 2. उपकरण
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Discussion
अब तक subcellular संरचनाओं ज्यादातर इन विट्रो (यानी सेल संस्कृतियों) में या अक्सर बरकरार रहते ऊतकों 6 की विशेषताओं पुनरावृत्ति नहीं है कि पूर्व vivo (यानी अंग संस्कृतियों, ऊतक स्लाइस, कोष्ठकी तैयारी) मॉडल प्रणाली में imaged किया गया है. यह चूहों में रहने वाले एक विशिष्ट झिल्ली तस्करी कदम (यानी विनियमित एक्सोसाइटोसिस) की गतिशीलता को सक्षम बनाता है इमेजिंग के बाद से इस संबंध में, यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण एक बड़ी सफलता का प्रतिनिधित्व करता है.
इस प्रोटोकॉल शरीर गुहा 10,11,13-15 में एसजीएस या अन्य अंगों के vivo इमेजिंग के लिए डिजाइन अन्य प्रक्रियाओं के लिए सम्मान के साथ एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है. हमारे पिछले अध्ययनों में से कुछ, सर्जिकल प्रक्रियाओं को और अधिक लचीला कर रहे हैं बड़ा अंग है कि चूहों में प्रदर्शन किया, और चूहों की तुलना में जब एक कम दिल दर थे. चूहों में प्रक्रियाओं की स्थापना के लिए कठिन हैं, हालांकि, वे कई उन्नत स्तर प्रदानरोग मॉडल, ट्रांसजेनिक और पीटा जानवरों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का उपयोग करने की संभावना सहित ntages. ) मैं रक्त प्रवाह को कम करने, द्वितीय) ऊतक वास्तुकला को नुकसान पहुँचाए, और iii) सामान्य समारोह आई. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण सफलतापूर्वक उजागर अंगों इस प्रकार के जोखिम को कम करने पर लागू दबाव पर बेहतर नियंत्रण प्रदान करने, गति कलाकृतियों को कम से कम अंग की. यह हम अंग धारक द्वारा उत्पन्न बाधा को नष्ट करने और एक स्थिरता 10,11 शुरू करने से हल किया कि एक प्रमुख चिंता का विषय है.
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक जानवर में और उजागर अंग में दोनों उचित तापमान बनाए रखने के लिए है. दरअसल, संज्ञाहरण गंभीर हाइपोथर्मिया लाती है और उचित शरीर का तापमान बनाए रखने में काफी प्रयोग के पूरा होने से पहले मृत्यु की संभावना को कम कर देता है. इसके अलावा, उजागर अंग तेजी से शल्य proc दोनों के दौरान बाहरी वातावरण के साथ गर्मी एक्सचेंजोंedures और इमेजिंग. तापमान के स्थानीय कमी गंभीर रूप से exocytic कदम के कैनेटीक्स को धीमा के बाद से, यह गर्मी दीपक, उद्देश्य हीटर, और युग्मन जेल या गर्म खारा के साथ या तो नम ग्रंथि रखकर उपयोग करके इसे रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. एक पर्यावरण कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप का पूर्ण बाड़े में भी तापमान को नियंत्रित करने के लिए अच्छा उपाय है. एक और महत्वपूर्ण कदम स्थिरीकरण और रक्त प्रवाह के रखरखाव के बीच उचित संतुलन हासिल करने की है. दरअसल, ठीक से स्थिर नहीं है कि एक तैयारी में, यह जिसका आकार माइक्रोन रेंज में हैं स्रावी granules के कैनेटीक्स का पालन करने के लिए बहुत मुश्किल है. दूसरी ओर, बड़े vacuoles या विनियमित एक्सोसाइटोसिस का एक महत्वपूर्ण निषेध के गठन में रक्त की आपूर्ति के परिणाम की कमी. इस संतुलन को प्राप्त करने के लिए यह लगातार रक्त प्रवाह की निगरानी और अंग स्थिर करने के लिए दबाव लागू करने, जबकि सेलुलर क्षति के लक्षण के लिए जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है.
इस अध्ययन के लिए हम एक साथ imagi सक्षम बनाता है एक ट्रांसजेनिक माउस का चयन किया है हालांकिस्रावी granules और शिखर प्लाज्मा झिल्ली की एनजी, यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं कई अन्य intracellular प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. इस विशिष्ट सेलुलर संरचनाओं लेबल और एसजीएस पर या तो प्रणालीबद्ध या सीधे प्रशासित किया जा सकता है कि fluorescently टैग किया अणुओं का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, fluorescently टैग किया अणुओं व्यक्त नई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल ग्लूकोज परिवहन GLUT4, एफ actin मार्कर LifeAct, परमाणु मार्कर histone 2 बी माउस, और भोजी मार्कर LC3-GFP के रूप में विकसित किया गया है. अंत में, हम उच्च संकल्प पर एसजीएस स्थिर करना और छवि के लिए विकसित किया है बुनियादी रणनीति संभवतः अन्य अंगों में (जैसे अग्न्याशय, जिगर, गुर्दे, और स्तन ग्रंथियों) आकार में कुछ संशोधन शुरू करने से या स्थिरता प्राप्त करने का आकार बढ़ाया जा सकता है.
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Acknowledgments
इस शोध एनआईएच के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम, दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2" x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 | |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., et al. Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. Najman, S. , Intech. (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
